食品中微生物的檢驗(yàn)方法

1、食品中微生物的檢驗(yàn)一、概念和分類微生物并不是生物學(xué)分類學(xué)上的專門(mén)名詞，而是對(duì)所有形體微小，單細(xì)胞的或個(gè)體結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單的多細(xì)胞的、甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物的統(tǒng)稱。微生物群體非常龐雜，種類繁多，包括細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類。凡具有細(xì)胞形態(tài)的微生物稱為細(xì)胞型微生物。細(xì)胞型微生物按細(xì)胞結(jié)構(gòu)又分為原核微生物和真核微生物。 原核生物的主要特點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)有明顯的核區(qū)，但沒(méi)有核膜包圍；核區(qū)內(nèi)含有一條雙鏈DNA構(gòu)成的染色體；能量代謝和很多合成代謝均在質(zhì)膜上進(jìn)行，核糖體分布在細(xì)胞之中；相對(duì)于原核微生物，真核微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有了真正的細(xì)胞核,有多種細(xì)胞器；而病毒則不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)組成，可以認(rèn)為是超顯微的、

2、沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的、專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的實(shí)體。它們?cè)诨罴?xì)胞外具有一般化學(xué)大分子的特征，在宿主細(xì)胞內(nèi)又具有生命特征?？梢宰鳛榱私獾氖牵《究梢酝ㄟ^(guò)細(xì)菌濾器，且對(duì)抗生素不敏感，對(duì)干擾素敏感。二、細(xì)菌、霉菌、酵母菌和致病菌介紹細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)在原核生物中具有代表性，主要由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)體等部分構(gòu)成,有的細(xì)菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結(jié)構(gòu)。在自然界中細(xì)菌是分布最廣、數(shù)量最多的一類生物，并與食品關(guān)系最為密切。是食品理論、工業(yè)發(fā)酵和釀造研究的主要對(duì)象，也是導(dǎo)致食品腐敗的主要類群。細(xì)菌的基本形態(tài)有球狀、桿狀和螺旋狀,分別被稱為球菌、桿菌和螺旋菌。霉菌是一些絲狀真菌的統(tǒng)稱。在自然界分布極廣，它的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源

3、主要是糖類和少量氮、礦物鹽等，極易在含糖的食品、餅干、面包和各種谷物、水果上生長(zhǎng)。經(jīng)常會(huì)有食品會(huì)因?yàn)榘l(fā)生霉變而不能食用，還有些霉菌會(huì)產(chǎn)生毒性很大的毒素，比如黃曲霉素、黃米毒素、雜色曲霉素和展青霉素等等，都可能導(dǎo)致癌癥，這類霉菌在大米和花生中最多。由此，對(duì)霉菌的檢測(cè)尤為重要。霉菌菌體是由分支或不分支的菌絲組成，菌絲細(xì)胞均由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體、核糖體以及內(nèi)含物組成。在固體培養(yǎng)基上，部分菌絲深入培養(yǎng)基內(nèi)吸收養(yǎng)料，稱為營(yíng)養(yǎng)菌絲；另一部分則向空氣生長(zhǎng)，稱為氣生菌絲；有的氣生菌絲發(fā)育到一定階段分化為繁殖菌絲。霉菌的菌落一般比細(xì)菌菌落大幾倍到幾十倍，同一種霉菌，在不同成分的培養(yǎng)基上形成的

4、菌落特征可能有變化，但各種霉菌，在一定的培養(yǎng)基上形成的菌落大小、形狀、顏色等卻相對(duì)穩(wěn)定。菌落特征也是鑒定霉菌的重要依據(jù)之一。酵母菌多數(shù)為單細(xì)胞，一般呈圓形、橢圓形、圓柱形或檸檬形，也有些酵母菌細(xì)胞與其子代細(xì)胞連在一起成為鏈狀，形成假菌絲，稱為假絲酵母。酵母菌在適宜的培養(yǎng)基上形成的菌落與細(xì)菌相似，但比細(xì)菌菌落大而且厚，菌落表面濕潤(rùn)、粘稠、易被調(diào)起，有些種因培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)使菌落表面皺縮。三、培養(yǎng)基（北京陸橋）1、微生物的營(yíng)養(yǎng)微生物同其他生物一樣，需要不斷地從外部環(huán)境中獲取營(yíng)養(yǎng)，才能夠維持生命。微生物細(xì)胞主要有水、有機(jī)物和無(wú)機(jī)鹽等化學(xué)成份組成，不同的微生物種類其細(xì)胞的化學(xué)組成也不相同，而且含量也有差異

5、。因此，維持微生物生長(zhǎng)所需要的化學(xué)元素的種類與含量也不相同。一般來(lái)說(shuō)細(xì)胞含有某種元素的量高則細(xì)胞對(duì)這種元素的需要量也就大，含量低則需要量也小。這也是為什么我們不同的微生物培養(yǎng)要選擇不同的培養(yǎng)基。另外，同一種微生物在不同的培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)也有差別，所以在選擇培養(yǎng)基是要注意。微生物所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)按照它們?cè)跈C(jī)體中的生理作用不同，可以分為碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子四種類型。能被微生物用來(lái)構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的或代謝產(chǎn)物中碳（氮）素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱為碳（氮）原物質(zhì)；無(wú)機(jī)鹽為微生物機(jī)體提供金屬元素；有些微生物在含有氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基上人不能生長(zhǎng)，而需要添加某些生長(zhǎng)因子，滿足生長(zhǎng)的需要，比如維生素、氨

6、基酸、嘌呤堿基等。我們經(jīng)常用到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：?jiǎn)翁恰⒌矸鄣龋ㄌ荚矗?；尿素、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏等（氮源）；硫酸鋅等（無(wú)機(jī)鹽）。2、培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基是人工配制的合適于不同微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)。配制培養(yǎng)基需要遵循一定的原則：第一，根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基；自養(yǎng)型微生物合成能力強(qiáng)，可以利用簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物質(zhì)合成復(fù)雜的細(xì)胞物質(zhì)，其培養(yǎng)基可以由簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物質(zhì)組成。而異樣型微生物合成能力差，不能以無(wú)機(jī)物質(zhì)作為唯一營(yíng)養(yǎng)源，就要在培養(yǎng)基中添加一些有機(jī)物質(zhì)（比如葡萄糖等）。另外細(xì)菌和酵母菌對(duì)培養(yǎng)基的要求也不同，細(xì)菌一般用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，而酵母菌則用麥芽汁

7、培養(yǎng)基培養(yǎng)。第二，注意各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比；微生物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物往往是在濃度合適的條件下才表現(xiàn)出良好的作用，濃度大時(shí)反而對(duì)微生物生長(zhǎng)期抑制作用。微生物只有在適合生長(zhǎng)的條件下，才表現(xiàn)出應(yīng)有的形態(tài)特征，而不適合的條件下生長(zhǎng)，會(huì)是微生物的形態(tài)特征發(fā)生改變。第三，將培養(yǎng)基的pH控制在一定的范圍之內(nèi)，滿足不同類型微生物的生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物。各種微生物生長(zhǎng)的最適pH各不相同，一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌生長(zhǎng)的pH在中性和微堿性之間（pH在7-7.5），酵母菌和霉菌生長(zhǎng)的pH值通常是偏酸的（pH在4.5-6）。另外由于微生物在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值，如

8、果不及時(shí)控制，往往會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)停止。因此，為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽。3、培養(yǎng)基的類型及應(yīng)用培養(yǎng)基的種類很多，按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基；根據(jù)物理狀態(tài)不同分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基（常用凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠，硅膠是由無(wú)幾的硅酸鈉和硅酸鉀被鹽酸及硫酸中和時(shí)凝聚而成的膠體，不含有機(jī)物，因而適合于用來(lái)分離和培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物）；根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途，可將培養(yǎng)基分成基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等?；A(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；加

9、富培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基上加入其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，用以培養(yǎng)某種或某類營(yíng)養(yǎng)要求苛刻的一樣微生物；選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某種或某一類微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化合物的敏感性不同而設(shè)計(jì)出來(lái)的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來(lái)。比如，我們?cè)谂囵B(yǎng)基中加入青霉素或者四環(huán)素等抗生素（生長(zhǎng)抑制劑，抑制細(xì)菌和放線菌生長(zhǎng)），可以分離酵母菌和霉菌；通過(guò)在培養(yǎng)基中加入結(jié)晶紫或提高培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度（7.5%），可以從混雜的微生物群體中分別分離出革蘭氏陰性菌或葡萄球菌；加孔雀石綠可以分離出革蘭氏陽(yáng)性菌。鑒別培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基內(nèi)加入某種試劑或化學(xué)藥品，使得某種微生物在這個(gè)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后，

10、可以產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特定試劑或化學(xué)藥品起反應(yīng)，產(chǎn)生某種明顯的特征性變化。根據(jù)這種特點(diǎn)來(lái)區(qū)分微生物。比如：大腸菌群測(cè)定中，液體培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫和發(fā)酵管，來(lái)指示微生物生長(zhǎng)過(guò)程中是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基是一種鑒別培養(yǎng)基，常用于檢查乳制品和飲用水中是否含有致病性的腸道細(xì)菌，伊紅為酸性染料，美藍(lán)則為堿性染料。當(dāng)大腸桿菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生混合酸時(shí)，與伊紅染色，再與美藍(lán)結(jié)合生成紫黑色化合物。在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸桿菌形成呈紫黑色帶金屬光澤的小菌落。而產(chǎn)氣桿菌則形成呈棕色的大菌落。不能發(fā)酵乳糖的細(xì)菌產(chǎn)堿性物較多，帶負(fù)電荷，與美藍(lán)結(jié)合，被染成藍(lán)色菌落。還可以加入明膠，看液化明膠的

11、情況。四、微生物檢驗(yàn)食品中的微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目主要有四個(gè)：菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌、致病菌。其中致病菌又主要包括沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌。首先，我們看一下菌落總數(shù)的測(cè)定。我們先弄清楚幾個(gè)概念什么是菌落、菌落總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)？我們都知道單個(gè)細(xì)菌用肉眼是看不見(jiàn)的，但是，當(dāng)單個(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，便會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，這就是菌落。而菌落總數(shù)就是指食品經(jīng)過(guò)檢樣處理，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1mL（g）檢樣中所含菌落的總數(shù)。更確切地說(shuō)即在需氧情況下，36±1培養(yǎng)48h，能在普通營(yíng)養(yǎng)

12、瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長(zhǎng)。因此菌落總數(shù)并不表示實(shí)際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時(shí)被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等?？梢?jiàn)把菌落總數(shù)就等同于細(xì)菌總數(shù)是不確切的。我們可以看看長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上最常見(jiàn)的菌落形態(tài)，當(dāng)然并不是所有的菌落都會(huì)長(zhǎng)的這么規(guī)則，而且也不是所有的菌落都會(huì)長(zhǎng)的這么大，像葡萄酒、水這樣的樣品長(zhǎng)出的菌落就會(huì)很小。這就需要我們借助放大鏡來(lái)觀察，防止漏數(shù)菌落數(shù)。弄清這幾個(gè)概念后，我們就來(lái)看一下菌落總數(shù)測(cè)定的具體操作步驟：（1）以無(wú)菌操作，將檢樣25g(25ml)剪碎放

13、于含有225ml，滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器以8000-10000r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。（2）用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管，混合均勻，做成1：100的稀釋液。（3）另取1ml滅菌吸管，按上面操作順序，做10遞增稀釋液，如此每增加一次，即換用1支1ml滅菌吸管。（4）根據(jù)樣品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)颖疚廴厩闆r進(jìn)行估計(jì)，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該

14、稀釋度的吸管移1 ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。（5）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)（從檢樣稀釋到傾注平板不超過(guò)20min）將涼至46左右營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿內(nèi)15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入不加有1ml稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。（6）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，。取出計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。 在操作過(guò)程中要注意幾個(gè)事項(xiàng)：1.操作中必須有“無(wú)菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行滅菌處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包

15、裝開(kāi)口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺(tái)或經(jīng)過(guò)消毒處理的無(wú)菌室進(jìn)行。2采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時(shí)不應(yīng)集中一點(diǎn)，宜多采幾個(gè)部位。固體樣品必須經(jīng)過(guò)均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過(guò)振搖，以獲得均勻稀釋液。3.傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46水浴內(nèi)保溫，溫度過(guò)高會(huì)影響菌的生長(zhǎng)，過(guò)低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無(wú)水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。4.傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從1220ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過(guò)厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時(shí)，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計(jì)數(shù)觀察。5.為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩

16、個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過(guò)20min，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。6為了避免食品中的微小顆粒或培基中的雜質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。 7.在某些場(chǎng)合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。 8.吸管上端要塞上棉花，避免交叉污染；棉花塞得不宜過(guò)緊也不能過(guò)松。 9.倒培養(yǎng)基前，瓶口要過(guò)火焰。 10.做空白對(duì)照，順便可以鑒定一下你的器皿、培養(yǎng)基以及水是否滅好菌了。 11.平板一定要倒置放入培養(yǎng)箱里，因?yàn)榕囵B(yǎng)箱內(nèi)環(huán)

17、境溫?zé)?，培養(yǎng)基內(nèi)水份充足，培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)形成水份，蒸發(fā)，遇到平板的頂部會(huì)凝聚形成水珠，這時(shí)如果不倒置，會(huì)滴到培養(yǎng)基表面，使瓊脂表面濕潤(rùn)，細(xì)菌就會(huì)長(zhǎng)“糊”了，從而不利于形成菌落。 培養(yǎng)完后還要進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，這點(diǎn)也很重要，前面的工作做的再好，不會(huì)計(jì)數(shù)或是記得不準(zhǔn)確前面的一切都是徒勞。（1）平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，應(yīng)以無(wú)片狀菌數(shù)生長(zhǎng)的平板柞為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2代表全皿菌落數(shù)，平皿

18、內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界線）若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落，如有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。如有片狀菌落生長(zhǎng)，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個(gè)平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。當(dāng)計(jì)數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過(guò)多（即所有稀釋度均大于300時(shí)），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計(jì)數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。（2）稀釋度的選擇1.應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例1）。2.若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30300之間，則視兩者之比如何來(lái)決定若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；

19、若大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字（見(jiàn)表1中例2及例3）。3.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例4）。4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例5）。5.若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1中例6）.6.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見(jiàn)表1例7）。（3）菌落數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后

20、面的數(shù)值，以四舍五入的方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來(lái)表示（見(jiàn)表1）。例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)cfu/g(mL)報(bào)告方式cfu/g(mL)10110²1031多不可計(jì)164201640016000或1. 6×1042多不可計(jì)295461.63775038000或3.8×1043多不可計(jì)271602.22710027000或2.7×1044多不可計(jì)多不可計(jì)313313000310000或3.1×104527115270270或2.7×10260001×10107多不可計(jì)305123050031

21、000或3.1×104微生物檢測(cè)的第二個(gè)重要指標(biāo)就是大腸菌群的測(cè)定，大腸菌群系指一群在37度能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。大腸菌群MPN是采用一定的方法，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理所測(cè)定和計(jì)算出的一種最近似數(shù)值。大腸菌群MPN常規(guī)的檢驗(yàn)方法有三管系列、五管系列和其它系列，最常用的是三管系列，也有采用五官系列的，像生活飲用水中總大腸菌群的測(cè)定采用的就是五官系列。其原理相同，區(qū)別在于接種樣品

22、的稀釋度和各稀釋度的管數(shù)，三管系列接種三個(gè)稀釋度、每個(gè)稀釋度三管、五管系列接種五個(gè)稀釋度、每個(gè)稀釋度五管。以三管系列較為簡(jiǎn)便。那我們就以三管系列為例說(shuō)說(shuō)大腸菌群測(cè)定的步驟，其實(shí)食品中微生物的檢測(cè)首先第一步都是要進(jìn)行檢樣處理，然后根據(jù)樣品標(biāo)準(zhǔn)中微生物的限量及污染程度，選擇合適的稀釋度，根據(jù)要培養(yǎng)的菌種選擇適宜的培養(yǎng)基及時(shí)間、溫度等。前面我們已經(jīng)講過(guò)菌落總數(shù)測(cè)定的檢樣過(guò)程，就不重復(fù)了，我們看下面的操作，將處理好的樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1m1及1m1以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36±1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小

23、時(shí)，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，按下列程序進(jìn)行。分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種到伊紅美蘭瓊脂平板上，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824小 時(shí)，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。 證實(shí)試驗(yàn)：對(duì)典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有綠色金屬光澤或無(wú)金屬光澤時(shí)，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個(gè)菌落，由于機(jī)率問(wèn)題，尤

24、其當(dāng)菌落不典型時(shí)，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無(wú)典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。將挑取的可疑大腸菌群菌落進(jìn)行革蘭氏染色。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵 管，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時(shí)，觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。到這里我們就要了解一下什么是革蘭氏染色？革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過(guò)這一染色，可把幾乎所有的細(xì)菌分成革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌兩大類，因此它是分類鑒定菌種的重要方法。我們來(lái)看看這種方法的步驟：細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫溶液初染后，分別染上紫色，而經(jīng)碘液媒染，結(jié)晶紫就

25、與碘分子形成了一個(gè)分子量較大的染色較牢固的復(fù)合物。接著用95%酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，脫色后再用一種紅色染料如堿性番紅等進(jìn)行復(fù)染，前者仍帶紫色，后者則被染上紅色。因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G）。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無(wú)芽胞桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。染色反應(yīng)的主要依據(jù)就是革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣?，F(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽(yáng)性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不

26、易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色。另外，陽(yáng)性菌菌體等電點(diǎn)較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染色，陽(yáng)性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時(shí)的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時(shí)，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對(duì)結(jié)晶紫碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽(yáng)性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時(shí)間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個(gè)步驟，具體操作方法是：）涂片干燥固定。涂片不宜過(guò)后，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性；火焰固定不宜過(guò)熱否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)

27、。）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。）自來(lái)水沖洗。）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。）水洗，用吸水紙吸去水分。）加95%酒精數(shù)滴進(jìn)行脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色，立即水洗，吸去水分。結(jié)果是否正確，這步是關(guān)鍵。脫色不足，陰性菌被誤染成陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染成陰性菌，脫色時(shí)間為2030秒。）番紅染色液（?。┤?分鐘后，自來(lái)水沖洗。干燥，鏡檢。染色的結(jié)果，革蘭氏陽(yáng)性反應(yīng)菌體都呈紫色，陰性反應(yīng)菌體都呈紅色。證實(shí)實(shí)驗(yàn)完成后就可以進(jìn)行報(bào)告了，報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN的檢索表(見(jiàn)表)，報(bào)告每100ml(g)大腸菌群的最近似數(shù)(MPN)。陽(yáng)性管數(shù)MPN 100mL(g)1mL(g)×30.1

28、mL(g)×30.01mL(g)×300030001300026000390010300116001290表內(nèi)所列檢樣量如改用10、1、0.1時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0. 1、0.01、0.001時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍。標(biāo)準(zhǔn)中還提到了糞大腸菌群的檢出，它從屬于大腸菌群，我在這里簡(jiǎn)單地給大家提一下，用接種環(huán)將前面講述的操作中所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于EC肉湯中，置44.5±0.2水浴箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,培養(yǎng)后不產(chǎn)氣則報(bào)告為陰性；將產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于EMB上，培養(yǎng)1824h，凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為糞大腸菌群陽(yáng)性

29、。報(bào)告同上。 微生物檢驗(yàn)還有兩個(gè)重要指標(biāo)就是霉菌、酵母的計(jì)數(shù)及致病菌的檢驗(yàn)，因?yàn)槠髽I(yè)的出廠檢驗(yàn)微生物這塊主要是菌落總數(shù)和大腸菌群，所以后兩個(gè)指標(biāo)我就給大家簡(jiǎn)單介紹一下，讓大家了解一下。霉菌和酵母的培養(yǎng)可以使用同一種培養(yǎng)基，通過(guò)長(zhǎng)出的菌落形態(tài)特征來(lái)判斷計(jì)數(shù)，霉菌最顯著的特征就是一般有菌絲，不規(guī)則無(wú)固定大小，最初往往是白色或淺色，當(dāng)長(zhǎng)出孢子后就成好多顏色，像紅色、綠色、黑色等等。而酵母菌一般比較光滑，隆起，多為乳白色，少數(shù)有紅色，與細(xì)菌菌落特征相似。一般使用的培養(yǎng)基是孟加拉紅，檢樣操作和前面一樣，但是培養(yǎng)霉菌要求稀釋樣品要充分振搖30min以上，還要反復(fù)吹吸50次，一是霉菌孢子充分散開(kāi)。檢樣完畢后

30、選擇合適的稀釋度，取1mL稀釋液加到平板內(nèi)，加入培養(yǎng)基待凝固后倒置放入2528的培養(yǎng)箱內(nèi)，3天后開(kāi)始觀察，共培養(yǎng)觀察5天。然后選擇菌落數(shù)在10150之間的進(jìn)行報(bào)數(shù)，稀釋度的選擇及菌落的報(bào)告方式都可參照菌落總數(shù)報(bào)出方式。我們?cè)賮?lái)說(shuō)說(shuō)致病菌的檢驗(yàn)，主要的是三種沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌。我們以沙門(mén)氏菌為例簡(jiǎn)單的介紹一下操作，致病菌的檢測(cè)第一步都要進(jìn)行增菌，將25g樣品加入到225mL緩沖蛋白胨水（BP）中于36±1培養(yǎng)4h,取10mL加入到100mL四硫酸鈉煌綠增菌液(TTB)內(nèi)于42培養(yǎng)18h24h,同時(shí)，另取10mL于100mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液內(nèi)于36±

31、1培養(yǎng)18h24h。分離，取增菌液劃線接種一個(gè)亞硫酸鉍（BS）瓊脂和一個(gè)HEKTOEN氏腸道菌（HE）瓊脂上，于36±1培養(yǎng)18h24h，BS 上培養(yǎng)4048h。根據(jù)沙門(mén)氏菌在每種培養(yǎng)基上菌落形態(tài)挑取典型的可疑菌落(BS上產(chǎn)硫化氫的菌落呈褐色，灰色或黑色，有時(shí)帶有金屬光澤。有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周?chē)囵B(yǎng)基不變；HE上菌落呈蘭綠至蘭色，帶或不帶黑色中心。許多沙門(mén)氏菌培養(yǎng)物可呈現(xiàn)大的光澤黑色中心或幾乎全部黑色的菌落，多數(shù)產(chǎn)硫化氫)進(jìn)行生化試驗(yàn)接種到三糖鐵上，于36±1培養(yǎng)18h24h，通過(guò)在TSI內(nèi)的反應(yīng)來(lái)判定，然后進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)的鑒定。我們都知道微生物的檢

32、測(cè)最主要的就是要保證無(wú)菌操作，只有這樣才能保證出具數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可靠性。下面講的內(nèi)容就是怎樣做才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確。首先我們來(lái)區(qū)別兩個(gè)概念，消毒和滅菌這兩個(gè)詞在實(shí)際使用中常被混用，其實(shí)它們的含義是有所不同的。消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營(yíng)養(yǎng)體的方法，而滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無(wú)菌狀態(tài)。從概念中我們就能看出來(lái)我們?cè)谧鑫⑸锏脑囼?yàn)是要進(jìn)行前期的滅菌工作，而不是簡(jiǎn)單的消毒。我們就來(lái)看看通常采用地滅菌方法：一、物理方法：有高溫、輻射、超聲波、激光、過(guò)濾等等，在實(shí)驗(yàn)室中最常用的就是高溫滅菌和輻射滅菌。1、高溫利用高溫進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用

33、而又方便有效的方法。高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，不光是高溫可以殺菌，通常低溫也可以起抑菌作用，所以我們可以把預(yù)先配好的培養(yǎng)基放到冰箱里進(jìn)行保存。高溫滅菌包括干熱滅菌法和濕熱滅菌法，在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因?yàn)橐环矫鏉駸嵋子趥鬟f熱量，另一方面由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵結(jié)構(gòu)，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。）干熱滅菌法:a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及放培養(yǎng)基的瓶口，檢樣使用的剪子鑷子等。b.干熱空氣滅菌法：即把待滅菌的物品均勻地放入

34、烘箱中，升溫至160°C，恒溫1小時(shí)即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。這一般這可以用來(lái)烘干滅好菌的平板和吸管。）濕熱滅菌法:多數(shù)細(xì)菌和真菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞在60左右處理510分鐘即可殺死，酵母菌和真菌的孢子稍耐熱些，要用80以上處理才能殺死，而細(xì)菌的芽孢最耐熱，一般要在120下處理15分鐘才能殺死。這就是為什么器皿及蒸餾水的滅菌都要在121高壓滅菌15分鐘以上，而一般的培養(yǎng)基滅菌也都采用121高壓滅菌15分鐘。濕熱滅菌法包括常壓法和加壓法。常壓法：a.巴氏消毒法：有些食物會(huì)因高溫破壞營(yíng)養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來(lái)殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物

35、的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在6085處理15秒至30分鐘既可達(dá)到消毒目的。此法為法國(guó)微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸數(shù)分鐘，即可殺死細(xì)菌的全部營(yíng)養(yǎng)和部分芽孢。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。具體做法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在80100°C蒸煮1560分鐘，殺死其中所有微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。然后置室溫或放入37°C恒溫箱中過(guò)夜，誘導(dǎo)殘留的芽孢發(fā)芽。第2天再重復(fù)上述步驟，三次左右，就可達(dá)到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，但操作麻煩，所需時(shí)間長(zhǎng)。加壓法：常

36、規(guī)加壓滅菌法和連續(xù)加壓滅菌法 常規(guī) 加壓滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測(cè)和微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。常規(guī)加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個(gè)可密閉的盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋中，把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密封。再繼續(xù)加熱就會(huì)使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，從而溫度也隨之提高到100以上。在蒸汽壓達(dá)到1kg/厘米2時(shí)即0.1MPa，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達(dá)到121°C。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在1520分鐘便會(huì)被殺死，而達(dá)到滅菌目的。如滅菌的對(duì)象是砂土

37、、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個(gè)問(wèn)題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對(duì)應(yīng)關(guān)系，這樣會(huì)大大降低滅菌效果。2影響加壓蒸汽滅菌的因素a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對(duì)高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營(yíng)養(yǎng)體和病毒在5065°C，10分鐘就會(huì)被殺死；但各種孢子、特別是細(xì)菌芽孢最能抗熱，要在121°C，15分鐘才被殺死。對(duì)同種微生物來(lái)講，幼齡菌比老齡菌對(duì)熱更敏感。b.微生物的數(shù)量多少顯然會(huì)影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時(shí)間越長(zhǎng)。c.滅菌對(duì)象PH的影響 PH6.08.0時(shí)，微

38、生物較不易死亡；PH6.0時(shí)，最易引起死亡。d.滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響 原理是在驅(qū)盡鍋內(nèi)空氣的前提下，通過(guò)加熱把密閉鍋內(nèi)純水蒸汽的壓力升高而使蒸汽溫度相應(yīng)提高，也就是說(shuō)是依靠溫度而不是壓力達(dá)到滅菌的目的。因此，在一切利用加壓蒸汽滅菌法的場(chǎng)合下，必須做到徹底排除滅菌鍋內(nèi)的殘余空氣。e.滅菌對(duì)象的體積 滅菌對(duì)象體積的大小會(huì)影響熱的傳導(dǎo)速率。3滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響 除對(duì)培養(yǎng)基中的淀粉成分有促進(jìn)糊化和水解等少數(shù)有利影響外，很多是不利因素：a.pH值改變，普遍下降。b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會(huì)產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。c.破壞營(yíng)養(yǎng)，

39、提高色澤，不少培養(yǎng)基顏色加深。d.體積和濃度有所變化，降低濃度氣溫低時(shí)會(huì)增加冷凝水?？梢圆捎锰厥饧訜釡缇姆椒ㄏ泻τ绊?，像對(duì)含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基，如含糖組合培養(yǎng)基，可進(jìn)行低壓滅菌15分鐘，所以像我們培養(yǎng)大腸菌群所用的乳糖膽鹽培養(yǎng)基就是采用了1150.07MPa左右滅菌15分鐘。、輻射利用輻射進(jìn)行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺點(diǎn)，所以應(yīng)用越來(lái)越廣，目前主要應(yīng)用在以下幾個(gè)方面：）像微生物實(shí)驗(yàn)室、超凈工作臺(tái)都應(yīng)用紫外燈殺菌。避免紫外燈的照射，打開(kāi)時(shí)人員要離開(kāi)。）還有應(yīng)用射線作食品表面殺菌，射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延

40、長(zhǎng)。、過(guò)濾采用機(jī)械方法，設(shè)計(jì)一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過(guò)濾器。通過(guò)過(guò)濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達(dá)到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對(duì)熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點(diǎn)是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時(shí)會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)一定的麻煩。二、化學(xué)方法一般化學(xué)藥劑無(wú)法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長(zhǎng)繁殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴(yán)格區(qū)分。消

41、毒劑在低濃度時(shí)也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐劑沒(méi)有選擇性，因此對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對(duì)人體組織細(xì)胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周?chē)h(huán)境的消毒。常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來(lái)蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。像在做試驗(yàn)時(shí)可以用75%的酒精對(duì)手進(jìn)行消毒。為了保證滅好菌的器皿和培養(yǎng)基不被污染都要將口包好密封，而且為了避免微生物的滋生和繁殖，做完實(shí)驗(yàn)的器具必須先進(jìn)行滅菌再洗刷。總之微生物檢驗(yàn)既要保證環(huán)境的無(wú)菌又要保證操作規(guī)范不引入外來(lái)菌。我想在座的各位其中應(yīng)該有罐頭生產(chǎn)企業(yè)，罐頭的微生物檢驗(yàn)要求商業(yè)無(wú)菌，那我簡(jiǎn)單的介紹一下商業(yè)無(wú)菌

42、的檢測(cè)。首先打開(kāi)一罐測(cè)一下PH值，PH值等于或小于4.6的為酸性罐頭，大于4.6的為低酸性罐頭，然后最少取3罐進(jìn)行保溫，低酸型于36±1保溫10天，酸性的于30±1保溫10天。保溫過(guò)程中每天觀察，如有胖聽(tīng)或泄漏等現(xiàn)象，立即剔出作開(kāi)罐檢查。胖聽(tīng)是由于罐頭內(nèi)微生物活動(dòng)或化學(xué)作用產(chǎn)生氣體，形成正壓，使一端或兩端外凸的現(xiàn)象。泄漏是罐頭密封結(jié)構(gòu)有缺陷，或由于撞擊而破壞密封，或罐壁腐蝕而穿孔致使微生物侵入的現(xiàn)象。開(kāi)罐檢查包括PH測(cè)定，看與開(kāi)始時(shí)有否顯著差異；感官檢查，外觀、色澤、狀態(tài)、氣味等進(jìn)行觀察和嗅聞、用餐具按住食品或戴薄紙?zhí)滓允种赣|感，鑒別是否腐敗變質(zhì)。對(duì)感官或PH檢查結(jié)果認(rèn)為可

43、疑的，進(jìn)行涂片染色鏡檢。若是出現(xiàn)胖聽(tīng)、泄漏或開(kāi)罐檢查發(fā)現(xiàn)PH、感官異常、腐敗變質(zhì)，進(jìn)一步鏡檢發(fā)現(xiàn)有異常，均應(yīng)及時(shí)進(jìn)行微生物接種培養(yǎng)。以上就是我對(duì)食品中微生物檢測(cè)的一些總結(jié)和個(gè)人的理解和積累，希望對(duì)大家有所幫助。謝謝大家！ 第三節(jié)致病性微生物食品首先是應(yīng)考慮其安全性，其次才是可食性和其他，食品中一旦含有致病性微生物，其安全性就隨之喪失，當(dāng)然其食用性也不復(fù)存在了；各國(guó)的衛(wèi)生部門(mén)對(duì)致病性微生物都作了嚴(yán)格的規(guī)定，把它作為食品衛(wèi)生質(zhì)量的最重要的指標(biāo)。一、食品中常見(jiàn)的致病性微生物食品生產(chǎn)是一個(gè)時(shí)間長(zhǎng)、環(huán)節(jié)多的復(fù)雜過(guò)程?？傊c食品有直接和間接關(guān)系的致病性微生物都可能污染食品。（以乳制品為例）1、能引起人類

44、疾病和食物中毒的致病性微生物：沙門(mén)氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能產(chǎn)生毒襄并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，也包括一些真菌，都會(huì)產(chǎn)生毒素。二、食品中致病性微生物的檢驗(yàn)1、致病性微生物的檢驗(yàn)按照國(guó)家統(tǒng)一的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。2、特例：在加工食品中能夠存活下來(lái)的致病性微生物注往受到了某種程度的損傷，它們會(huì)受到增菌液中抑制劑的影響而不能被檢測(cè)出來(lái)。因此，需要進(jìn)行前增菌，以幫助致病菌恢復(fù)到正常狀態(tài)。前增菌的適宜方法和使用的培養(yǎng)基則因食品的理化性質(zhì)、加工方法不同而異。以檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌為例，干蛋品中的細(xì)菌用緩沖蛋白胨水進(jìn)行前增菌，脫脂乳粉中的細(xì)菌用煌綠水進(jìn)行前增菌

45、，全脂乳粉則用滅菌蒸餾水進(jìn)行前增菌，椰子用乳糖肉湯，干酵母用胰酪胨大豆肉湯前增菌。第四節(jié)細(xì)菌相與食品衛(wèi)生的關(guān)系1、細(xì)菌相：指存在于某一物質(zhì)中的細(xì)菌種類及其相對(duì)數(shù)量的構(gòu)成。食品中的各種細(xì)菌就構(gòu)成了該食品的細(xì)菌相，水中的細(xì)菌構(gòu)成了水的細(xì)菌相。細(xì)菌相是對(duì)細(xì)菌的種類面言，在菌相中相對(duì)數(shù)量較大的一種或幾種細(xì)菌被稱為優(yōu)勢(shì)菌。2、嗜冷菌：這類細(xì)菌在接近0時(shí)生長(zhǎng)得比較好，最適溫度為10一20，最高溫度在30一35。3、嗜溫菌：這類細(xì)菌都能在25氣40迅速生長(zhǎng)，在55不生長(zhǎng)。4、嗜熱菌：這類細(xì)菌生長(zhǎng)范圍為4375，最適為50C一55C，在32C以下很難生長(zhǎng)。嗜溫菌和嗜熱菌的一些細(xì)菌在生長(zhǎng)溫度范圍上有重迭，產(chǎn)生芽

46、胞的細(xì)菌尤其如此。一、細(xì)菌相對(duì)食品衛(wèi)生質(zhì)量的影響1、新鮮畜禽肉的細(xì)菌相：主要是嗜溫菌，包括大腸菌群、腸球菌、金黃色葡萄球菌、魏氏梭菌和沙門(mén)氏菌等。新鮮肉類的細(xì)菌相以嗜溫菌為主，在溫度適宜時(shí)，嗜溫菌會(huì)大量繁殖造成肉的變質(zhì)，同時(shí)發(fā)生臭味；在冷藏條件下，嗜溫菌生長(zhǎng)很慢甚至不生長(zhǎng)，嗜冷菌開(kāi)始大量繁殖，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌，最后會(huì)導(dǎo)致肉表面形成粘液并產(chǎn)生氣味；在冷凍條件下，所有的細(xì)菌都不再生長(zhǎng)繁殖，因而可以較長(zhǎng)期保存而不變質(zhì)。2、液體蛋晶的細(xì)菌相：主要是革蘭氏陰性菌，包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、變形菌屬和埃希氏菌屬等。3、鮮魚(yú)的細(xì)菌相以嗜冷菌為主，有假單胞菌屬、黃色桿菌屬和弧菌屬等。如在水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了沙門(mén)氏菌

47、，一般認(rèn)為是外來(lái)污染，應(yīng)對(duì)該產(chǎn)品的生產(chǎn)，加工過(guò)程進(jìn)行分析、檢測(cè)，從而找到污染源。二、食品的正常菌相和細(xì)菌數(shù)量食品及原料都有正常的細(xì)菌相，它們因受多種因素的影響，其種類和數(shù)量有很大差別。1、鮮肉的細(xì)菌相以嗜溫菌為主，其次為嗜冷菌。加工良好的鮮肉細(xì)菌數(shù)為103個(gè)g左右，如加工不良會(huì)達(dá)到106個(gè)g，肉制品的細(xì)菌數(shù)約為103104個(gè)g，大腸菌群MPN為10102個(gè)100g，金黃色葡萄球菌為10-102個(gè)g。2、鮮蛋的細(xì)菌相以革蘭氏陽(yáng)性球菌為主，革蘭氏陰性桿菌數(shù)量很少。3、液體蛋晶的細(xì)菌相是革蘭氏陰性菌，包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、變形菌屬和埃希氏菌屬，細(xì)菌數(shù)量一般為104106個(gè)g，大腸菌群為1031

48、05個(gè)100g，沙門(mén)氏菌為1100個(gè)g。、無(wú)菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過(guò)滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無(wú)菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個(gè)過(guò)程叫做無(wú)菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無(wú)菌操作。圖5斜面接種時(shí)的無(wú)菌操作(1)接種滅菌 (2)開(kāi)啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞志賀氏菌的檢驗(yàn)一、增菌稱取檢樣25g，加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶?jī)?nèi)，固體食品用均質(zhì)器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36培養(yǎng)68h。培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)菌生長(zhǎng)情況而

49、定，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微混濁時(shí)即應(yīng)中止培養(yǎng)。二、分離和初步生化試驗(yàn)取增菌液1環(huán)，劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個(gè)；另取1環(huán)劃線接種于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍(lán)瓊脂平板各1個(gè)，于36培養(yǎng)1824h。 志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無(wú)色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管。一般應(yīng)多挑幾個(gè)菌落，以防遺漏，經(jīng)36培養(yǎng)1824h，分別觀察結(jié)果。下述培養(yǎng)物可以棄去：a.在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長(zhǎng)的培養(yǎng)物；b.在1824h內(nèi)發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；c.不分解葡萄糖和只生長(zhǎng)在半固體表面的培養(yǎng)物；d.產(chǎn)氣的培養(yǎng)物；e.有動(dòng)力的培養(yǎng)物；f.產(chǎn)生硫化氫的培養(yǎng)物。凡是乳糖、蔗

50、糖不發(fā)酵，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體)，無(wú)動(dòng)力的菌株，可做血清學(xué)分型和進(jìn)一步的生化試驗(yàn)。三、血清學(xué)分型挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗(yàn)。先用4種志賀氏菌多價(jià)血清檢查，如果由于K抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應(yīng)將菌液煮沸后再檢查；如果呈現(xiàn)凝集，則用A1、A2、B群多價(jià)和D群血清分別試驗(yàn)。如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的型和群抗原見(jiàn)表1?？上扔萌阂蜃友鍣z查，再根據(jù)群因子血清出現(xiàn)凝集的結(jié)果，依次選用型因子血清檢查。4種志賀氏菌多價(jià)血清不凝集的菌株，可用鮑氏多價(jià)1、2、3分別檢查，并進(jìn)一步用115各型因子血清檢查。如果鮑氏多價(jià)血清不凝

51、集，可用痢疾志賀氏菌312型多價(jià)血清及各型因子血清檢查。四、進(jìn)一步的生化試驗(yàn)在做血清學(xué)分型的同時(shí)，應(yīng)做進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，即：葡萄糖銨西蒙氏檸檬酸鹽賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶pH7.2尿素KCN生長(zhǎng)水楊苷和七葉苷的分解除宋內(nèi)氏菌和鮑氏13型為烏氨酸陽(yáng)性外，志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。必要時(shí)還應(yīng)做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應(yīng)不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物。已判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)一步做5%乳糖發(fā)酵甘露醇棉子糖甘油的發(fā)酵靛基質(zhì)試驗(yàn)志賀氏菌屬4個(gè)生化群的培養(yǎng)物，應(yīng)符合該群的生化特性。但福氏6型的生化特性與

52、A群或C群相似。五、結(jié)果報(bào)告：綜合生化和血清學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果判定菌型并作出報(bào)告。 金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)我們以SN標(biāo)準(zhǔn)中的最近似值(MPN)測(cè)定法來(lái)進(jìn)行講解：這種方法適用于檢測(cè)認(rèn)為帶有大量競(jìng)爭(zhēng)菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的食品中的少量金黃色 葡萄球菌。 1、樣品制備：固體或半固體食品: 以無(wú)菌操作稱取25g樣品,放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均 質(zhì)杯內(nèi),于8000r/min均質(zhì)12min,制成1:10樣品勻液。 液體食品: 用滅菌吸管吸取25mL樣品,放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi) (瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠),經(jīng)充分振搖制成1:10樣品勻液。 供計(jì)數(shù)檢驗(yàn)時(shí),可按十進(jìn)位遞

53、增稀釋法將樣品勻液再進(jìn)行適當(dāng)稀釋。2、選三個(gè)連續(xù)稀釋度，從每個(gè)稀釋度分別取1 mL稀釋樣品液，接種3管含10氯化鈉why? 還記得么？ 金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)。 因此，這事實(shí)上是一種選擇性的增菌。胰蛋白胨大豆肉湯。樣品的最高稀釋度必須達(dá)到能獲得陰性終點(diǎn),置36±1培養(yǎng)48 h。 3、用3 mm接種環(huán),從有細(xì)菌生長(zhǎng)的各管中移取1 環(huán),劃線接種于表面干燥的Baird- Parker瓊脂平板,置36±1培養(yǎng)4548h。 4、從有細(xì)菌生長(zhǎng)的每一平板上至少挑取1個(gè)可疑金黃色葡萄球菌菌落,移種到肉湯培養(yǎng)基中,置36±1培養(yǎng)2024 h

54、。 5、取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿于8mm×100mm試管內(nèi)充分混合,置 36±1培養(yǎng),定時(shí)觀察是否有凝塊形成,至少觀察6 h,以內(nèi)容物完全凝固,使試管倒置或 傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽(yáng)性。試驗(yàn)中需同時(shí)做巳知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。對(duì)可疑結(jié)果,應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和其他輔助試驗(yàn)如耐熱核酸酶試驗(yàn)等 加以證實(shí)。6、報(bào)告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗(yàn)結(jié)果查最近似值(MPN)表,報(bào)告金黃色葡萄球菌 的MPN/g (mL)。 志賀氏菌的生物學(xué)特性志賀氏菌屬（Shigella） 的細(xì)菌（通稱痢疾桿菌），是細(xì)菌性痢疾的病原菌人類對(duì)痢疾桿菌有很高的易感性。在幼兒可引起急性中毒性菌痢，死亡率

55、甚高。志賀氏菌和大腸桿菌都屬于腸桿菌科，根據(jù)DNA雜交研究結(jié)果表明，志賀氏菌屬的四個(gè)種和大腸桿菌屬在生化上是難以區(qū)分的，因?yàn)橛挟a(chǎn)氣的志賀氏菌，也有乳糖陰性、不產(chǎn)氣、不運(yùn)動(dòng)的大腸桿菌，有些大腸桿菌也能引起痢疾狀的腹瀉。志賀氏菌的形態(tài)學(xué)特征：志賀氏菌屬細(xì)菌的形態(tài)與一般腸道桿菌無(wú)明顯區(qū)別，為革蘭氏陰性桿菌，長(zhǎng)約2-3 m ,寬0.5-0.7 m 。不形成芽胞，無(wú)莢膜，無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，有菌毛。志賀氏菌的培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧。營(yíng)養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，最適溫度為37，最適pH為6.4-7.8。37培養(yǎng)18-24小時(shí)后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤(rùn)、無(wú)色、半透明、邊緣整齊，直徑約2nm，宋內(nèi)氏菌

56、菌落一般較大，較不透明，并常出現(xiàn)扁平的粗糙型菌落。在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長(zhǎng)，無(wú)菌膜形成。志賀氏菌的生化特性：本菌屬都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。大多不發(fā)酵乳糖，僅宋內(nèi)氏菌遲緩發(fā)酵乳糖。靛基質(zhì)產(chǎn)生不定，甲基紅陽(yáng)性，VP試驗(yàn)陰性，不分解尿素，不產(chǎn)生H2S。根據(jù)生化反應(yīng)可進(jìn)行初步分類。志賀氏菌屬的細(xì)菌對(duì)甘露醇分解能力不同，可分為二大組。志賀氏菌的抗原構(gòu)造與分型：志賀氏菌屬細(xì)菌的抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。主要抗原有三種。型特異性抗原、群特異性抗原、表面抗原（K抗原）。根據(jù)抗原構(gòu)造的不同，按最新國(guó)際分類法，將本屬細(xì)菌分為四個(gè)群、39個(gè)血清型（包括亞型）志賀氏菌的抵抗力：志賀氏菌屬在

57、外界環(huán)境中的生存力，以宋內(nèi)氏最強(qiáng)，福氏菌次之，志賀氏菌最弱。一般在潮濕土壤中能存活34天，37水中存活20天，在糞便內(nèi)（室溫）存活11天。日光直接照射30分鐘，56-6010分即被殺死，對(duì)高溫和化學(xué)消毒劑很敏感，1%石炭酸中15-30分鐘即被殺死，對(duì)氯霉素、磺胺類、鏈霉素敏感，但易產(chǎn)生耐藥性。志賀氏菌的變異性：S-R型變異：菌落可由光滑型變?yōu)榇植谛停瑫r(shí)常伴有生化反應(yīng)、抗原構(gòu)造和致病性的變異。在機(jī)體內(nèi)，尤其在慢性患者和恢復(fù)期患者，志賀氏菌可發(fā)生變異而失去原來(lái)的生化和抗原特性，成為不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通過(guò)10%膽汁肉湯等返祖為典型菌株。故在慢性患者或帶菌者糞便檢查時(shí)，對(duì)這類菌株要特別注意，必須多次反復(fù)檢查。因這對(duì)傳染源的發(fā)現(xiàn)及控制有重要意義。耐藥性