食品中微生物的檢驗

1、食品中微生物的檢驗一、概念和分類微生物并不是生物學分類學上的專門名詞，而是對所有形體微小，單細胞的或個體結(jié)構(gòu)較為簡單的多細胞的、甚至沒有細胞結(jié)構(gòu)的低等生物的統(tǒng)稱。微生物群體非常龐雜，種類繁多，包括細胞型和非細胞型兩類。凡具有細胞形態(tài)的微生物稱為細胞型微生物。細胞型微生物按細胞結(jié)構(gòu)又分為原核微生物和真核微生物。 原核生物的主要特點：細胞內(nèi)有明顯的核區(qū)，但沒有核膜包圍；核區(qū)內(nèi)含有一條雙鏈DNA構(gòu)成的染色體；能量代謝和很多合成代謝均在質(zhì)膜上進行，核糖體分布在細胞之中；相對于原核微生物，真核微生物的細胞結(jié)構(gòu)有了真正的細胞核,有多種細胞器；而病毒則不具有細胞結(jié)構(gòu)，由核酸和蛋白質(zhì)組成，可以認為是超顯微的、

2、沒有細胞結(jié)構(gòu)的、專性活細胞內(nèi)寄生的實體。它們在活細胞外具有一般化學大分子的特征，在宿主細胞內(nèi)又具有生命特征?？梢宰鳛榱私獾氖?，病毒可以通過細菌濾器，且對抗生素不敏感，對干擾素敏感。二、細菌、霉菌、酵母菌和致病菌介紹細菌的細胞結(jié)構(gòu)在原核生物中具有代表性，主要由細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、核質(zhì)體等部分構(gòu)成,有的細菌還有夾膜、鞭毛、菌毛等特殊結(jié)構(gòu)。在自然界中細菌是分布最廣、數(shù)量最多的一類生物，并與食品關(guān)系最為密切。是食品理論、工業(yè)發(fā)酵和釀造研究的主要對象，也是導致食品腐敗的主要類群。細菌的基本形態(tài)有球狀、桿狀和螺旋狀,分別被稱為球菌、桿菌和螺旋菌。霉菌是一些絲狀真菌的統(tǒng)稱。在自然界分布極廣，它的營養(yǎng)來源

3、主要是糖類和少量氮、礦物鹽等，極易在含糖的食品、餅干、面包和各種谷物、水果上生長。經(jīng)常會有食品會因為發(fā)生霉變而不能食用，還有些霉菌會產(chǎn)生毒性很大的毒素，比如黃曲霉素、黃米毒素、雜色曲霉素和展青霉素等等，都可能導致癌癥，這類霉菌在大米和花生中最多。由此，對霉菌的檢測尤為重要。霉菌菌體是由分支或不分支的菌絲組成，菌絲細胞均由細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、細胞核、線粒體、核糖體以及內(nèi)含物組成。在固體培養(yǎng)基上，部分菌絲深入培養(yǎng)基內(nèi)吸收養(yǎng)料，稱為營養(yǎng)菌絲；另一部分則向空氣生長，稱為氣生菌絲；有的氣生菌絲發(fā)育到一定階段分化為繁殖菌絲。霉菌的菌落一般比細菌菌落大幾倍到幾十倍，同一種霉菌，在不同成分的培養(yǎng)基上形成的

4、菌落特征可能有變化，但各種霉菌，在一定的培養(yǎng)基上形成的菌落大小、形狀、顏色等卻相對穩(wěn)定。菌落特征也是鑒定霉菌的重要依據(jù)之一。酵母菌多數(shù)為單細胞，一般呈圓形、橢圓形、圓柱形或檸檬形，也有些酵母菌細胞與其子代細胞連在一起成為鏈狀，形成假菌絲，稱為假絲酵母。酵母菌在適宜的培養(yǎng)基上形成的菌落與細菌相似，但比細菌菌落大而且厚，菌落表面濕潤、粘稠、易被調(diào)起，有些種因培養(yǎng)時間太長使菌落表面皺縮。三、培養(yǎng)基（北京陸橋）1、微生物的營養(yǎng)微生物同其他生物一樣，需要不斷地從外部環(huán)境中獲取營養(yǎng)，才能夠維持生命。微生物細胞主要有水、有機物和無機鹽等化學成份組成，不同的微生物種類其細胞的化學組成也不相同，而且含量也有差異

5、。因此，維持微生物生長所需要的化學元素的種類與含量也不相同。一般來說細胞含有某種元素的量高則細胞對這種元素的需要量也就大，含量低則需要量也小。這也是為什么我們不同的微生物培養(yǎng)要選擇不同的培養(yǎng)基。另外，同一種微生物在不同的培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)也有差別，所以在選擇培養(yǎng)基是要注意。微生物所需要的營養(yǎng)物質(zhì)按照它們在機體中的生理作用不同，可以分為碳源、氮源、無機鹽和生長因子四種類型。能被微生物用來構(gòu)成細胞物質(zhì)的或代謝產(chǎn)物中碳（氮）素來源的營養(yǎng)物質(zhì)稱為碳（氮）原物質(zhì)；無機鹽為微生物機體提供金屬元素；有些微生物在含有氮源、碳源、無機鹽的培養(yǎng)基上人不能生長，而需要添加某些生長因子，滿足生長的需要，比如維生素、氨

6、基酸、嘌呤堿基等。我們經(jīng)常用到營養(yǎng)物質(zhì)：單糖、淀粉等（碳源）；尿素、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏等（氮源）；硫酸鋅等（無機鹽）。2、培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基是人工配制的合適于不同微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的基礎(chǔ)。配制培養(yǎng)基需要遵循一定的原則：第一，根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基；自養(yǎng)型微生物合成能力強，可以利用簡單的無機物質(zhì)合成復雜的細胞物質(zhì)，其培養(yǎng)基可以由簡單的無機物質(zhì)組成。而異樣型微生物合成能力差，不能以無機物質(zhì)作為唯一營養(yǎng)源，就要在培養(yǎng)基中添加一些有機物質(zhì)（比如葡萄糖等）。另外細菌和酵母菌對培養(yǎng)基的要求也不同，細菌一般用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，而酵母菌則用麥芽汁

7、培養(yǎng)基培養(yǎng)。第二，注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和配比；微生物生長所需要的營養(yǎng)物往往是在濃度合適的條件下才表現(xiàn)出良好的作用，濃度大時反而對微生物生長期抑制作用。微生物只有在適合生長的條件下，才表現(xiàn)出應有的形態(tài)特征，而不適合的條件下生長，會是微生物的形態(tài)特征發(fā)生改變。第三，將培養(yǎng)基的pH控制在一定的范圍之內(nèi)，滿足不同類型微生物的生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物。各種微生物生長的最適pH各不相同，一般來說，細菌生長的pH在中性和微堿性之間（pH在7-7.5），酵母菌和霉菌生長的pH值通常是偏酸的（pH在4.5-6）。另外由于微生物在生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，會改變培養(yǎng)基的pH值，如

8、果不及時控制，往往會導致生長停止。因此，為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽。3、培養(yǎng)基的類型及應用培養(yǎng)基的種類很多，按培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學成分分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基；根據(jù)物理狀態(tài)不同分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基（常用凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠，硅膠是由無幾的硅酸鈉和硅酸鉀被鹽酸及硫酸中和時凝聚而成的膠體，不含有機物，因而適合于用來分離和培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物）；根據(jù)培養(yǎng)基的特殊用途，可將培養(yǎng)基分成基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；加

9、富培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基上加入其他營養(yǎng)物質(zhì)，用以培養(yǎng)某種或某類營養(yǎng)要求苛刻的一樣微生物；選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化合物的敏感性不同而設(shè)計出來的一類培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。比如，我們在培養(yǎng)基中加入青霉素或者四環(huán)素等抗生素（生長抑制劑，抑制細菌和放線菌生長），可以分離酵母菌和霉菌；通過在培養(yǎng)基中加入結(jié)晶紫或提高培養(yǎng)基中氯化鈉的濃度（7.5%），可以從混雜的微生物群體中分別分離出革蘭氏陰性菌或葡萄球菌；加孔雀石綠可以分離出革蘭氏陽性菌。鑒別培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基內(nèi)加入某種試劑或化學藥品，使得某種微生物在這個培養(yǎng)基上生長后，

10、可以產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特定試劑或化學藥品起反應，產(chǎn)生某種明顯的特征性變化。根據(jù)這種特點來區(qū)分微生物。比如：大腸菌群測定中，液體培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫和發(fā)酵管，來指示微生物生長過程中是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣；伊紅美藍培養(yǎng)基是一種鑒別培養(yǎng)基，常用于檢查乳制品和飲用水中是否含有致病性的腸道細菌，伊紅為酸性染料，美藍則為堿性染料。當大腸桿菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生混合酸時，與伊紅染色，再與美藍結(jié)合生成紫黑色化合物。在此培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌形成呈紫黑色帶金屬光澤的小菌落。而產(chǎn)氣桿菌則形成呈棕色的大菌落。不能發(fā)酵乳糖的細菌產(chǎn)堿性物較多，帶負電荷，與美藍結(jié)合，被染成藍色菌落。還可以加入明膠，看液化明膠的

11、情況。四、微生物檢驗食品中的微生物檢驗項目主要有四個：菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌、致病菌。其中致病菌又主要包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌。首先，我們看一下菌落總數(shù)的測定。我們先弄清楚幾個概念什么是菌落、菌落總數(shù)和細菌總數(shù)？我們都知道單個細菌用肉眼是看不見的，但是，當單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，便會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，這就是菌落。而菌落總數(shù)就是指食品經(jīng)過檢樣處理，在一定條件下進行培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1mL（g）檢樣中所含菌落的總數(shù)。更確切地說即在需氧情況下，36±1培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)

12、瓊脂平板上生長的菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等?？梢姲丫淇倲?shù)就等同于細菌總數(shù)是不確切的。我們可以看看長在營養(yǎng)瓊脂平板上最常見的菌落形態(tài)，當然并不是所有的菌落都會長的這么規(guī)則，而且也不是所有的菌落都會長的這么大，像葡萄酒、水這樣的樣品長出的菌落就會很小。這就需要我們借助放大鏡來觀察，防止漏數(shù)菌落數(shù)。弄清這幾個概念后，我們就來看一下菌落總數(shù)測定的具體操作步驟：（1）以無菌操作，將檢樣25g(25ml)剪碎放

13、于含有225ml，滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器以8000-10000r/min的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。（2）用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管，混合均勻，做成1：100的稀釋液。（3）另取1ml滅菌吸管，按上面操作順序，做10遞增稀釋液，如此每增加一次，即換用1支1ml滅菌吸管。（4）根據(jù)樣品衛(wèi)生標準要求或?qū)颖疚廴厩闆r進行估計，選擇2-3個適宜稀釋度，分別在做10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該

14、稀釋度的吸管移1 ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。（5）稀釋液移入平皿后，應及時（從檢樣稀釋到傾注平板不超過20min）將涼至46左右營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿內(nèi)15ml，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入不加有1ml稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。（6）待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，。取出計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。 在操作過程中要注意幾個事項：1.操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行滅菌處理。樣品如果有包裝，應用75%乙醇在包

15、裝開口處擦拭后取樣。操作應當在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進行。2采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時不應集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。3.傾注用培養(yǎng)基應在46水浴內(nèi)保溫，溫度過高會影響菌的生長，過低瓊脂易于凝固而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。4.傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從1220ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。5.為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩

16、個方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。6為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。 7.在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。 8.吸管上端要塞上棉花，避免交叉污染；棉花塞得不宜過緊也不能過松。 9.倒培養(yǎng)基前，瓶口要過火焰。 10.做空白對照，順便可以鑒定一下你的器皿、培養(yǎng)基以及水是否滅好菌了。 11.平板一定要倒置放入培養(yǎng)箱里，因為培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)

17、境溫熱，培養(yǎng)基內(nèi)水份充足，培養(yǎng)過程中會形成水份，蒸發(fā)，遇到平板的頂部會凝聚形成水珠，這時如果不倒置，會滴到培養(yǎng)基表面，使瓊脂表面濕潤，細菌就會長“糊”了，從而不利于形成菌落。 培養(yǎng)完后還要進行菌落計數(shù)的報告，這點也很重要，前面的工作做的再好，不會計數(shù)或是記得不準確前面的一切都是徒勞。（1）平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標準，一個稀釋度使用兩個平板，應采用兩個平板平均數(shù)，其中一個平板有較大片狀菌數(shù)生長時，則不宜采用，應以無片狀菌數(shù)生長的平板柞為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2代表全皿菌落數(shù)，平皿

18、內(nèi)如有鏈狀菌落生長時（菌落之間無明顯界線）若僅有一條鏈，可視為一個菌落，如有不同來源的幾條鏈，則應將每條鏈作為一個菌落計。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。當計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。（2）稀釋度的選擇1.應選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例1）。2.若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30300之間，則視兩者之比如何來決定若其比值小于或等于2，應報告其平均數(shù)；

19、若大于2則報告其中較小的數(shù)字（見表1中例2及例3）。3.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例4）。4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例5）。5.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例6）.6.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1例7）。（3）菌落數(shù)的報告 菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后

20、面的數(shù)值，以四舍五入的方法計算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示（見表1）。例次稀釋液及菌落數(shù)兩稀釋液之比菌落總數(shù)cfu/g(mL)報告方式cfu/g(mL)10110²1031多不可計164201640016000或1. 6×1042多不可計295461.63775038000或3.8×1043多不可計271602.22710027000或2.7×1044多不可計多不可計313313000310000或3.1×104527115270270或2.7×10260001×10107多不可計305123050031

21、000或3.1×104微生物檢測的第二個重要指標就是大腸菌群的測定，大腸菌群系指一群在37度能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性的無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。大腸菌群MPN是采用一定的方法，應用統(tǒng)計學的原理所測定和計算出的一種最近似數(shù)值。大腸菌群MPN常規(guī)的檢驗方法有三管系列、五管系列和其它系列，最常用的是三管系列，也有采用五官系列的，像生活飲用水中總大腸菌群的測定采用的就是五官系列。其原理相同，區(qū)別在于接種樣品

22、的稀釋度和各稀釋度的管數(shù)，三管系列接種三個稀釋度、每個稀釋度三管、五管系列接種五個稀釋度、每個稀釋度五管。以三管系列較為簡便。那我們就以三管系列為例說說大腸菌群測定的步驟，其實食品中微生物的檢測首先第一步都是要進行檢樣處理，然后根據(jù)樣品標準中微生物的限量及污染程度，選擇合適的稀釋度，根據(jù)要培養(yǎng)的菌種選擇適宜的培養(yǎng)基及時間、溫度等。前面我們已經(jīng)講過菌落總數(shù)測定的檢樣過程，就不重復了，我們看下面的操作，將處理好的樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1m1及1m1以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36±1溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2小

23、時，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管均不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性。如有產(chǎn)氣者，按下列程序進行。分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種到伊紅美蘭瓊脂平板上，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824小 時，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實試驗。 證實試驗：對典型和可疑菌落進行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。國家標準方法規(guī)定伊紅美藍平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有綠色金屬光澤或無金屬光澤時，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個菌落，由于機率問題，尤

24、其當菌落不典型時，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。將挑取的可疑大腸菌群菌落進行革蘭氏染色。同時接種乳糖發(fā)酵 管，置36±1溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時，觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。到這里我們就要了解一下什么是革蘭氏染色？革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過這一染色，可把幾乎所有的細菌分成革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌兩大類，因此它是分類鑒定菌種的重要方法。我們來看看這種方法的步驟：細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫溶液初染后，分別染上紫色，而經(jīng)碘液媒染，結(jié)晶紫就

25、與碘分子形成了一個分子量較大的染色較牢固的復合物。接著用95%酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，脫色后再用一種紅色染料如堿性番紅等進行復染，前者仍帶紫色，后者則被染上紅色。因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（G）。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)陰性反應。染色反應的主要依據(jù)就是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應不一樣?，F(xiàn)在一般認為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結(jié)晶紫的復合物結(jié)合很牢，不

26、易脫色，陰性菌復合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色。另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應；PH很低時，則可都呈負反應。此外，兩類菌的細胞壁等對結(jié)晶紫碘復合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應嚴格控制。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：）涂片干燥固定。涂片不宜過后，以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱否則會改變甚至破壞細胞形態(tài)

27、。）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘。）自來水沖洗。）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。）水洗，用吸水紙吸去水分。）加95%酒精數(shù)滴進行脫色，直至流出的乙醇無紫色，立即水洗，吸去水分。結(jié)果是否正確，這步是關(guān)鍵。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時間為2030秒。）番紅染色液（?。┤?分鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。染色的結(jié)果，革蘭氏陽性反應菌體都呈紫色，陰性反應菌體都呈紅色。證實實驗完成后就可以進行報告了，報告：根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN的檢索表(見表)，報告每100ml(g)大腸菌群的最近似數(shù)(MPN)。陽性管數(shù)MPN 100mL(g)1mL(g)×30.1

28、mL(g)×30.01mL(g)×300030001300026000390010300116001290表內(nèi)所列檢樣量如改用10、1、0.1時，則表內(nèi)數(shù)字應相應降低10倍；如改用0. 1、0.01、0.001時，則表內(nèi)數(shù)字應相應增加10倍。標準中還提到了糞大腸菌群的檢出，它從屬于大腸菌群，我在這里簡單地給大家提一下，用接種環(huán)將前面講述的操作中所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于EC肉湯中，置44.5±0.2水浴箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,培養(yǎng)后不產(chǎn)氣則報告為陰性；將產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于EMB上，培養(yǎng)1824h，凡平板上有典型菌落者，則證實為糞大腸菌群陽性

29、。報告同上。 微生物檢驗還有兩個重要指標就是霉菌、酵母的計數(shù)及致病菌的檢驗，因為企業(yè)的出廠檢驗微生物這塊主要是菌落總數(shù)和大腸菌群，所以后兩個指標我就給大家簡單介紹一下，讓大家了解一下。霉菌和酵母的培養(yǎng)可以使用同一種培養(yǎng)基，通過長出的菌落形態(tài)特征來判斷計數(shù)，霉菌最顯著的特征就是一般有菌絲，不規(guī)則無固定大小，最初往往是白色或淺色，當長出孢子后就成好多顏色，像紅色、綠色、黑色等等。而酵母菌一般比較光滑，隆起，多為乳白色，少數(shù)有紅色，與細菌菌落特征相似。一般使用的培養(yǎng)基是孟加拉紅，檢樣操作和前面一樣，但是培養(yǎng)霉菌要求稀釋樣品要充分振搖30min以上，還要反復吹吸50次，一是霉菌孢子充分散開。檢樣完畢后

30、選擇合適的稀釋度，取1mL稀釋液加到平板內(nèi)，加入培養(yǎng)基待凝固后倒置放入2528的培養(yǎng)箱內(nèi)，3天后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5天。然后選擇菌落數(shù)在10150之間的進行報數(shù)，稀釋度的選擇及菌落的報告方式都可參照菌落總數(shù)報出方式。我們再來說說致病菌的檢驗，主要的是三種沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌。我們以沙門氏菌為例簡單的介紹一下操作，致病菌的檢測第一步都要進行增菌，將25g樣品加入到225mL緩沖蛋白胨水（BP）中于36±1培養(yǎng)4h,取10mL加入到100mL四硫酸鈉煌綠增菌液(TTB)內(nèi)于42培養(yǎng)18h24h,同時，另取10mL于100mL亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液內(nèi)于36±

31、1培養(yǎng)18h24h。分離，取增菌液劃線接種一個亞硫酸鉍（BS）瓊脂和一個HEKTOEN氏腸道菌（HE）瓊脂上，于36±1培養(yǎng)18h24h，BS 上培養(yǎng)4048h。根據(jù)沙門氏菌在每種培養(yǎng)基上菌落形態(tài)挑取典型的可疑菌落(BS上產(chǎn)硫化氫的菌落呈褐色，灰色或黑色，有時帶有金屬光澤。有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變；HE上菌落呈蘭綠至蘭色，帶或不帶黑色中心。許多沙門氏菌培養(yǎng)物可呈現(xiàn)大的光澤黑色中心或幾乎全部黑色的菌落，多數(shù)產(chǎn)硫化氫)進行生化試驗接種到三糖鐵上，于36±1培養(yǎng)18h24h，通過在TSI內(nèi)的反應來判定，然后進一步進行血清學的鑒定。我們都知道微生物的檢

32、測最主要的就是要保證無菌操作，只有這樣才能保證出具數(shù)據(jù)的真實性和可靠性。下面講的內(nèi)容就是怎樣做才能保證數(shù)據(jù)的準確。首先我們來區(qū)別兩個概念，消毒和滅菌這兩個詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營養(yǎng)體的方法，而滅菌是指用物理和化學方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微生物，使之呈無菌狀態(tài)。從概念中我們就能看出來我們在做微生物的試驗是要進行前期的滅菌工作，而不是簡單的消毒。我們就來看看通常采用地滅菌方法：一、物理方法：有高溫、輻射、超聲波、激光、過濾等等，在實驗室中最常用的就是高溫滅菌和輻射滅菌。1、高溫利用高溫進行滅菌、消毒或防腐，是最常用

33、而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，不光是高溫可以殺菌，通常低溫也可以起抑菌作用，所以我們可以把預先配好的培養(yǎng)基放到冰箱里進行保存。高溫滅菌包括干熱滅菌法和濕熱滅菌法，在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因為一方面濕熱易于傳遞熱量，另一方面由于濕熱更易破壞保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的氫鍵結(jié)構(gòu)，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。）干熱滅菌法:a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及放培養(yǎng)基的瓶口，檢樣使用的剪子鑷子等。b.干熱空氣滅菌法：即把待滅菌的物品均勻地放入

34、烘箱中，升溫至160°C，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。這一般這可以用來烘干滅好菌的平板和吸管。）濕熱滅菌法:多數(shù)細菌和真菌的營養(yǎng)細胞在60左右處理510分鐘即可殺死，酵母菌和真菌的孢子稍耐熱些，要用80以上處理才能殺死，而細菌的芽孢最耐熱，一般要在120下處理15分鐘才能殺死。這就是為什么器皿及蒸餾水的滅菌都要在121高壓滅菌15分鐘以上，而一般的培養(yǎng)基滅菌也都采用121高壓滅菌15分鐘。濕熱滅菌法包括常壓法和加壓法。常壓法：a.巴氏消毒法：有些食物會因高溫破壞營養(yǎng)成分或影響質(zhì)量，如牛奶、醬油、啤酒等，所以只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持食物

35、的營養(yǎng)和風味，又進行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一般在6085處理15秒至30分鐘既可達到消毒目的。此法為法國微生物學家巴斯德首創(chuàng)，故名為巴氏消毒法。b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸數(shù)分鐘，即可殺死細菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。c.間歇滅菌法：適用于不耐熱培養(yǎng)基的滅菌。具體做法是：將待滅菌的培養(yǎng)基在80100°C蒸煮1560分鐘，殺死其中所有微生物的營養(yǎng)細胞。然后置室溫或放入37°C恒溫箱中過夜，誘導殘留的芽孢發(fā)芽。第2天再重復上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的。此法不需加壓滅菌鍋，但操作麻煩，所需時間長。加壓法：常

36、規(guī)加壓滅菌法和連續(xù)加壓滅菌法 常規(guī) 加壓滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測和微生物學實驗室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。常規(guī)加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個可密閉的盛有適量水的加壓蒸汽滅菌鍋中，把鍋內(nèi)的水加熱煮沸，并把其中原有的空氣徹底驅(qū)盡后將鍋密封。再繼續(xù)加熱就會使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，從而溫度也隨之提高到100以上。在蒸汽壓達到1kg/厘米2時即0.1MPa，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達到121°C。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在1520分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土

37、、石蠟油等面積大、含菌多、傳熱差的物品，則應適當延長滅菌時間。在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個問題是，在恒壓之前，一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應關(guān)系，這樣會大大降低滅菌效果。2影響加壓蒸汽滅菌的因素a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏感性不同。多數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在5065°C，10分鐘就會被殺死；但各種孢子、特別是細菌芽孢最能抗熱，要在121°C，15分鐘才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏感。b.微生物的數(shù)量多少顯然會影響滅菌的效果，數(shù)量越多，熱死時間越長。c.滅菌對象PH的影響 PH6.08.0時，微

38、生物較不易死亡；PH6.0時，最易引起死亡。d.滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度的影響 原理是在驅(qū)盡鍋內(nèi)空氣的前提下，通過加熱把密閉鍋內(nèi)純水蒸汽的壓力升高而使蒸汽溫度相應提高，也就是說是依靠溫度而不是壓力達到滅菌的目的。因此，在一切利用加壓蒸汽滅菌法的場合下，必須做到徹底排除滅菌鍋內(nèi)的殘余空氣。e.滅菌對象的體積 滅菌對象體積的大小會影響熱的傳導速率。3滅菌對培養(yǎng)基成分的影響 除對培養(yǎng)基中的淀粉成分有促進糊化和水解等少數(shù)有利影響外，很多是不利因素：a.pH值改變，普遍下降。b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這主要是由于一些離子發(fā)生化學反應而產(chǎn)生混濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。c.破壞營養(yǎng)，

39、提高色澤，不少培養(yǎng)基顏色加深。d.體積和濃度有所變化，降低濃度氣溫低時會增加冷凝水。可以采用特殊加熱滅菌的方法消除有害影響，像對含有在高溫下易破壞成分的培養(yǎng)基，如含糖組合培養(yǎng)基，可進行低壓滅菌15分鐘，所以像我們培養(yǎng)大腸菌群所用的乳糖膽鹽培養(yǎng)基就是采用了1150.07MPa左右滅菌15分鐘。、輻射利用輻射進行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學藥劑消毒的缺點，所以應用越來越廣，目前主要應用在以下幾個方面：）像微生物實驗室、超凈工作臺都應用紫外燈殺菌。避免紫外燈的照射，打開時人員要離開。）還有應用射線作食品表面殺菌，射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延

40、長。、過濾采用機械方法，設(shè)計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學成分。但是比細菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時會給實驗帶來一定的麻煩。二、化學方法一般化學藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生物生長繁殖的藥物，稱為防腐劑。但是一種化學藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區(qū)分。消

41、毒劑在低濃度時也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消毒防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和周圍環(huán)境的消毒。常用的化學消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。像在做試驗時可以用75%的酒精對手進行消毒。為了保證滅好菌的器皿和培養(yǎng)基不被污染都要將口包好密封，而且為了避免微生物的滋生和繁殖，做完實驗的器具必須先進行滅菌再洗刷?？傊⑸餀z驗既要保證環(huán)境的無菌又要保證操作規(guī)范不引入外來菌。我想在座的各位其中應該有罐頭生產(chǎn)企業(yè)，罐頭的微生物檢驗要求商業(yè)無菌，那我簡單的介紹一下商業(yè)無菌

42、的檢測。首先打開一罐測一下PH值，PH值等于或小于4.6的為酸性罐頭，大于4.6的為低酸性罐頭，然后最少取3罐進行保溫，低酸型于36±1保溫10天，酸性的于30±1保溫10天。保溫過程中每天觀察，如有胖聽或泄漏等現(xiàn)象，立即剔出作開罐檢查。胖聽是由于罐頭內(nèi)微生物活動或化學作用產(chǎn)生氣體，形成正壓，使一端或兩端外凸的現(xiàn)象。泄漏是罐頭密封結(jié)構(gòu)有缺陷，或由于撞擊而破壞密封，或罐壁腐蝕而穿孔致使微生物侵入的現(xiàn)象。開罐檢查包括PH測定，看與開始時有否顯著差異；感官檢查，外觀、色澤、狀態(tài)、氣味等進行觀察和嗅聞、用餐具按住食品或戴薄紙?zhí)滓允种赣|感，鑒別是否腐敗變質(zhì)。對感官或PH檢查結(jié)果認為可

43、疑的，進行涂片染色鏡檢。若是出現(xiàn)胖聽、泄漏或開罐檢查發(fā)現(xiàn)PH、感官異常、腐敗變質(zhì)，進一步鏡檢發(fā)現(xiàn)有異常，均應及時進行微生物接種培養(yǎng)。以上就是我對食品中微生物檢測的一些總結(jié)和個人的理解和積累，希望對大家有所幫助。謝謝大家！ 第三節(jié)致病性微生物食品首先是應考慮其安全性，其次才是可食性和其他，食品中一旦含有致病性微生物，其安全性就隨之喪失，當然其食用性也不復存在了；各國的衛(wèi)生部門對致病性微生物都作了嚴格的規(guī)定，把它作為食品衛(wèi)生質(zhì)量的最重要的指標。一、食品中常見的致病性微生物食品生產(chǎn)是一個時間長、環(huán)節(jié)多的復雜過程?？傊c食品有直接和間接關(guān)系的致病性微生物都可能污染食品。（以乳制品為例）1、能引起人類

44、疾病和食物中毒的致病性微生物：沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。2、能產(chǎn)生毒襄并引起食物中毒的微生物：肉毒梭菌、葡萄球菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌，也包括一些真菌，都會產(chǎn)生毒素。二、食品中致病性微生物的檢驗1、致病性微生物的檢驗按照國家統(tǒng)一的方法進行檢驗。2、特例：在加工食品中能夠存活下來的致病性微生物注往受到了某種程度的損傷，它們會受到增菌液中抑制劑的影響而不能被檢測出來。因此，需要進行前增菌，以幫助致病菌恢復到正常狀態(tài)。前增菌的適宜方法和使用的培養(yǎng)基則因食品的理化性質(zhì)、加工方法不同而異。以檢驗沙門氏菌為例，干蛋品中的細菌用緩沖蛋白胨水進行前增菌，脫脂乳粉中的細菌用煌綠水進行前增菌

45、，全脂乳粉則用滅菌蒸餾水進行前增菌，椰子用乳糖肉湯，干酵母用胰酪胨大豆肉湯前增菌。第四節(jié)細菌相與食品衛(wèi)生的關(guān)系1、細菌相：指存在于某一物質(zhì)中的細菌種類及其相對數(shù)量的構(gòu)成。食品中的各種細菌就構(gòu)成了該食品的細菌相，水中的細菌構(gòu)成了水的細菌相。細菌相是對細菌的種類面言，在菌相中相對數(shù)量較大的一種或幾種細菌被稱為優(yōu)勢菌。2、嗜冷菌：這類細菌在接近0時生長得比較好，最適溫度為10一20，最高溫度在30一35。3、嗜溫菌：這類細菌都能在25氣40迅速生長，在55不生長。4、嗜熱菌：這類細菌生長范圍為4375，最適為50C一55C，在32C以下很難生長。嗜溫菌和嗜熱菌的一些細菌在生長溫度范圍上有重迭，產(chǎn)生芽

46、胞的細菌尤其如此。一、細菌相對食品衛(wèi)生質(zhì)量的影響1、新鮮畜禽肉的細菌相：主要是嗜溫菌，包括大腸菌群、腸球菌、金黃色葡萄球菌、魏氏梭菌和沙門氏菌等。新鮮肉類的細菌相以嗜溫菌為主，在溫度適宜時，嗜溫菌會大量繁殖造成肉的變質(zhì)，同時發(fā)生臭味；在冷藏條件下，嗜溫菌生長很慢甚至不生長，嗜冷菌開始大量繁殖，逐漸成為優(yōu)勢菌，最后會導致肉表面形成粘液并產(chǎn)生氣味；在冷凍條件下，所有的細菌都不再生長繁殖，因而可以較長期保存而不變質(zhì)。2、液體蛋晶的細菌相：主要是革蘭氏陰性菌，包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、變形菌屬和埃希氏菌屬等。3、鮮魚的細菌相以嗜冷菌為主，有假單胞菌屬、黃色桿菌屬和弧菌屬等。如在水產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)了沙門氏菌

47、，一般認為是外來污染，應對該產(chǎn)品的生產(chǎn)，加工過程進行分析、檢測，從而找到污染源。二、食品的正常菌相和細菌數(shù)量食品及原料都有正常的細菌相，它們因受多種因素的影響，其種類和數(shù)量有很大差別。1、鮮肉的細菌相以嗜溫菌為主，其次為嗜冷菌。加工良好的鮮肉細菌數(shù)為103個g左右，如加工不良會達到106個g，肉制品的細菌數(shù)約為103104個g，大腸菌群MPN為10102個100g，金黃色葡萄球菌為10-102個g。2、鮮蛋的細菌相以革蘭氏陽性球菌為主，革蘭氏陰性桿菌數(shù)量很少。3、液體蛋晶的細菌相是革蘭氏陰性菌，包括假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、變形菌屬和埃希氏菌屬，細菌數(shù)量一般為104106個g，大腸菌群為1031

48、05個100g，沙門氏菌為1100個g。、無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。圖5斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞志賀氏菌的檢驗一、增菌稱取檢樣25g，加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶內(nèi)，固體食品用均質(zhì)器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36培養(yǎng)68h。培養(yǎng)時間視細菌生長情況而

49、定，當培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微混濁時即應中止培養(yǎng)。二、分離和初步生化試驗取增菌液1環(huán)，劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個；另取1環(huán)劃線接種于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板各1個，于36培養(yǎng)1824h。 志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管。一般應多挑幾個菌落，以防遺漏，經(jīng)36培養(yǎng)1824h，分別觀察結(jié)果。下述培養(yǎng)物可以棄去：a.在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長的培養(yǎng)物；b.在1824h內(nèi)發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；c.不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的培養(yǎng)物；d.產(chǎn)氣的培養(yǎng)物；e.有動力的培養(yǎng)物；f.產(chǎn)生硫化氫的培養(yǎng)物。凡是乳糖、蔗

50、糖不發(fā)酵，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體)，無動力的菌株，可做血清學分型和進一步的生化試驗。三、血清學分型挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗。先用4種志賀氏菌多價血清檢查，如果由于K抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應將菌液煮沸后再檢查；如果呈現(xiàn)凝集，則用A1、A2、B群多價和D群血清分別試驗。如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的型和群抗原見表1。可先用群因子血清檢查，再根據(jù)群因子血清出現(xiàn)凝集的結(jié)果，依次選用型因子血清檢查。4種志賀氏菌多價血清不凝集的菌株，可用鮑氏多價1、2、3分別檢查，并進一步用115各型因子血清檢查。如果鮑氏多價血清不凝

51、集，可用痢疾志賀氏菌312型多價血清及各型因子血清檢查。四、進一步的生化試驗在做血清學分型的同時，應做進一步的生化試驗，即：葡萄糖銨西蒙氏檸檬酸鹽賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶pH7.2尿素KCN生長水楊苷和七葉苷的分解除宋內(nèi)氏菌和鮑氏13型為烏氨酸陽性外，志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。必要時還應做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物。已判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物，應進一步做5%乳糖發(fā)酵甘露醇棉子糖甘油的發(fā)酵靛基質(zhì)試驗志賀氏菌屬4個生化群的培養(yǎng)物，應符合該群的生化特性。但福氏6型的生化特性與

52、A群或C群相似。五、結(jié)果報告：綜合生化和血清學的試驗結(jié)果判定菌型并作出報告。 金黃色葡萄球菌的檢驗我們以SN標準中的最近似值(MPN)測定法來進行講解：這種方法適用于檢測認為帶有大量競爭菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的食品中的少量金黃色 葡萄球菌。 1、樣品制備：固體或半固體食品: 以無菌操作稱取25g樣品,放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均 質(zhì)杯內(nèi),于8000r/min均質(zhì)12min,制成1:10樣品勻液。 液體食品: 用滅菌吸管吸取25mL樣品,放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi) (瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠),經(jīng)充分振搖制成1:10樣品勻液。 供計數(shù)檢驗時,可按十進位遞

53、增稀釋法將樣品勻液再進行適當稀釋。2、選三個連續(xù)稀釋度，從每個稀釋度分別取1 mL稀釋樣品液，接種3管含10氯化鈉why? 還記得么？ 金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長。 因此，這事實上是一種選擇性的增菌。胰蛋白胨大豆肉湯。樣品的最高稀釋度必須達到能獲得陰性終點,置36±1培養(yǎng)48 h。 3、用3 mm接種環(huán),從有細菌生長的各管中移取1 環(huán),劃線接種于表面干燥的Baird- Parker瓊脂平板,置36±1培養(yǎng)4548h。 4、從有細菌生長的每一平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌菌落,移種到肉湯培養(yǎng)基中,置36±1培養(yǎng)2024 h

54、。 5、取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗兔血漿于8mm×100mm試管內(nèi)充分混合,置 36±1培養(yǎng),定時觀察是否有凝塊形成,至少觀察6 h,以內(nèi)容物完全凝固,使試管倒置或 傾斜時不流動者為陽性。試驗中需同時做巳知陽性和陰性對照。對可疑結(jié)果,應進行革蘭氏染色、鏡檢和其他輔助試驗如耐熱核酸酶試驗等 加以證實。6、報告結(jié)果：根據(jù)凝固酶試驗結(jié)果查最近似值(MPN)表,報告金黃色葡萄球菌 的MPN/g (mL)。 志賀氏菌的生物學特性志賀氏菌屬（Shigella） 的細菌（通稱痢疾桿菌），是細菌性痢疾的病原菌人類對痢疾桿菌有很高的易感性。在幼兒可引起急性中毒性菌痢，死亡率

55、甚高。志賀氏菌和大腸桿菌都屬于腸桿菌科，根據(jù)DNA雜交研究結(jié)果表明，志賀氏菌屬的四個種和大腸桿菌屬在生化上是難以區(qū)分的，因為有產(chǎn)氣的志賀氏菌，也有乳糖陰性、不產(chǎn)氣、不運動的大腸桿菌，有些大腸桿菌也能引起痢疾狀的腹瀉。志賀氏菌的形態(tài)學特征：志賀氏菌屬細菌的形態(tài)與一般腸道桿菌無明顯區(qū)別，為革蘭氏陰性桿菌，長約2-3 m ,寬0.5-0.7 m 。不形成芽胞，無莢膜，無鞭毛，不運動，有菌毛。志賀氏菌的培養(yǎng)特性：需氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，最適溫度為37，最適pH為6.4-7.8。37培養(yǎng)18-24小時后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色、半透明、邊緣整齊，直徑約2nm，宋內(nèi)氏菌

56、菌落一般較大，較不透明，并常出現(xiàn)扁平的粗糙型菌落。在液體培養(yǎng)基中呈均勻渾濁生長，無菌膜形成。志賀氏菌的生化特性：本菌屬都能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。大多不發(fā)酵乳糖，僅宋內(nèi)氏菌遲緩發(fā)酵乳糖。靛基質(zhì)產(chǎn)生不定，甲基紅陽性，VP試驗陰性，不分解尿素，不產(chǎn)生H2S。根據(jù)生化反應可進行初步分類。志賀氏菌屬的細菌對甘露醇分解能力不同，可分為二大組。志賀氏菌的抗原構(gòu)造與分型：志賀氏菌屬細菌的抗原結(jié)構(gòu)由菌體抗原（O）及表面抗原（K）組成。主要抗原有三種。型特異性抗原、群特異性抗原、表面抗原（K抗原）。根據(jù)抗原構(gòu)造的不同，按最新國際分類法，將本屬細菌分為四個群、39個血清型（包括亞型）志賀氏菌的抵抗力：志賀氏菌屬在

57、外界環(huán)境中的生存力，以宋內(nèi)氏最強，福氏菌次之，志賀氏菌最弱。一般在潮濕土壤中能存活34天，37水中存活20天，在糞便內(nèi)（室溫）存活11天。日光直接照射30分鐘，56-6010分即被殺死，對高溫和化學消毒劑很敏感，1%石炭酸中15-30分鐘即被殺死，對氯霉素、磺胺類、鏈霉素敏感，但易產(chǎn)生耐藥性。志賀氏菌的變異性：S-R型變異：菌落可由光滑型變?yōu)榇植谛?，同時常伴有生化反應、抗原構(gòu)造和致病性的變異。在機體內(nèi)，尤其在慢性患者和恢復期患者，志賀氏菌可發(fā)生變異而失去原來的生化和抗原特性，成為不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通過10%膽汁肉湯等返祖為典型菌株。故在慢性患者或帶菌者糞便檢查時，對這類菌株要特別注意，必須多次反復檢查。因這對傳染源的發(fā)現(xiàn)及控制有重要意義。耐藥性