質(zhì)譜講義(AB)

1、 質(zhì) 譜(MS) mass spectrometry 質(zhì)譜法是將樣品離子化，變?yōu)闅鈶B(tài)離子混合物，并按質(zhì)荷比（m/z）分離的分析技術(shù);質(zhì)譜儀是實(shí)現(xiàn)上述分離分析技術(shù),從而測定物質(zhì)的質(zhì)量與含量及其結(jié)構(gòu)的儀器。質(zhì)譜分析法是一種快速,有效的分析方法,利用質(zhì)譜儀可進(jìn)行同位素分析,化合物分析,氣體成分分析以及金屬和非金屬固體樣品的超純痕量分析。在有機(jī)混合物的分析研究中證明了質(zhì)譜分析法比化學(xué)分析法和光學(xué)分析法具有更加卓越的優(yōu)越性，其中有機(jī)化合物質(zhì)譜分析在質(zhì)譜學(xué)中占最大的比重,全世界幾乎有3/4儀器從事有機(jī)分析, 現(xiàn)在的有機(jī)質(zhì)譜法，不僅可以進(jìn)行小分子的分析，而且可以直接分析糖，核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，在生物化

2、學(xué)和生物醫(yī)學(xué)上的研究成為當(dāng)前的熱點(diǎn)，生物質(zhì)譜學(xué)的時(shí)代已經(jīng)到來，當(dāng)代研究有機(jī)化合物已經(jīng)離不開質(zhì)譜儀。一.儀器概述1.基本結(jié)構(gòu) 質(zhì)譜儀由以下幾部分組成 供電系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 檢測接收器 數(shù)據(jù)系統(tǒng) 真空系統(tǒng)(1)進(jìn)樣系統(tǒng):把分析樣品導(dǎo)入離子源的裝置,包括:直接進(jìn)樣,GC,LC及接口,加熱進(jìn)樣,參考物進(jìn)樣等。(2)離子源:使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置,并對離子進(jìn)行加速使其進(jìn)入分析器，根據(jù)離子化方式的不同,有機(jī)常用的有如下幾種,其中EI,FAB最常用。 EI(Electron Impact Ionization):電子轟擊電離最經(jīng)典常規(guī)的方式,其他均屬軟電離，E

3、I使用面廣，峰重現(xiàn)性好，碎片離子多。缺點(diǎn)：不適合極性大、熱不穩(wěn)定性化合物，且可測定分子量有限，一般1,000。 CI(Chemical Ionization):化學(xué)電離核心是質(zhì)子轉(zhuǎn)移，與EI相比，在EI法中不易產(chǎn)生分子離子的化合物，在CI中易形成較高豐度的M+H+或M-H+等準(zhǔn)分子離子。得到碎片少，譜圖簡單，但結(jié)構(gòu)信息少一些。與EI法同樣，樣品需要汽化，對難揮發(fā)性的化合物不太適合。 原理 R + e- R+· + 2e- （電子電離）反應(yīng)氣為含H的 R為反應(yīng)氣體分子 R+· + R RH+ + (R-H)· 分子,例如異丁 M為樣品分子 RH+ + M R + (

4、M+H)+ (質(zhì)子轉(zhuǎn)移）烷,甲烷,氨氣, R濃度M濃度 R+· + M R + M+· （電荷交換）甲醇?xì)獾?R+· + M (R+M)+· （加合離子） FD(Field Desorption):場解吸大部分只有一根峰, 適用于難揮發(fā)極性化合物，例如糖,應(yīng)用較困難，目前基本被FAB取代。 FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轟擊利用氬,氙,80年代初發(fā)明,或者銫離子槍(LSIMS,液體二次離子質(zhì)譜 )，高速中性原子或離子對溶解在基質(zhì)中的樣品溶液進(jìn)行轟擊，在產(chǎn)生“爆發(fā)性”汽化的同時(shí)，發(fā)生離子-分子反應(yīng)，從而引發(fā)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，最終實(shí)現(xiàn)樣

5、品離子化。適用于熱不穩(wěn)定以及極性化合物等。FAB法的關(guān)鍵之一是，選擇適當(dāng)?shù)模ɑ|(zhì)）底物，從而可以進(jìn)行從較低極性到高極性的范圍較廣的有機(jī)化合物測定，是目前應(yīng)用比較廣的電離技術(shù)。不但得到分子量還能提供大量碎片信息。產(chǎn)生的譜介于EI與ESI之間,接近硬電離技術(shù)。生成的準(zhǔn)分子離子，一般常見M+H+ 和M+底物 +。另外：還有根據(jù)底物脫氫以及分解反應(yīng)產(chǎn)生的M-H_ 容易提供電子的芳烴化合物產(chǎn)生M+× 甾類化合物、氨基霉素等還產(chǎn)生M+NH4+ 糖甙、聚醚等一般可（產(chǎn)生）觀察到M+Na+ 由底物與粒子轟擊（碰撞）誘導(dǎo)發(fā)生還原反應(yīng)來產(chǎn)生M+nH+ (n>1),二量體（雙分子）M+H+M+及M+

6、H+B+等。因此，進(jìn)行譜圖解析時(shí)，要考慮底物和化合物的性質(zhì)，鹽類的混入等進(jìn)行綜合判斷。 ESI(Electrospray Ionization):電噴霧電離與LC,毛細(xì)管電泳聯(lián)用最好，亦可直接進(jìn)樣,屬最軟的電離方式，混合物直接進(jìn)樣可得到各組分的分子量。 APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大氣壓化學(xué)電離同上，更適宜做小分子。 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基體輔助激光解吸基質(zhì)輔助激光解吸電離是一種用于大分子離子化方法，利用對使用的激光波長范圍具有吸收并能提供質(zhì)子的基質(zhì)（一般常用小分子液體

7、或結(jié)晶化合物），將樣品與其混合溶解并形成混合體，在真空下用激光照射該混合體，基體吸收激光能量，并傳遞給樣品，從而使樣品解吸電離。MALDI的特點(diǎn)是準(zhǔn)分子離子峰很強(qiáng)。通常將MALDI用于飛行時(shí)間質(zhì)譜和FT-MS，特別適合分析蛋白質(zhì)和DNA等大分子。(3)質(zhì)量分析器:是質(zhì)譜儀中將離子按質(zhì)荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質(zhì)荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質(zhì)譜。(4)檢測接收器:接收離子束流的裝置,有:二次電子倍增器 光電倍增管 微通道板 (5)數(shù)據(jù)系統(tǒng):將接收來的電信號放大、處理并給出分析結(jié)果。包括外圍部分.例如終端顯示器,打印機(jī)等?，F(xiàn)代計(jì)算機(jī)接口,還可反過來控制質(zhì)譜儀

8、各部分工作。(6)真空系統(tǒng):由機(jī)械真空泵(前極低真空泵),擴(kuò)散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機(jī)組,抽取離子源和分析器部分的真空。只有在足夠高的真空下,離子才能從離子源到達(dá)接收器,真空度不夠則靈敏度低。(7)供電系統(tǒng):包括整個(gè)儀器各部分的電器控制部件，從幾伏低壓到幾千伏高壓。2.分類: 常見下列幾種: 雙聚焦扇形磁場-電場串聯(lián)儀器(sector) 四極質(zhì)譜儀(Q) 離子阱質(zhì)譜儀（TRAP） 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF)付利葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS) 混合型如四極+TOF,磁式+TRAP等 串列式多級質(zhì)譜儀(MS/MS) 三重四極 TOF+TOF3.分析原理: 磁質(zhì)譜基本公式： M

9、/Z=H2R2/2V M:質(zhì)量 Z:電荷 V:加速電壓 R:磁場半徑 H:磁場強(qiáng)度 磁質(zhì)譜經(jīng)典,可高分辨,質(zhì)量范圍相對寬;缺點(diǎn)是體積大,造價(jià)高,現(xiàn)在越來越少。 四極分析器quadrupole 是一種被廣泛使用的質(zhì)譜儀分析器。由兩組對稱的電極組成。電極上加有直流電壓和射頻電壓（±(U+Vcoswt)）。相對的兩個(gè)電極電壓相同，相鄰的兩個(gè)電極上電壓大小相等，極性相反。帶電粒子射入高頻電場中，在場半徑限定的空間內(nèi)振蕩。在一定的電壓和頻率下，只有一種質(zhì)荷比的離子可以通過四極桿達(dá)到檢測器，其余離子則因振幅不斷增大，撞在電極上而被“過濾”掉，因此四極分析器又叫四極濾質(zhì)器。利用電壓或頻率掃描，可以

10、檢測不同質(zhì)荷比的離子。優(yōu)點(diǎn)是掃描速度快,比磁式質(zhì)譜價(jià)格便宜,體積小,常作為臺式進(jìn)入常規(guī)實(shí)驗(yàn)室,缺點(diǎn)是質(zhì)量范圍及分辨率有限。 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀:利用相同能量的帶電粒子,由于質(zhì)量的差異而具有不同速度的原理,不同質(zhì)量的離子以不同時(shí)間通過相同的漂移距離到達(dá)接收器。 公式 M/Z=2E/v2 v=d/t 代入 M/Z=Kt2 E:離子動能 v:離子速度 d:飛行距離 t:飛行時(shí)間 K:常數(shù)=2E/d2優(yōu)點(diǎn):掃描速度快,靈敏度高,不受質(zhì)量范圍限制以及結(jié)構(gòu)簡單,造價(jià)低廉等. FT-MS:在射頻電場和正交橫磁場作用下,離子作螺旋回轉(zhuǎn)運(yùn)動,回旋半徑越轉(zhuǎn)越大,當(dāng)離子回旋運(yùn)動的頻率與補(bǔ)電場射頻頻率相等時(shí),產(chǎn)生回旋共振

11、現(xiàn)象,測量產(chǎn)生回旋共振的離子流強(qiáng)度,經(jīng)付立葉變換計(jì)算,最后得到質(zhì)譜圖。是較新的技術(shù),對于高質(zhì)量數(shù),高分辨率及多重離子分析,很有前途,但使用超導(dǎo)磁鐵需要液氦，不能接GC，動態(tài)范圍稍窄，目前還不太作為常規(guī)儀器使用。 離子阱Ion trap 通常由一個(gè)雙曲面截面的環(huán)形電極和上下一對雙曲面端電極構(gòu)成。從離子源產(chǎn)生的離子進(jìn)入離子阱內(nèi)后，在一定的電壓和頻率下，所有離子均被阱集。改變射頻電壓，可使感興趣的離子處于不穩(wěn)定狀態(tài)，運(yùn)動幅度增大而被拋出阱外被接收、檢測。用離子阱作為質(zhì)量分析器，不但可以分析離子源產(chǎn)生的的離子，而且可以把離子阱當(dāng)成碰撞室，使阱內(nèi)的離子碰撞活化解離，分析其碎片離子，得到子離子譜。離子阱不

12、但體積很小，而且具有多級質(zhì)譜的功能，即做到MSn，但動態(tài)范圍窄,低質(zhì)量區(qū)1/3缺失,不太適合混合物定量.多級質(zhì)譜聯(lián)用儀 現(xiàn)在，幾乎所有的商品質(zhì)譜儀上均配有GC-MS，但對難揮發(fā)、強(qiáng)極性和大分子量混合物，GC-MS無能為力，為了彌補(bǔ)GC-MS的不足，經(jīng)過20多年的探索，通過開發(fā)上述幾種軟電離技術(shù)，特別是ESI和APCI等，解決了LC與離子源接口問題（1987年完成），從而實(shí)現(xiàn)了LC-MS聯(lián)用，是分析化學(xué)的一次重大進(jìn)展，而串聯(lián)質(zhì)譜儀更具有許多優(yōu)點(diǎn)。串聯(lián)質(zhì)譜儀（MS/MS或Tamdem）:離子源第一分析器碰撞室第二分析室接收器 MS1 MS2 進(jìn)行MS/MS的儀器從原理上可分為兩類。第一類儀器利用質(zhì)

13、譜在空間中的順序，是由兩臺質(zhì)譜儀串聯(lián)組裝而成。即前面列出的串列式多級質(zhì)譜儀。第二類利用了一個(gè)質(zhì)譜儀時(shí)間順序上的離子儲存能力，由具有存儲離子的分析器組成，如離子回旋共振儀（ICR）和離子阱質(zhì)譜儀。這類儀器通過噴射出其它離子而對特定的離子進(jìn)行選擇。在一個(gè)選擇時(shí)間段這些被選擇的離子被激活，發(fā)生裂解，從而在質(zhì)譜圖中觀測到碎片離子。這一個(gè)過程可以反復(fù)觀測幾代碎片的碎片。時(shí)間型質(zhì)譜便于進(jìn)行多級子離子實(shí)驗(yàn)，但另一方面不能進(jìn)行母離子掃描或中性丟失。一般采用ESI、CI或FAB等軟離子化方法,以利于多產(chǎn)生分子離子,通過MS1的離子源使樣品離子化后，混和離子通過第一分析器,可選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子,進(jìn)入碰

14、撞室,室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(碰撞氣體：He、Ar、 Xe、CH4等)對所選離子進(jìn)行碰撞，發(fā)生離子分子碰撞反應(yīng)，從而產(chǎn)生子離子，再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子（掃描）質(zhì)譜（product ion spectrun）。一般稱做MS/MS-CID譜，或者簡稱為CID(collision-induced dissociation) 譜,碰撞誘導(dǎo)裂解譜，及MS/MS譜。另外，也有母找子離子的MS/MS譜，（MS/MS spreursor ion spectrum）研究MS/MS譜（一般指子離子質(zhì)譜，與在源內(nèi)裂解產(chǎn)生的正常碎片質(zhì)譜類似，但有區(qū)別，現(xiàn)不能檢索），可以了解到被分析樣品的混合物性質(zhì)和成分，

15、對一些混合物（目前，多用最軟電離的ESI或APCI的MS/MS。不必進(jìn)行色譜分離可直接分析，與色譜法相比，有很快的響應(yīng)速度，省時(shí)省樣品省費(fèi)用，具有高靈敏度和高效率的優(yōu)點(diǎn)。另外一個(gè)特點(diǎn)是通過子®母及母®子MS/MS譜可以掌握一定的結(jié)構(gòu)信息,做為目前有力的結(jié)構(gòu)解析手段。因此，現(xiàn)在利用串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行藥物研究越來越得到重視，特別是在藥物代謝以及混合物的微量成分分析和結(jié)構(gòu)測定等方面正在起到越來越重要的作用。比較常用的三級四極型MS/MS，聯(lián)用LC-MS/MS使用方便，操作簡單，適合于定量等常規(guī)，大型的MS/MS更適合結(jié)構(gòu)解析。4.儀器性能指標(biāo)(1)質(zhì)量范圍:表明一臺儀器所允許測量的質(zhì)

16、荷比,從最小到最大值的變化范圍.一般最小為2,實(shí)際10以下已經(jīng)無用.最大可達(dá)數(shù)萬,利用多電荷離子,實(shí)際能達(dá)上百萬。(2)分辨率(R):是判斷質(zhì)譜儀的一個(gè)重要指標(biāo),低分辨儀器一般只能測出整數(shù)分子量.高分辨率儀器可測出分子量小數(shù)點(diǎn)后第四位,因此可算出分子式,不需要進(jìn)行元素分析, 更精確。 R=M/M M為相鄰兩峰之一的質(zhì)量數(shù).M為差.例如:500與501兩個(gè)峰剛好分開.則R=500/1=500.若R=50000 則可區(qū)別開500與500.01。對于四極桿儀器,通常做到單位分辨,高低質(zhì)量區(qū)R數(shù)值不同.(3)靈敏度:有多種定義方法,粗略地說是表示所能檢查出的最小量,一般可達(dá)到10-9-10-12克甚至

17、更低,實(shí)際還應(yīng)看信噪比。二.質(zhì)譜的表示法及解析譜圖法：橫坐標(biāo)代表質(zhì)量數(shù),縱坐標(biāo)代表峰強(qiáng)度,是該質(zhì)量離子的多寡的表示.常用,直觀,但不太細(xì)致.還分為連續(xù)譜和棒狀圖兩種，一般EI棒圖多,ESI連續(xù)譜多。 列表法:質(zhì)量數(shù),相對豐度. 高分辨表示法:列表 元素組成實(shí)測質(zhì)量 理論質(zhì)量 C H O N···誤差(PPM) 相對豐度(%)322.1094 322.1079 19 16 4 1 -4.6 100 322.1106 22 14 1 2 3.7 309.1358 309.1365 19 19 3 1 2.2 80···1.幾個(gè)術(shù)語: 質(zhì)荷

18、比M/Z:一般Z為1,故M/Z也就認(rèn)為是離子的質(zhì)量數(shù),蛋白質(zhì)等易帶多電荷,Z>1。在質(zhì)譜中不能用平均分子量計(jì)算離子的化學(xué)組成,例如:不能用氯的平均分子量35.5,而用35和37。同理,溴也是如此,79和81,無80。在質(zhì)譜圖中,根本不會出現(xiàn)35.5的峰。一氯苯的分子峰應(yīng)是112和114而不是113。相對豐度:以質(zhì)譜中最強(qiáng)峰為100%(稱基峰),其他碎片峰與之相比的百分?jǐn)?shù)。 總離子流(TIC):即一次掃描得到的所有離子強(qiáng)度之和,若某一質(zhì)譜圖總離子流很低,說明電離不充分,不能做為一張標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖。 動態(tài)范圍:即最強(qiáng)峰與最弱峰高之比.早期儀器窄,現(xiàn)代計(jì)算機(jī)接收寬。若太窄,會造成有多個(gè)強(qiáng)峰出頭,都

19、成為基峰,而該要的(常為分子峰)卻記錄不出來。這樣的圖也是不標(biāo)準(zhǔn)的,檢索、解析起來都很困難。 本底:未進(jìn)樣時(shí),掃描得到的質(zhì)譜圖,空氣成分,儀器泵油,FAB底物，ESI緩沖液，色譜聯(lián)用柱流失及吸附在離子源中其他樣品。 因有以上三點(diǎn),故要控制進(jìn)樣量及放大器放大倍數(shù),還要扣除本底,以得到一張標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)譜圖。 質(zhì)量色譜圖/Mass chromatogram和 質(zhì)量色譜法/Mass chromatography (MC) 又叫提取離子色譜圖/ extract ion chromatography ：是質(zhì)譜法處理數(shù)據(jù)的一種方式。在GC/MS或LC/MS中，選定一定的質(zhì)量掃描范圍，按一定的時(shí)間間隔測定質(zhì)譜數(shù)據(jù)

20、并將其保存在計(jì)算機(jī)中。然后可以用各種辦法調(diào)出質(zhì)譜數(shù)據(jù)。如果要觀察特定質(zhì)量與時(shí)間的關(guān)系，可以指定這個(gè)質(zhì)量，計(jì)算機(jī)將以指定離子的強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以時(shí)間作為橫坐標(biāo)，表示質(zhì)量與時(shí)間的關(guān)系。這種方法叫做質(zhì)量色譜法。得到的圖叫做質(zhì)量色譜圖或提取離子色譜圖。2.離子的種類(1)分子離子M+·，也有用M+.的。中性分子丟失一個(gè)電子時(shí),就顯示一個(gè)正電荷,故用M+·。 在EI中,繼續(xù)生成碎片離子,在CI,FD,FAB等電離方法中,往往生成質(zhì)量大于分子量的離子如M+1,M+15,M+43,M+23,M+39,M+92.稱準(zhǔn)分子離子,解析中準(zhǔn)分子離子與分子離子有同樣重要的作用。(2)碎片離子:電離后

21、,有過剩內(nèi)能的分子離子,會以多種方式裂解,生成碎片離子,其本身還會進(jìn)一步裂解生成質(zhì)量更小的碎片離子,此外,還會生成重排離子。碎片峰的數(shù)目及其豐度則與分子結(jié)構(gòu)有關(guān),數(shù)目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩(wěn)定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。如果將質(zhì)譜中的主要碎片識別出來,則能幫助判斷該分子的結(jié)構(gòu)。(3)多電荷離子 指帶有2個(gè)或更多電荷的離子,有機(jī)小分子質(zhì)譜中,單電荷離子是絕大多數(shù),只有那些不容易碎裂的基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)-如共軛體系結(jié)構(gòu)-才會形成多電荷離子.它的存在說明樣品是較穩(wěn)定的.對于蛋白質(zhì)等生物大分子,采用電噴霧的離子化技術(shù),可產(chǎn)生帶很多電荷的離子,最后經(jīng)計(jì)算機(jī)自動換算成單質(zhì)/

22、荷比離子。(4)同位素離子 各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現(xiàn)在質(zhì)譜中,這對于利用質(zhì)譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便,在前面M/Z提到過,如氯35和37,后面還要講,還可利用穩(wěn)定同位素合成標(biāo)記化合物,如:氘等標(biāo)記化合物,再用質(zhì)譜法檢出這些化合物,在質(zhì)譜圖外貌上無變化,只是質(zhì)量數(shù)的位移,從而說明化合物結(jié)構(gòu),反應(yīng)歷程等。(6)負(fù)離子 通常堿性化合物適合正離子,酸性化合物適合負(fù)離子,某些化合物負(fù)離子譜靈敏度很高,可提供很有用的信息。3.由質(zhì)譜推斷化合物結(jié)構(gòu) 質(zhì)譜是一種語言,但需要翻譯.與其他類型譜圖比較,學(xué)習(xí)如何由質(zhì)譜圖識別一個(gè)簡單分子要容易得多。質(zhì)譜圖直接給出分子及其碎片的質(zhì)

23、量,因此化學(xué)家不需要學(xué)習(xí)任何新的知識。與解數(shù)學(xué)難題相似,例如水的質(zhì)譜圖,一看便知。但并不是隨意拼湊質(zhì)量數(shù),是有規(guī)律可循的。如何看質(zhì)譜圖同位素峰C13下面四張質(zhì)譜圖分別為EI,CI,FAB,ESI源得到的結(jié)果,可看出差異很大. (1)確定分子離子,即確定分子量 氮規(guī)則:含偶數(shù)個(gè)氮原子的奇電子離子,其質(zhì)量數(shù)是偶數(shù),含奇數(shù)個(gè)氮原子的奇電子離子,其質(zhì)量數(shù)是奇數(shù)。 與高質(zhì)量碎片離子有合理的質(zhì)量差,凡質(zhì)量差在314和21,25之間均不可能,則說明是碎片或雜質(zhì)。(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學(xué)式 低分辨,利用元素的同位素豐度,元素按同位素豐度可分三大類:A;A+1;A+2;A+2元素是容易識別的,

24、參見元素的同位素豐度表。計(jì)算時(shí)注意: a.用最高質(zhì)量數(shù),如果太弱則用強(qiáng)的不受其他峰干擾的碎片峰。 b.元素原子個(gè)數(shù)多于1的,由同位素豐度計(jì)算出各種元素的原子數(shù),例如(圖) c.若同時(shí)含A+1和A+2元素,則A+2元素的A-1峰會對A+1元素峰有貢獻(xiàn),應(yīng)扣除。 d.一定質(zhì)量范圍內(nèi),元素組成是有限的,不是任意組合的。例如CH之比,最高CnH2n+2最低通常1/2n,除甲酸CH2O2草酸C2H2O4極個(gè)別小分子,O一般與C數(shù)相等,N規(guī)則:M若奇數(shù),必含N且含奇數(shù)個(gè)N,M若偶數(shù),不含N或含偶數(shù)個(gè)N,18不可能是CH6。 如果有了高分辨數(shù)據(jù),更方便,但也會有誤差,通常允許誤差在10ppm,故前邊的規(guī)則也

25、是有用的。(3)峰強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)的關(guān)系 豐度大反映離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,在元素周期表中自上而下,自右至左,雜原子外層未成鍵電子越易被電離,容納正電荷能力越強(qiáng),S>N>O,n>>,含支鏈的地方易斷,這同有機(jī)化學(xué)基本一致,總是在分子最薄弱的地方斷裂。(5)各類有機(jī)物的裂解方式(略) 不同類型有機(jī)物有不同的裂解方式,相同類型有機(jī)物有相同的裂解方式,只是質(zhì)量數(shù)的差異,需要經(jīng)驗(yàn)記憶,很有用。這里的裂解規(guī)律，均是EI譜經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，質(zhì)譜解析的一般步驟，也由EI譜歸納而來，并非絕對。4.質(zhì)譜解析的一般步驟(適于低分辨小分子譜圖,若已經(jīng)高分辨得到元素組成更好)(1)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的

26、失真,考慮操作條件是否適當(dāng),是哪種離子化法的譜圖，是否有基質(zhì)的峰存在，有否二聚體峰等。樣品編號避免1,2,3等過于簡單,最好用英文字母和阿拉伯?dāng)?shù)字組合,以防混淆出錯(cuò)。(2)綜合樣品其他知識,例如熔點(diǎn),沸點(diǎn),溶解性等理化性質(zhì),樣品來源,光譜,波譜數(shù)據(jù)等。多數(shù)情況下可給出明確的指導(dǎo)方向。所以送樣時(shí)要將已知數(shù)據(jù)寫清。(3) 盡可能判斷出分子離子。(4) 假設(shè)和排列可能的結(jié)構(gòu)歸屬:高質(zhì)量離子所顯示的,在裂解中失去的中性碎片,如M-1,M-15,M-18,M-20,M-31.,意味著失H,CH3,H2O,HF,OCH3.(5)假設(shè)一個(gè)分子結(jié)構(gòu),與已知參考譜圖對照,或取類似的化合物,并作出它的質(zhì)譜進(jìn)行對比

27、。目前計(jì)算機(jī)自動檢索還不完善,尤其是ESI等譜圖,因操作條件很難完全一致,不是絕對準(zhǔn)確,還要看是否符合生源等其他特征，而且許多天然產(chǎn)物，合成的新化合物譜庫中沒有。三.有機(jī)質(zhì)譜的特點(diǎn)與應(yīng)用1.優(yōu)點(diǎn):(1)定分子量準(zhǔn)確,其它技術(shù)無法比。(2)靈敏度高,常規(guī)10-710-8g,單離子檢測可達(dá)10-12g。(3)快速,幾分甚至幾秒。(4)便于混合物分析,GC/MS,LC/MS,MS/MS對于難分離的混合物特別有效,如藥物代謝產(chǎn)物,中草藥中微量有效成分的鑒定等,其它技術(shù)無法勝任。(5)多功能,廣泛適用于各類化合物。X-RAY要求好的結(jié)晶,NMR要溶。2.局限性:(1)異構(gòu)體,立體化學(xué)方面區(qū)分能力差。(2

28、)重復(fù)性稍差,要嚴(yán)格控制操作條件。所以不能象低場NMR,IR等自己動手,須專人操作(3)有離子源產(chǎn)生的記憶效應(yīng),污染等問題。(4)價(jià)格昂貴,操作復(fù)雜。 所以與其他分析方法配合,能發(fā)揮更大作用,可以先做一下質(zhì)譜,提供指導(dǎo)信息,如結(jié)構(gòu)類型,純度等。3.應(yīng)用(1)有機(jī)化工a.合成中原料及產(chǎn)品雜質(zhì)分析LC/MSb.中間步驟監(jiān)測c.反應(yīng)機(jī)理的研究(2)石油(3)環(huán)保 樣品還需進(jìn)行前處理，并非全都能直接進(jìn)入質(zhì)譜a.農(nóng)藥殘毒檢測b.大氣污染c.水分析d.特定成分定量測定,單離子和多離子檢測,靈敏度可達(dá)10-12g,借助于內(nèi)標(biāo)或標(biāo)定曲線,可定量,在痕量分析中非常有用。(4)食品、香料a.酒：判斷真酒假酒,有無

29、害,GC/MS是唯一客觀準(zhǔn)確的。b.化妝品中除基料外,香料起關(guān)鍵性作用,通過MS,找出天然產(chǎn)物中有效成分后合成。(5)生化、醫(yī)藥a.蛋白質(zhì),多肽研究,前沿生命科學(xué),FAB,ESI等,可測幾十萬分子量的生物大分子，定氨基酸序列,十幾個(gè)肽,比氨基酸分析儀快且準(zhǔn)。b.天然產(chǎn)物,這也是最重要的內(nèi)容之一,例如生物合成研究室拿到一個(gè)樣品,據(jù)NMR推出的結(jié)構(gòu)與MS圖不符,元素分析也對不上號,從MS上看到有S元素,而元素分析未做S,故不對,NMR因其他干擾,所以H數(shù)也不對,碳譜少一個(gè)C，后來根據(jù)MS，重新?lián)Q了NMR溶劑，才使C數(shù)吻合，用計(jì)算機(jī)檢索標(biāo)準(zhǔn)MS譜庫,得到正確的結(jié)構(gòu)式。還有一個(gè)例子，植物化學(xué)研究室提取

30、出一新化合物，質(zhì)譜上有很強(qiáng)的72峰，表示含有氮甲基，而從核磁上看不到，只根據(jù)NMR定出了錯(cuò)誤的結(jié)構(gòu)，后來因?yàn)橘|(zhì)譜顯示出的無法否定的證據(jù)，將此化合物重新進(jìn)行堿化處理，再做NMR，才與質(zhì)譜吻合，定出了正確的結(jié)構(gòu)。(6)法醫(yī)、毒化體液,代謝物等,興奮劑檢測,質(zhì)譜圖是必要的證據(jù)之一。 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 李立軍 色譜是快速靈敏分離有機(jī)物的有效手段，各種檢測器中，除了應(yīng)用最廣泛的 FID（GC）和UV（LC）外，質(zhì)譜（MS）盡管價(jià)格較昂貴，但是其選擇性、靈敏度、分子量及結(jié)構(gòu)信息等優(yōu)勢，已被公認(rèn)為高級的通用型檢測器，把它與各種分離手段聯(lián)用，將定性、定量結(jié)果有機(jī)地結(jié)合在一起，一直是人們所研究的目標(biāo)。 GC

31、MS在我國已有 20多年的應(yīng)用歷史，隨著臺式小型儀器迅速增長，在色譜研究中已經(jīng)成為重要的手段，氣相色譜質(zhì)譜技術(shù)成熟運(yùn)用至今，人們越來越不滿足僅僅分析那些具有揮發(fā)性和低分子量的化合物，面對日益增加的大分子量（特別是蛋白，多肽等）和不揮發(fā)化合物的分析任務(wù)，迫切需要用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用解決實(shí)際間題。與氣相色譜相比，液相色譜的分離能力有著不可比擬的優(yōu)勢，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)為人們認(rèn)識和改造自然提供了強(qiáng)有力的工具。HPLC可以直接分離難揮發(fā)、大分子、強(qiáng)極性及熱穩(wěn)定性差的化合物，LCMS聯(lián)機(jī)曾長期為分析界所期待，由于LC流動相與MS傳統(tǒng)電離源的高真空難以相容，還要在溫和的條件下使樣品帶上電荷而樣品本身不分解

32、，大量的樣品不得不采取脫機(jī)方式 MS鑒定，或制成衍生物用 GCMS分析。經(jīng)過努力相繼出現(xiàn)了多種液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用接口，實(shí)現(xiàn)了液相色譜質(zhì)譜的聯(lián)用。特別是大氣壓電離質(zhì)譜（APIMS）的實(shí)現(xiàn)為 LCMS的兼容創(chuàng)造了機(jī)會，商品化的小型 LCMS作為成熟的常規(guī)分析儀器在九十年代已經(jīng)在生物醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)室發(fā)揮著重要的作用。一 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用適用范圍 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的基本流程為：混合的樣品經(jīng)高效液相色譜柱分離后成為多個(gè)單一組分，依次通過液相色譜質(zhì)譜接口進(jìn)入質(zhì)譜儀的離子源，離子化后的樣品經(jīng)過質(zhì)量分析器分析后由檢測系統(tǒng)記錄，后經(jīng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)采集處理，得到帶有結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜圖。圖1 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的基本流程首先看看氣相

33、色譜質(zhì)譜聯(lián)用的特點(diǎn)：·要求樣品氣化后進(jìn)入質(zhì)譜儀·用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比·用毛細(xì)管色譜柱分離化合物，分高效率高·操作條件穩(wěn)定、使用方法成熟·適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的化合物液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用主要可解決如下幾方面的問題： 不揮發(fā)性化合物分析測定； 極性化合物的分析測定； 熱不穩(wěn)定化合物的分析測定； 大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等）的分析測定；附圖清楚地表明了各種接口技術(shù)的適用范圍。二液相色譜質(zhì)譜接口的發(fā)展 起步于70年代，先后研究出27種接口 1傳送帶（MB）LCMS接口方式 七十年代末采用傳送帶方式

34、與MS傳統(tǒng)的EI，CI離子源相聯(lián)。靈敏度差，不能用反相柱，待測樣品必須汽化后再電離。中國至少買了8臺，現(xiàn)已淘汰。 2熱噴霧（TS） 產(chǎn)生于八十年代中期，不僅是LCMS接口，也是軟電離方式，熱噴霧時(shí)LC流出液經(jīng)過高溫加熱而超高速噴霧，產(chǎn)生的離子進(jìn)入MS，中性分子由真空泵抽走。TS只能獲得與分子量有關(guān)的信息。在熱噴射過程中會使熱不穩(wěn)定化合物分解，在一定程度上被API取代。 3粒子束（ PB） 利用溶劑與被分析物的動量差分離（與氣相色譜質(zhì)譜儀上的玻璃噴嘴分離器原理相似），進(jìn)入質(zhì)譜后用EI或CI方式電離，優(yōu)點(diǎn)是能提供傳統(tǒng)的EI和CI質(zhì)譜圖。 4連續(xù)流動快原子轟擊（CFFAB） 與靜態(tài)的快原子轟擊（FA

35、B）類似。 5大氣壓電離（API）（接口與電離相結(jié)合） 八十年代后期出現(xiàn)，大氣壓電離源顧名思義是一種常壓電離技術(shù)，在大氣壓下電離，僅把帶電離子“吸入”質(zhì)譜，不能提供經(jīng)典的質(zhì)譜圖。目前大氣壓電離特指：電噴霧（ESI），離子噴霧（IS）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）。由于它不需要真空、減少了許多設(shè)備，方便使用，而且有下面的優(yōu)點(diǎn)，因而在近年來得到了迅速的發(fā)展。 (1). 由于產(chǎn)生多電荷離子（在ESI和IS下），測定分子量可以達(dá)到10萬道爾頓以上 (2)靈敏度達(dá)fg-pg (3)適用于極性和離子型化合物 (4)進(jìn)樣方式多樣靈活 a）直接流動進(jìn)樣 b）與液相色譜聯(lián)用 c）與毛細(xì)管電泳聯(lián)用三接口原理1電噴霧

36、電離(ESI) 電噴霧電離是一種“軟”電離技術(shù)，ESIMS既可分析小分子也可分析大分子。對于分子量在 1000 Dalton（簡寫為 Da,現(xiàn)法定計(jì)量單位寫為u）以下的小分子，會產(chǎn)生MH+或M-H-離子，選擇相應(yīng)的正離子或負(fù)離子形式進(jìn)行檢測，就可得到物質(zhì)的分子量。此外，也可能源內(nèi)CID生成一些碎片，有利于提供樣品分子的結(jié)構(gòu)信息。而分子量高達(dá)20，000 u的大分子在 ESI-MS中常常生成一系列多電荷離子，通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)能夠得到樣品的分子量，準(zhǔn)確度優(yōu)于± 001 。(1)電噴霧機(jī)理電噴霧電離是在液滴變成蒸汽產(chǎn)生離子發(fā)射的過程中形成的，這種過程也稱為“離子蒸發(fā)”，如圖2所示。溶劑由泵

37、輸送從不銹鋼毛細(xì)管流出，由于它帶35kV高壓，與對應(yīng)極之間產(chǎn)生的強(qiáng)電場促使溶劑在毛細(xì)管出口端發(fā)生噴霧，產(chǎn)生帶強(qiáng)電荷的液體微粒，所以稱為電噴霧。隨著液體微粒中溶劑蒸發(fā)，離子向表面移動，表面的離子密度越來越大，最終逸出表面，蒸發(fā)進(jìn)入空間。所以離子形成的過程實(shí)際上是在大氣壓下發(fā)生的。(2)電噴霧離子源(離子噴霧)Includes IonSpray, TurboIonspray, NanoSpray 圖3是電噴霧離子源結(jié)構(gòu)的詳細(xì)示意圖。樣品溶液經(jīng)過內(nèi)徑75um、帶 34 kV高壓的不銹鋼毛細(xì)管進(jìn)入離子源，毛細(xì)管外有一個(gè)同軸套管，通入N2氣作為霧化氣抵達(dá)探頭端口的液滴。由于高壓和霧化氣的作用，使液滴生成

38、含樣品與溶劑離子的氣溶膠。同時(shí)，與噴霧針成一角度還通入加熱干燥的N2氣，進(jìn)一步除去溶劑,并有效防止儀器污染,整個(gè)電離和除溶劑過程都是在常壓下進(jìn)行。圖3 電噴霧離子源示意圖 調(diào)節(jié)錐體電壓可使離子源輸出的離子數(shù)達(dá)最佳條件，它通常以MH+或M-H-是否最佳來衡量。但是，增加錐體電壓會加速離子向錐體分離器移動。由于按質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)該區(qū)域仍處于高壓。樣品離子仍有可能與氣體或蒸汽分子碰撞而生成離子碎片。錐體電壓增加越大，離子碎裂也越加劇。這種效應(yīng)可產(chǎn)生反映樣品結(jié)構(gòu)信息的碎片，而且重現(xiàn)性好，還可用碎片離子準(zhǔn)確進(jìn)行物質(zhì)的定量分析。由此可產(chǎn)生裂片的功能稱為源內(nèi)CID（碰撞誘導(dǎo)分解）。2·大氣壓化學(xué)電離（He

39、ated Nebulizer或APCI） 圖4 APCI電離源示意圖樣品溶液經(jīng)過內(nèi)徑 100 um的熔融石英毛細(xì)管抵達(dá)加熱到設(shè)定溫度的探頭區(qū)，石英毛細(xì)管的外套管內(nèi)通入熱的N2霧化氣至毛細(xì)管口流出的液體，加熱的探頭與N2霧化氣的共同作用使流出液生成氣溶膠后蒸發(fā)。霧化氣管外還有一根同軸套管通N2屏敝氣。將蒸發(fā)的氣溶膠導(dǎo)入 APCI源。大氣壓化學(xué)電離源其余部份與電噴霧源相似，所不同的是簾板前還有一個(gè)放電尖端，放電尖端裝在一種Peek工程塑料上，其上加345 kV電壓（負(fù)離子檢測用 235 kV）。而噴霧毛細(xì)管不帶電壓。它們之間放電的能量使毛細(xì)管流出經(jīng)過離子源的溶劑分子發(fā)生電離。生成的離子還與其它溶劑

40、分子碰撞，每次碰憧均消耗能量生成低能氣態(tài)等離子。樣品分子通過等離子區(qū)域時(shí)，由于質(zhì)子轉(zhuǎn)移或試劑離子作用而電離。因而整個(gè)電離都在常壓下由化學(xué)溶劑作用而產(chǎn)生，所以稱為大氣壓化學(xué)電離。3電噴霧與大氣壓化學(xué)電離的比較 電噴霧電離與大氣壓化學(xué)電離在結(jié)構(gòu)上有很多相似之處，但也有不同的地方。掌握它們的差異對正確選擇不同電離方式用于不同樣品的分子量測定與結(jié)構(gòu)分析具有重要的意義。它們的主要差別是：·電離機(jī)理：電噴霧采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離，而APCI電離是放電尖端高壓放電促使溶劑和其他反應(yīng)物電離、碰撞、及電荷轉(zhuǎn)移等方式形成了反應(yīng)氣等離子區(qū)，樣品分子通過等離子區(qū)時(shí)，發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移而生成MH+或M-H

41、-離子。·樣品流速：APCI源允許的流量相對較大，可從02到2 mlmin，直徑46 mm的高效液相色譜（HPLC）柱可與APCI接口直接相連；而電噴霧源允許流量相對較小，最大只能為 10 mlmin，最低流速可小于 5ulmin，通常與 HPLC的微徑柱如2lmm或毛細(xì)管色譜柱相連。·斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，盡管熱能主要用于汽化溶劑與加熱N2氣，對樣品影響并不大，但對熱不穩(wěn)定的化合物就足以使其分解，產(chǎn)生碎片，而電噴霧源探頭處于常溫，所以常生成分子離子峰，不易產(chǎn)生碎片。·靈敏度：APCI與ESI源都能分析許多樣品，而且靈敏度相似，很難說出哪一種更合適。

42、同時(shí)至今沒有一個(gè)確切的準(zhǔn)則判斷何時(shí)使用某一種電離方式更好。但是通常認(rèn)為電噴霧有利于分析生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性較小的化合物。·多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子，所以不適合分析生物大分子。而ESI源特別適合于蛋白質(zhì)，多肽類的生物分子，由于它能產(chǎn)生一系列的多電荷離子。4 NanoFlow API接口專門設(shè)計(jì)的 NanoFlow API接口特別適合于做微量的生化樣品，其流速范圍可從 5nLmin到luLmin。一滴樣品就可做數(shù)小時(shí)的分析?？稍谧钚〉臉悠废牧肯芦@得最大靈敏度。靈敏度可高達(dá)fmole。并可直接與微孔HPLC聯(lián)用。5. 液相色譜一質(zhì)

43、譜各種聯(lián)用技術(shù)的比較表 LC/MS各種聯(lián)用技術(shù)的比較6. LC/MS與 LC/UV的比較 (圖)四LCMS對LC的要求 1ESI的最佳流速是150 ulmin，應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時(shí)要求柱后分流比l50，目前大多采用 l2 mm內(nèi)徑的微柱，并配置 0 1 100 ulmin的微量泵。采用毛細(xì)管 LC柱時(shí)，柱后必須補(bǔ)充一定的流量。 2APCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。 3LCMS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。含甲酸（或乙酸）2。含三氯乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸胺10一5 mmol/l。LC色譜柱生產(chǎn)商提供

44、了大量的文獻(xiàn)幫助色譜工作人員選擇流動相，但是這些資料并不包括最佳的LC分離。當(dāng)用API作為接口使LC與MS聯(lián)用時(shí)，磷酸鹽緩沖液不適合LCMS系統(tǒng)。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。 4總離子流（TIC）可以與UV圖相對照，基峰離子流（PBI）有時(shí)將更清晰地反映分離狀況，特征離子的質(zhì)量色譜在復(fù)雜混合物分析及痕量分析時(shí)是 LCMS測定中最有用的譜圖，它既有保留值信息，又具備化合物結(jié)構(gòu)的特征，抗化學(xué)干擾性能好，常用于定性定量。因此，為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時(shí)UV圖上并不能獲得完全分離）。 5樣品的預(yù)處理： （1）為什么要進(jìn)行樣品的預(yù)處理 認(rèn)為LCM

45、SMS不需要樣品預(yù)處理的理解是片面的·防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴·獲得最佳的分析結(jié)果 從ESI電離的過程分析： ESI電荷是在液滴的表面 樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競爭 不揮發(fā)物防礙帶電液滴表面揮發(fā) 帶電離子進(jìn)入氣相 大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài) 大量雜質(zhì)離子的存在增加電荷中和的可能 （2）樣品的預(yù)處理常用方法 a）超濾 b）溶劑萃取去鹽 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）凈化去鹽 e）色譜分離 反相色譜分離 親和技術(shù)分離五用大氣壓電離質(zhì)譜儀得到的分子量信息 分子離子是最有用的特征離子。 1.測定分子量的方式: ·對于極性化合物使用ESI方式

46、 正離子掃描 負(fù)離子掃描 正負(fù)離子交替掃描（磁式質(zhì)譜不適合） ·對于中性或弱極性化合物使用APCI方式 正離子方式常出現(xiàn)如下離子:-Na 22 Da. higher than M+H-K 38 Da. higher than M+H-Li 9 Da. higher than M+H-NH4 17 Da. higher than M+H-ACN 40 Da. higher than M+H2M+H,2M+Na等負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子:-TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background)-Acetate 60 Da. higher

47、then M-H-Formic 46 Da. higher then M-H-Cl 36 Da. higher than M-H2.影響分子量測定的因素 1）PH的影響 2）氣流和溫度 3）溶劑和緩沖液流量 4）溶劑和緩沖液的類型 5）選擇合適的液相色譜類型 6）合適的電壓 7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 8）雜質(zhì)的影響3根據(jù)多電荷離子計(jì)算分子量有些化合物，如蛋白質(zhì)類，經(jīng)常帶有多個(gè)電荷·質(zhì)譜儀分析荷質(zhì)比（mz），這些離子以“表觀”質(zhì)量數(shù)出現(xiàn)在質(zhì)譜圖上，既得到M1，M2，M3·相鄰兩個(gè)質(zhì)譜峰的電荷數(shù)差1，即n1=n21·設(shè)樣品的真實(shí)分子量為M·可以列出方程組： n1=n21 （l） (M + n1H)/n1 = M1 （2） (M + n2H)/n2 = M2， (3） M為真實(shí)分子量 H為質(zhì)子的質(zhì)量 n1，n2，為電荷數(shù) M1，M2為質(zhì)譜測得的離子的“表觀”質(zhì)量數(shù)解方程組，得到電荷數(shù)，進(jìn)而算出分子量Mn2=(M1-H)/(M2-M1)，(n2取最接近的整數(shù)）M =n2·（M2H）實(shí)際操作中，由計(jì)算機(jī)完成。4分子量測定中的誤判·溶劑中的雜質(zhì) 常見m/z 149，m/z 279的峰來自于塑料添加劑·樣品容器不干凈 常見表面活性劑的峰·進(jìn)樣系統(tǒng)污染·樣品在