3D多細胞腫瘤球的培養(yǎng)

1、3D多細胞腫瘤球的培養(yǎng)3D多細胞腫瘤球是在體外應(yīng)用組織培養(yǎng)方法使腫瘤細胞以多細胞集聚 體的形式生長成為具有三維結(jié)構(gòu)的球體。與傳統(tǒng)的2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，3D多細胞腫瘤球可以通過模擬三維細胞網(wǎng) 絡(luò)、細胞與基質(zhì)、 細胞與細胞之間的相互作用， 從而更加貼近腫瘤組織中相應(yīng)的 病理生理特征。因此，3D多細胞腫瘤球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應(yīng)用于干細胞培養(yǎng)和分化、 癌癥研究、 藥物和毒性篩選及組織工程等特定應(yīng)用中。雖然3D多細胞腫瘤球模型具有更顯著的實體腫瘤生理相關(guān)性，但是與2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對統(tǒng)一的 3D多細胞腫瘤球模型需要一系列的培養(yǎng) 過程和表征手段。本文利用Liquid OVerlay的

2、制備方法，以乳腺癌細胞MDA-MB-23和MCF-7為模 型制備3D多細胞腫瘤球并采用倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和環(huán)境掃描電鏡 對其進行詳細表征。1實驗前準備工作1. 提前24 h取12 mLDME和 RPM11640完全培養(yǎng)基（含10%FBS下同）于50 mL 離心管內(nèi)，置于4C冰箱中預(yù)冷；2將分裝好的Matrigel基質(zhì)膠提前24 h從-20C放入4C,使其融化成液體狀 態(tài)；3.將無菌的1 mL移液器槍頭放入無菌50 mL離心管內(nèi)，置-20C冰箱預(yù)冷瓊脂糖包被 96 孔板1.準確量取6 mL RPMl 1640培養(yǎng)基（或DME培養(yǎng)基）于2個10 mL的注射玻 璃瓶內(nèi)，加入90 mg瓊脂糖

3、，蓋塞后放入80C的水浴鍋內(nèi)加熱溶解30 min ;2.加熱結(jié)束后，將注射瓶放入滅菌鍋內(nèi)，115°C滅菌30 min ;3. 滅菌完成后，迅速取出注射瓶放入超凈臺內(nèi)。將注射瓶內(nèi)的瓊脂糖溶液倒入 無菌的加樣槽中，用多通道移液器以每孔 60 L的量加入96孔板內(nèi)。注意：由于瓊脂糖溶液在室溫時會凝固， 因此從滅菌鍋內(nèi)取出瓊脂糖溶液后一定要快速轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)并迅速加入至 96 孔板中。此外，為保證加樣時瓊脂糖不冷卻，需要同時滅菌加樣槽和100 L的移液器槍頭。4. 加入完成后， 96 孔板要保持水平約 30 min 使孔內(nèi)的瓊脂糖凝固3配置含 Matrigel 基質(zhì)膠細胞懸液1.取對數(shù)生長期

4、的MDA-MB-23細胞（或MCF-7細胞），胰蛋白酶消化后進行細 胞計數(shù)，用 RPMl 1640完全培 養(yǎng)基 （或DME完全培 養(yǎng)基） 將細胞懸液濃度調(diào)整 至 2.0×105 cells/mL ，備用。2. 將盛滿碎冰的燒杯噴完酒精后放入超凈臺內(nèi)，將 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基以及 解凍的 Matrigel 基質(zhì)膠從冰箱內(nèi)取出置于冰上。注意：由于 Matrigel 基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此在操作過程中一定要保持 低溫。3. 將預(yù)冷的移液器槍頭取出放置于超凈臺內(nèi)。根據(jù)計算量（ 2.5%，v/v ）用移液 器將 300 L Matrigel 基質(zhì)膠加入到 12 mL RPMI

5、1640 完全培養(yǎng)基內(nèi)，迅速混 勻。注意：由于 Matrigel 基質(zhì)膠在室溫下溶液凝固，因此使用的移液器槍頭也需要 預(yù)冷。4.加入步驟1中的細胞懸液（約600 L）,使細胞濃度為10000 cells/mL , 迅速混勻，備用；4將細胞懸液鋪入瓊脂糖包被的 96孔板1. 將上述步驟 4 中配置好的含有 Matrigel 基質(zhì)膠的細胞懸液放入加樣槽內(nèi), 用 多通道移液器吸取200 L加入到包被瓊脂糖的96孔板內(nèi)。2.采用低溫離心機進行離心，離心條件為 4C, 1000× g, 10 min注意：離心 96 孔板時為保持無菌,將 96 孔板的周圍用封口膜封住。3.離心完成后，取出96孔

6、板，摘下封口膜，噴灑酒精后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。整 個培養(yǎng)流程如圖1所示。4. 在培養(yǎng)的第3、5和7天，更換孔內(nèi)的100 L培養(yǎng)基并采用倒置顯微鏡觀察 腫瘤球的形態(tài)。025. 若要采用3D多細胞腫瘤球進行藥物試驗，在培養(yǎng) 7天后，用移液器取出孔內(nèi) 的100 L培養(yǎng)基，加入100 L給藥溶液，然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并定期米用 倒置顯微鏡觀察腫瘤球的生長狀況（圖 2）。3D多細胞腫瘤球的表征51.倒置顯微鏡觀察3D多細胞腫瘤球形態(tài)：直接將96孔板置于倒置顯微鏡下觀 察即可。2. 激光共聚焦顯微鏡觀察：用移液器小心取出孔內(nèi)的腫瘤球，用 PBS青洗3遍 后，采用4%多聚甲醛固定，并用HOeChSt 33258對細胞核