芍藥苷對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠外周血單個核細(xì)胞糖皮質(zhì)激素受體的影響

1、描述：研究芍藥苷（paeoniflorin，PF）對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）糖皮質(zhì)激素受體（GCR）的影響。采用膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，初次免疫后第14天灌胃給予PF .摘要 研究芍藥苷（paeoniflorin，PF）對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎大鼠外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）糖皮質(zhì)激素受體（GCR）的影響。采用膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，初次免疫后第14天灌胃給予PF 25，50，100 mg·kg-1或雷公藤甲素20 g·kg-1或PF 50 mg·kg-1+R

2、U486 15 mg·kg-1， 每天1次，連續(xù)給藥28 d。末次給藥后第2天，除PF+RU486組外所有實驗大鼠摘眼球取血，處死并取所有大鼠未免疫關(guān)節(jié)，ELISA法檢測PBMCs中GCR，GCR表 達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法分析PBMCs中GCR，GCR mRNA表達(dá)，免疫組化法分析關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2的表達(dá)。PF 50，100 mg·kg-1可抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2的表

3、達(dá)（P<0.05，P<0.01），而RU486 15 mg·kg-1可明顯影響PF 50 mg·kg-1的這一作用（P<0.05）；PF 50，100 mg·kg-1可上調(diào)GCR，GCR mRNA的表達(dá)、下調(diào)GCR和GCR mRNA的表達(dá)（P<0.01），PF抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜炎性介質(zhì)可能與其調(diào)節(jié)GCR表達(dá)有關(guān)。 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，糖皮質(zhì)激素（gluc

4、ocorticoid，GC）具有強大的抗炎調(diào)節(jié)免疫功 能，是治療本病的經(jīng)典藥物。芍藥苷（paeoniflorin，PF）是白芍總苷的主要藥效成分，動物試驗顯示它能抑制關(guān)節(jié)炎模型炎性介質(zhì)的表達(dá)。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PF能提高膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠內(nèi)源性GC分泌水平。GC主要通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GCR）發(fā)揮生物學(xué)作用，本研究擬進(jìn)一步觀察PF對CIA大鼠外周血單個核細(xì)胞GCR及GCR mRNA的影響，同時觀察GCR阻滯劑RU486對PF調(diào)節(jié)C

5、IA關(guān)節(jié)炎癥因子的影響，探討PF抑制關(guān)節(jié)炎癥因子是否與其調(diào)節(jié)GCR的表達(dá)有關(guān)。 1 材料與方法 1.1 試劑和儀器 PF為中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品，純度98%；地塞米松（Dexamethasone，DXM）片為廣東三才石岐制藥有限公司產(chǎn)品；雷公藤甲素 （triptolide，TP）為中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品，純度98%；實驗時均以5%羧甲纖維素鈉配制成所需濃度。牛型膠原（bovine collagen type ，C）和弗氏完全佐劑（complete freunds adjuvan

6、t，CFA）購自美國Sigma公司；淋巴細(xì)胞分離液（北京生化試劑公司）；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；RNA 提取試劑盒為Biomed公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒為TransScript公司產(chǎn)品；GCR，GCR ELISA檢測試劑盒為美國R&D公司產(chǎn)品；IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2免疫組化試劑盒為美國Sigma公司產(chǎn)品。Multiskan MK3型酶標(biāo)儀為Thembo Fisher Labsystems公司產(chǎn)品。 1.2 動物分組和給藥 健康Wistar

7、大鼠70只，雄性，清潔級，體重140180 g，由南昌大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（贛）2010-0002。將大鼠隨機分為7組，即正常對照組、CIA模型對照組、CIA+PF 25，50，100 mg·kg-1治療組、CIA+TP 20 g·kg-1治療組及CIA+RU486（15 mg·kg-1）+PF（50 mg·kg-1）治療組，每組10只。給藥組大鼠于初次免疫后第1442天灌胃給予PF，TP或RU486+PF，模型組和對照組給予相同體積的5%羧甲纖維素鈉，每天灌服1

8、次，連續(xù)28 d。 1.3 CIA大鼠模型的制備 將2 g·L-1的C（溶解于0.01 mol·L-1醋酸）加入等體積的CFA中，使得C終濃度為1 g·L-1，低溫條件下充分乳化。每只造模大鼠右足跖皮內(nèi)注射100 g C，7 d后在背部和尾根部皮下注射相同劑量的 C加強免疫1次。對照組相同方法注射等體積的生理鹽水。 1.4 外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell

9、s， PBMCs）的制備 末次給藥后第2天，除PF+RU486組外所有實驗大鼠摘眼球取血，用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll） 分離出PBMCs。 1.5 免疫組化法檢測關(guān)節(jié)滑膜IL-1，NF-B p65，TNF-，PGE2的表達(dá) 取血后，將所有實驗大鼠處死，每只大鼠取未注射膠原的膝、踝關(guān)節(jié)并用EDTA脫鈣，將脫鈣后的關(guān)節(jié)行冰凍切片，然后用免疫組化法檢測關(guān)節(jié)滑膜IL-1， NF-B p65，TNF-，PGE2。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。然后用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。 1.6 ELISA法檢測P

10、BMCs中GCR，GCR的表達(dá) 將分離的PBMCs在-20 反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞溶解破裂，然后1 500×g離心10 min，收集上清按ELISA檢測試劑盒說明書檢測GCR，GCR的表達(dá)。 1.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測GCR，GCR mRNA 將分離的PBMCs混勻，按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并用紫外分光光度計檢測純度，A260/A280在 1.71.9，醫(yī)教論文經(jīng)瓊脂糖電泳分析28S，18S 2條帶清晰可見，顯示總RNA片段未降解。取總RNA 1 g，加

11、入RI/RT Enzyme Mix 1 L，2×TS Reaction Mix 10 L，oligo dT 1 L，加RNase-freeH2O至終體積20 L建立逆轉(zhuǎn)錄（RT）體系，反應(yīng)條件為42  30 min， 85  5 min，于-20 保存。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 L，加入2×Hifi PCR SuperMix25 L，特異性引物正義

12、鏈和反義鏈各1 L，RNase freeH2O 21 L，使反應(yīng)終體積為50 L。PCR反應(yīng)條件為94  30 min；94  30 s，6  1 min，72  1 min，30個循環(huán)；最后72 延伸8 min。擴增物以瓊脂糖凝膠電泳?；驍U增條帶表達(dá)量灰度分析的比值計算，作為GCR，GCR mRNA表達(dá)的相對水平。引物設(shè)計為GCR：Sense CAAAAGAGCAGTGGAAGGAC

13、A，Antisense GAGGTTTCTTGTGAGACTCCTGT；GCR：Sense CCTAAGGACGGTCTGAAGAGC，Antisense CCACGTATCCTAAAAGGGCAC；-actin：Sense AACACCCCAGCCATGTACG，Antisense CGCTCAGGAGGAGCAATGA。 1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 16.0統(tǒng)計分析平臺，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。 

14、;2 結(jié)果 2.1 PF對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥因子表達(dá)的影響 CIA模型組關(guān)節(jié)NF-B p65，TNF-，IL-1和PGE2明顯高于對照組，PF在50，100 mg·kg-1劑量能顯著下調(diào)上述因子的表達(dá)（P<0.05，P<0.01），與TP效果一致；而將PF與GCR阻滯劑RU486合用后明顯受到抑制，與 50，100 mg·kg-1劑量組有顯著差異（P<0.05，P<0.01），見表1。 表1 PF對CIA大鼠關(guān)節(jié)NF-B p65，TNF-，I

15、L-1和PGE2表達(dá)的影響（±s，n=10） Table 1 Effect of paeoniflorin on immunohistochemical expression of NF-B p65，TNF-，IL-1 and PGE2 protein in synovial tissue of CIA rats（±s，n=10） 注：與對照組相比1）P<0.0

16、5，2）P<0.01；與模型組相比3）P<0.05，4）P<0.01；與RU486+PF組相比5）P<0.05，6）P<0.01；TP組的劑量單位為g·kg-1 （表3，圖1，2同）。 2.2 PF對CIA大鼠外周血單個核細(xì)胞GCR表達(dá)的影響 與正常組相比，CIA模型組大鼠PBMCS中GCR顯著升高，GCR和GCR/GCR顯著降低（P<0.01）； PF在50，100 mg·kg-1劑量時能顯著升高CIA模型大鼠PBMCs中GCR表達(dá)及GCR/GCR，降低GCR（P<0.0

17、1），在 25 mg·kg-1劑量時僅GCR有顯著性差異，見表2。 表2 PF對CIA大鼠外周血單個核細(xì)胞GCR，GCR和GCR/GCR表達(dá)的影響（±s，n=10） Table 2 Effect of paeoniflorin on GCR，GCR protein expression and GCR/GCR in PBMCs of CIA rats（±s，n=10）

18、 2.3 PF對 CIA大鼠外周血單個核細(xì)胞GCR，GCR mRNA表達(dá)的影響 模型大鼠 GCR mRNA顯著低于對照組（P<0.01），與模型組比較，PF 50，100 mg·kg-1劑量組顯著升高（P<0.01）；模型大鼠 GCR mRNA顯著高于對照組（P<0.01），與模型組比較，PF 25，50，100 mg·kg-1劑量組顯著升高（P<0.01）；且均與TP組一致，見圖1，2。 圖1 PF對

19、CIA大鼠外周血單個核細(xì)胞GCR mRNA表達(dá)的影響（±s，n=10） Fig.1 Effect of paeoniflorin on GCR mRNA gene expression in PBMCs of CIA rats（±s，n=10） 3 討論 GCR 是一種廣泛存在于人和哺乳動物的激素-甲狀腺-視黃酸受體超家族蛋白質(zhì)。它的主要亞型有GCR，GCR，GCR位于細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)GC進(jìn)

20、入胞漿 后， GCR與HSP90，HSP70，HSP40等伴侶分子解離，同時形成GC-GCR二聚體而活化并移位進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)靶基因中GC反應(yīng)元件 （glueoeortieoid response element，GRE）結(jié)合，控制特定mRNA的產(chǎn)生（如IL-1，IL-6，TNF，IFN-，GM-CSF等）， 圖2 PF對CIA大鼠外周血單個核細(xì)胞GCR mRNA表達(dá)的影響（±s，n=10） Fig.2 Effect of paeoniflorin on GCR mRNA gene expression in PBMCs of CIA rats（±s，n=10） 發(fā)揮GC抗炎調(diào)節(jié)免疫的生物學(xué)效應(yīng)。另外激活的GCR還可通過蛋白-蛋白相互作用的方式對NF-B，AP-1 等促炎轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制，產(chǎn)生抗炎效果4。GCR是GCR的