腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠的保護(hù)作用

1、腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠的保護(hù)作用        【摘要】  目的研究腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠的保護(hù)作用。方法采用結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈制作不完全腦缺血損傷大鼠模型，連續(xù)給藥30 d后，進(jìn)行血液流變學(xué)、腦組織丙二醛（MDA）與一氧化氮（NO）的含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力的檢測，并觀察海馬神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果與假手術(shù)組比較，不完全腦缺血損傷大鼠全血低切黏度、全血高切黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯升高，腦內(nèi)MDA、NO含量明顯升高，SOD活

2、力明顯下降，海馬神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與血管超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。腦力智寶能顯著降低全血高切黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、腦組織內(nèi)MDA、NO含量，提高SOD活力，并明顯改善海馬神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與血管超微結(jié)構(gòu)的損傷。結(jié)論腦力智寶對腦缺血損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其促進(jìn)血液循環(huán)，改善血液流變性，減輕自由基損傷，從而改善腦組織的超微結(jié)構(gòu)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  腦力智寶 腦缺血 超微結(jié)構(gòu) 血液流變學(xué) 自由基腦力智寶主要由當(dāng)歸、紅花、遠(yuǎn)志、石菖蒲、黃精、益智仁、龜甲、枸杞子等組成，用于精神發(fā)育遲滯、腦癱、癲癇、腦血管病后遺癥、腦外傷后遺癥、腦炎后遺癥、老年性癡呆等腦病伴發(fā)的智力和肢

3、體功能障礙，具有一定的療效。臨床研究表明腦力智寶能明顯改善腦梗塞后遺癥患者運(yùn)動、語言及精神方面的癥狀1。本實驗觀察了腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠的保護(hù)作用，旨在闡明腦力智寶用于治療腦缺血損傷性疾病后遺癥的機(jī)理。1  材料與儀器1.1  動物與分組  Wistar大鼠，體重220250 g，雌雄各半，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。1.2  藥物  腦力智寶由廣東高明腦病醫(yī)療醫(yī)藥研究院提供，制備成1 g生藥/ml供試液，灌胃前按所需濃度稀釋。尼莫地平（nimodipine, Nim）片劑，德國拜耳公司產(chǎn)品，批號CAGFT3。1.3 

4、試劑與儀器 丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）與總蛋白試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。722光柵分光光度計，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；LBY-NM微量血漿粘度計，LBY-N6A型旋轉(zhuǎn)式血液粘度計，北京普利生精密儀器研究中心產(chǎn)品；JEM-1200EX透射顯微鏡，日本JEOL公司產(chǎn)品。2  方法2.1  不完全腦缺血損傷模型的制備2大鼠經(jīng)10%烏拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，行頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，用絲線結(jié)扎，縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠同法分離雙側(cè)頸總動脈，但不結(jié)扎。2.2  分組與給藥  將造模成功動物隨機(jī)分為

5、3組：模型組、尼莫地平組、腦力智寶組，每組8只，雌雄各半。假手術(shù)組大鼠8只，雌雄各半。待大鼠蘇醒后，尼莫地平組按12 mg/kg灌胃給予尼莫地平混懸液，腦力智寶組按8 g/kg灌胃給予腦力智寶供試液，假手術(shù)組和模型組分別給予等容量生理鹽水，1次/d，連續(xù)30 d。2.3  血液流變學(xué)及生化指標(biāo)測定  連續(xù)給藥30 d后，每組各取6只，眼內(nèi)眥靜脈取血3 ml，進(jìn)行血液流變學(xué)測定。麻醉下處死，快速斷頭取腦，腦組織用預(yù)冷的生理鹽水制成110（W/V）的勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，依照試劑盒說明書檢測SOD活力及MDA、NO及組織蛋白含量。2.4

6、0; 電鏡觀察  每組剩余的兩只大鼠，腹腔注射烏拉坦麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，先以100 ml生理鹽水經(jīng)主動脈沖洗，然后灌注由2%多聚甲醛和2.5%戊二醛組成的4 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)300 ml，取腦背側(cè)海馬CA1區(qū)組織1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm。常規(guī)電鏡樣品制備程序漂洗、脫水、浸透及環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后，將切片撈至載網(wǎng)上，干燥后行鉛鈾雙染，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的改變。每個標(biāo)本觀察神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞與血管的病理變化，并進(jìn)行拍攝。2.5  統(tǒng)計學(xué)方法  實驗數(shù)據(jù)用±s表示，運(yùn)用統(tǒng)計軟件SPS

7、S for windows 11.5 進(jìn)行單因素方差分析。1         3  結(jié)果3.1  腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠血液流變學(xué)的影響不完全腦缺血損傷大鼠全血低切黏度、全血高切黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均較假手術(shù)組明顯升高（P<0.05或P<0.01），紅細(xì)胞壓積則無明顯變化。尼莫地平與腦力智寶能顯著降低全血高切黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)（P<0.05或P<0.01），對其它指標(biāo)則影響不顯著（P>0.05），結(jié)果見表1。表1

8、0; 腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠血液流變學(xué)的影響（略）與模型組比較，*P<0.05,*P<0.01；n=63.2  腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠腦組織內(nèi)MDA、NO含量及SOD活力的影響與假手術(shù)組比較，不完全腦缺血損傷大鼠腦內(nèi)MDA、NO含量明顯升高（P<0.01），SOD活力明顯下降（P<0.01）；尼莫地平與腦力智寶能顯著降低損傷大鼠腦組織內(nèi)MDA、NO含量（P<0.05或P<0.01），提高SOD活力（P<0.01），結(jié)果見表2。表2  腦力智寶對不完全腦缺血損傷大鼠腦組織內(nèi)MDA，NO含量及SOD活力的影響（略）與模型

9、組比較，*P<0.05,*P<0.01；n=63.3  腦力智寶對海馬超微結(jié)構(gòu)變化的影響假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、清晰，核大而圓，染色質(zhì)均勻分布，核仁明顯，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，結(jié)構(gòu)完整，線粒體無腫脹，嵴清晰可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面附著有豐富的核糖體，星形膠質(zhì)細(xì)胞無腫脹，毛細(xì)血管無變形，血管內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹，血腦屏障緊密聯(lián)結(jié)，血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞足突緊覆于血管基膜表面，神經(jīng)氈、髓鞘結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，可見大量突觸，內(nèi)含豐富的突觸小泡。見圖1之A1，A2與A3。    模型組神經(jīng)元大量固縮或腫脹，細(xì)胞輪廓模糊，核固縮或溶解壞死，染色質(zhì)凝集成塊狀或溶解，異染色質(zhì)

10、邊集，核仁結(jié)構(gòu)紊亂、變形或溶解消失；神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞核膜及胞膜的連續(xù)性破壞，甚至消失；核周圍細(xì)胞器減少、崩解、消失，線粒體腫脹成空泡狀，嵴斷裂、溶解消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，表面核糖體脫落，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等腫脹呈泡狀，溶酶體、脂質(zhì)顆粒增多；星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大，胞突腫脹變形，特別是毛細(xì)血管旁的星形細(xì)胞足突高度腫脹，核固縮破裂；毛細(xì)血管變形，管腔狹窄，基底膜屈曲增厚，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹內(nèi)突、變性，出現(xiàn)空泡變化，血腦屏障連續(xù)性破壞；神經(jīng)氈水腫，大片空化，軸漿內(nèi)微管解聚呈絮狀，髓鞘板層松散，分層變形，突觸減少，膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，突觸小泡明顯減少。見圖1之B1，B2與B3。   

11、尼莫地平組神經(jīng)元仍有部分核膜內(nèi)陷，少量染色質(zhì)凝集，核周部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基氏體腫脹，線粒體雖未見空泡樣變化，但嵴斷裂仍存在。見圖1之C1，C2與C3。腦力智寶組海馬超微結(jié)構(gòu)基本正常，多數(shù)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞未見不可逆性損害，毛細(xì)血管痙攣緩解，管腔擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞基底膜正常，神經(jīng)氈無明顯水腫，髓鞘結(jié)構(gòu)基本正常，突觸增多，膜結(jié)構(gòu)基本正常。見圖1之D1，D2與D3。4  討論    腦缺血損傷的機(jī)制與細(xì)胞間液興奮性氨基酸濃度升高、N-甲基-D-天門冬氨酸受體（NMDA）激活、一氧化氮合酶（NOS）過度表達(dá)、一氧化氮（NO）生成過多、自由基大量產(chǎn)生以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載

12、等因素有關(guān)。在腦缺血時，自由基生成增加，防御機(jī)制活性降低，自由基作用于多價不飽和脂肪酸，發(fā)生氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)DNA、RNA、蛋白質(zhì)的交聯(lián)和氧化反應(yīng)，促使多糖分子聚合，從而損傷腦組織，出現(xiàn)結(jié)構(gòu)及功能的改變3。腦缺血時大量的NMDA受體激活，細(xì)胞內(nèi)鈣增多，Ca2+與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合激活NO合酶（NOS），合成大量NO，過量的NO擴(kuò)散作用于鄰近神經(jīng)元，促進(jìn)興奮性氨基酸的釋放與自由基的形成，造成神經(jīng)元壞死和凋亡4。圖1  各組大鼠的海馬超微結(jié)構(gòu)（略）    既往研究表明腦力智寶可以通過抗氧化作用、Ca2+拮抗作用、促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動性

13、，從而抑制NO誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡5。在本研究中，不完全腦缺血損傷大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均較假手術(shù)組明顯升高，血液處于高度濃、黏、凝、聚狀態(tài)，血液循環(huán)阻力增高，腦微循環(huán)障礙，缺血缺氧，加劇腦水腫和繼發(fā)性腦損害。腦組織內(nèi)MDA與NO的含量明顯升高，SOD活性則明顯降低，海馬中的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與微血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)均表現(xiàn)出嚴(yán)重的損傷改變。經(jīng)腦力智寶后，全血高切黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞剛性指數(shù)顯著降低，MDA與NO含量降至正常水平，SOD活性亦恢復(fù)正常，海馬的超微結(jié)構(gòu)基本正常。研究結(jié)果提示腦力智寶能在腦缺血損傷狀態(tài)下，改善血液流變性及微循環(huán)障礙，并能增強(qiáng)SOD酶活性，減少自由基形成，減輕NO的神經(jīng)毒性作用，從而抑制腦缺血損傷后腦組織結(jié)構(gòu)與功能的變化。本研究為腦力智寶用于治療腦缺血損傷性疾病后遺癥提供了實驗依據(jù)?！尽?#160; 1 瞿 瀘. 腦力智寶治療腦梗死后遺癥的療效觀察J.昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2007, 28 (2B)：51.2 李 斌，劉匯波，郭德玉，等. 雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠行為學(xué)觀察J.實驗動物學(xué)雜志，2000，10(1)：15.3 Lipton P. Ischemic Cell Death in Brain NeuronsJ. Physiology Revi