酵母雙雜交系統(tǒng)的改進(jìn)與研究進(jìn)展_圖文

1、2006年海洋湖沼通報(bào)Transactions of Oceanology and LimnologyNo1文章編號(hào):100326482(20060120108209酵母雙雜交系統(tǒng)的改進(jìn)與研究進(jìn)展3張莉1,2,黃倢13(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,青島266071;2.萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)系,青島266109摘要:酵母雙雜交系統(tǒng)是一種新興的體內(nèi)研究蛋白質(zhì)之間相互作用以及篩選cDNA文庫(kù)的技術(shù)手段,自建立以來(lái)得到了不斷的改進(jìn)與發(fā)展。在此基礎(chǔ)上又相繼出現(xiàn)了單雜交、三雜交、反向雙雜交以及SOS富集系統(tǒng)等多種衍生系統(tǒng),它們?cè)诠δ芑蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及藥物開(kāi)發(fā)研究中發(fā)揮了重要作用。本文擬就雙雜

2、交系統(tǒng)的原理、改進(jìn)、發(fā)展及應(yīng)用做一綜述。關(guān)鍵詞:酵母雙雜交系統(tǒng);單雜交系統(tǒng);三雜交系統(tǒng);反向雙雜交系統(tǒng);SOS富集系統(tǒng)中圖分類(lèi)號(hào):TQ920.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A隨著對(duì)多種重要生物的大規(guī)模基因組測(cè)序工作的完成,基因工程領(lǐng)域又迎來(lái)了一個(gè)新的時(shí)代功能基因組時(shí)代,它的任務(wù)就是對(duì)基因組中包含的全部基因的功能加以認(rèn)識(shí)。生物體系的運(yùn)作是與蛋白質(zhì)之間的相互作用密不可分的,如DNA合成、基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)、蛋白質(zhì)翻譯、修飾和定位以及信息傳導(dǎo)等重要生物過(guò)程均涉及到蛋白質(zhì)復(fù)合體的作用。能夠發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證在生物體中相互作用的蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)是認(rèn)識(shí)它們生物學(xué)功能的第一步。酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two2hybrid

3、 system是用于研究蛋白質(zhì)之間相互作用的一種嶄新的、有效的遺傳學(xué)方法。是由Fields和Song1在1989年首創(chuàng)的,它利用轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)報(bào)告基因,以已知功能蛋白作為“誘餌蛋白”(Bait Protein,從相應(yīng)的cDNA文庫(kù)篩選出與之相互作用的蛋白,而不需要蛋白的純化,比以往研究蛋白質(zhì)之間相互作用的生化技術(shù)如偶聯(lián)、免疫共沉淀以及親和層析等更具有優(yōu)越性。經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展,國(guó)外學(xué)者又創(chuàng)立了基于雙雜交原理的新系統(tǒng)如單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)、反向雙雜交系統(tǒng)以及核外雙雜交技術(shù)等,使人們對(duì)研究生物大分子之間的相互作用擴(kuò)展到蛋白質(zhì)與核酸之間以及核酸與核酸之間。其功能也被推廣到細(xì)胞周期調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤基因表

4、達(dá)等多個(gè)研究領(lǐng)域,它在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中也得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。1酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理酵母雙雜交系統(tǒng)的產(chǎn)生是基于對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4性質(zhì)的研究。其原理如圖11所示:Gal4蛋白可識(shí)別專(zhuān)一的位點(diǎn)UAS G(up st ream activation se23基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目課題資助(G1999012002、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30271020、青島市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(03222J ZP210、山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Q2002D02和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院科研基金項(xiàng)目(20032青26共同資助3通訊作者:黃倢,博導(dǎo),研究員。從事海洋生物病毒學(xué)研究

5、Tel:0532-*E2mail:aqudis2000 第一作者簡(jiǎn)介:張莉(19732,女,碩士研究生,主要從事分子病毒學(xué)研究收稿日期:2005203202quence并與之結(jié)合,啟動(dòng)下游GAL12lacZ基因的轉(zhuǎn)錄。GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modu2 lar,由兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)而在功能上又相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。其N(xiāo)末端1147個(gè)氨基酸構(gòu)成DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain,BD,單獨(dú)的BD不能啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,而當(dāng)它與靶基因啟動(dòng)子內(nèi)特異的核苷酸序列結(jié)合后即能激活基因的轉(zhuǎn)錄。其C末端由768 881個(gè)氨基酸構(gòu)成DNA激活結(jié)構(gòu)域(Activating Domain,AD,

6、它只有結(jié)合到UAS G上才具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)連接建立的空間聯(lián)系使得它們只要在同一細(xì)胞內(nèi)就能彼此靠近,啟動(dòng)下游報(bào)告基因的表達(dá)。根據(jù)這一特點(diǎn),使可能存在相互作用的兩種蛋白X和Y分別以和BD/AD在空間結(jié)構(gòu)上重新連接為一個(gè)整體而與報(bào)告基因的上游激活序列(UAS結(jié)合,進(jìn)而發(fā)揮啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能,使受調(diào)控的報(bào)告基因得以表達(dá)。在目前通用的系統(tǒng)中,根據(jù)BD來(lái)源不同可分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。真核細(xì)胞中的是GAL4系統(tǒng);原核細(xì)胞中的是LexA系統(tǒng),其轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)因子是LexA。Fields1等以與調(diào)控SUC基因有關(guān)的兩個(gè)蛋白質(zhì)Snf1和Snf2為模型設(shè)計(jì)了一個(gè)檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用

7、的雙雜交系統(tǒng),將Snf1與BD融合,Snf2和AD融合,構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上。Snf1是一種依賴(lài)于絲氨酸、蘇氨酸的蛋白激酶,Snf2是其結(jié)合蛋白,把兩種穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GGY:171菌株,該菌株含有LacZ報(bào)告基因,并且已去除了相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子基因,此結(jié)果表明由Snf1和Snf2的相互作用使AD和BD在空間上相互靠近,從而啟動(dòng)報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。利用此原理,我們可構(gòu)建兩個(gè)重組質(zhì)粒,將感興趣的蛋白基因轉(zhuǎn)入帶有BD結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒載體中,并把其轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中表達(dá)一個(gè)融合蛋白誘餌蛋白(bait;把要篩選的cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)入帶有AD結(jié)構(gòu)域的另一質(zhì)粒載體中,表達(dá)另一個(gè)雜交蛋白靶蛋白(prey;然后共轉(zhuǎn)化酵母菌或

8、者是通過(guò)兩個(gè)單倍體酵母菌融合,轉(zhuǎn)化的酵母菌株應(yīng)該帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因,常用的報(bào)告基因有H IS3,L ACZ,AD E2和U RA3等,轉(zhuǎn)化的菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。在選擇性缺陷培養(yǎng)基上篩選,通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表型的鑒定來(lái)確定2個(gè)蛋白是否存在相互作用。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因,這樣有利于轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒的篩選和鑒定。依靠簡(jiǎn)便的酵母遺傳分析以及對(duì)報(bào)告基因表型的檢測(cè)就可用來(lái)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用 。a:完整的GAL4蛋白,既能結(jié)合UAS,又能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,報(bào)告基因打開(kāi)。b:單獨(dú)的BD和AD分別具有功能,但由于無(wú)法啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或正確定位,報(bào)告基因關(guān)閉。c:BD及AD雙雜交上X和Y蛋白后的大

9、體系又恢復(fù)結(jié)合UAS及啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄功能,報(bào)告基因打開(kāi)。圖1酵母雙雜交系統(tǒng)原理圖Fig.1The principle of yeast two2hybrid system 9011期酵母雙雜交系統(tǒng)的改進(jìn)與研究進(jìn)展011海洋湖沼通報(bào)2006年2酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用研究現(xiàn)狀及其局限性酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的技術(shù)平臺(tái),近幾年來(lái)得到了不斷的應(yīng)用和發(fā)展,它已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中。主要有以下幾個(gè)方面:(1發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能。雙雜交系統(tǒng)最為重要的用途就是從cDNA文庫(kù)中尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白,從而研究蛋白間相互作用的傳遞途徑。目前已經(jīng)

10、利用該系統(tǒng)對(duì)HBV、HCV以及H IV等多種病毒蛋白基因的相互作用蛋白進(jìn)行了研究2。Engelender5等人以神經(jīng)末端蛋白alp ha2synuclein蛋白為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交CLON2 TEC H MA TCHMA R KER S YSTEM3為操作平臺(tái),從成人腦cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了與alp ha2 synuclein相互作用的新蛋白Synp hilin21,并證明了Synp hilin21與alp ha2synuclein之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病密切相關(guān)。(2非常靈敏地檢測(cè)或驗(yàn)證蛋白蛋白的相互作用。如Aelst等3用雙雜交技術(shù)檢測(cè)出用免疫沉淀法無(wú)法檢測(cè)到的RasRaf之間的

11、相互作用。李凌云4利用酵母雙雜交技術(shù)證實(shí)了bip是位于絨猴2B類(lèi)淋巴母細(xì)胞中麻疹病毒新的細(xì)胞受體基因。(3可利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn),尋找基因治療中的多肽類(lèi)藥物。利用雙雜交系統(tǒng)可以確定治療所用的多肽類(lèi)藥物與來(lái)源于腫瘤、細(xì)菌以及病毒的蛋白質(zhì)間的相互作用。逆向雙雜交技術(shù)在藥物篩選中的作用更為廣泛。(4在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用:可利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖譜(Genome Protein Linkage Map。Walhout6等以線蟲(chóng)的生殖發(fā)育過(guò)程為研究對(duì)象,利用已知的27個(gè)線蟲(chóng)發(fā)育相關(guān)蛋白建立了一個(gè)大規(guī)模的雙雜交系統(tǒng),結(jié)果得到了100多個(gè)相互作用的蛋白。Bartel等7通過(guò)cDN

12、A的隨機(jī)表達(dá)找到了25個(gè)相互作用的蛋白,且發(fā)現(xiàn)有6個(gè)交互作用是兩兩相連的。(5研究蛋白蛋白間發(fā)生相互作用所必需的重要活性位點(diǎn)。在確定兩蛋白存在相互作用后,要對(duì)所研究的蛋白做一系列缺失突變處理,通過(guò)缺失掉不同片段來(lái)對(duì)蛋白中起關(guān)鍵作用的功能域進(jìn)行精確的定位。K iston等17利用雙雜交系統(tǒng)研究了TN F2R家族的細(xì)胞表面受體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們存在一個(gè)由7080個(gè)氨基酸構(gòu)成的保守域,又稱(chēng)之為“死亡區(qū)域”。它是引發(fā)了細(xì)胞凋亡(apoptosis的重要信號(hào)之一,并同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的具有“死亡區(qū)域”的TN F2R族的表面受體WSL21蛋白(DR3/A PO23。傳統(tǒng)的研究蛋白質(zhì)相互作用的方法如交聯(lián)、免疫共沉

13、淀、親和層析等均是采用體外實(shí)驗(yàn)(in vit ro進(jìn)行的,它受到環(huán)境、實(shí)驗(yàn)條件等多種因素的影響。而雙雜交系統(tǒng)則是采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(in vivo,不易受外界環(huán)境的影響,而且所有操作均在核酸水平上進(jìn)行,不需要蛋白質(zhì)的大量純化就可以檢測(cè)到蛋白間微弱的相互作用。但是該系統(tǒng)也存在一定的局限性:(1“假陽(yáng)性”是雙雜交系統(tǒng)首要考慮的問(wèn)題。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母內(nèi)表達(dá)時(shí)的轉(zhuǎn)錄激活作用,使p rey2BD融合基因與bait2AD融合基因表達(dá)產(chǎn)物無(wú)需特異結(jié)合,就能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。或者某些蛋白的表面有對(duì)其它蛋白的低親和力區(qū),易形成蛋白體復(fù)合物,也可引起報(bào)告基因的表達(dá),使酵母出現(xiàn)相應(yīng)表型,產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果

14、。(2所分析的可能存在相互作用的蛋白必須定位于核內(nèi),才能激活報(bào)告基因,但很多蛋白的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工,如二硫鍵的形成等要在胞漿內(nèi)完成。因此有些蛋白就不能采用該方法。假陰性現(xiàn)象也是雙雜交分析過(guò)程中經(jīng)常碰到的問(wèn)題。3酵母雙雜交系統(tǒng)的改進(jìn)與發(fā)展3.1酵母單雜交系統(tǒng)(One 2hybrid system 酵母單雜交系統(tǒng)是Li 等18,19根據(jù)雙雜交技術(shù)的原理提出的,用于研究DNA 2蛋白質(zhì)之間的相互作用。其原理如圖2所示9:AD 和某個(gè)DNA 結(jié)合蛋白(DNA binding p rotein ,DNA bp 的基因(該基因來(lái)源于某cDNA 文庫(kù)融合于同一質(zhì)粒載體,在報(bào)告基因的上游至少有3個(gè)串聯(lián)

15、的DNA bp 結(jié)合位點(diǎn)(E ,DNA bp AD 融合蛋白將識(shí)別其結(jié)合位點(diǎn)并與之結(jié)合,AD 就啟動(dòng)了下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。單雜交系統(tǒng)與雙雜交系統(tǒng)的區(qū)別在于前者把要研究的DNA 序列置于報(bào)告基因上游,以這段特異性的DNA 序列為誘餌,去篩選cDNA 文庫(kù)編碼的靶蛋白,不需要BD 2X 的參與12;而后者是用誘餌蛋白來(lái)篩選與之結(jié)合的蛋白。Li 等16利用單雜交系統(tǒng)成功地篩選到與HBV EN (相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子hB IF 。單雜交系統(tǒng)提供了最大程度的靈敏性,因?yàn)榈鞍自诒３直緛?lái)結(jié)構(gòu)的同時(shí)就能利用該系統(tǒng)監(jiān)測(cè)到它們之間的相互作用,并且在文庫(kù)篩選以后能立即得到我們感興趣的基因編碼的蛋白10。單雜交系統(tǒng)在細(xì)胞

16、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因調(diào)控等功能研究中有重要作用。DNAbp 的基因與AD 構(gòu)建成融合蛋白,與上游特異性識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合后,AD 啟動(dòng)下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。圖2酵母單雜交系統(tǒng)原理圖Fig.2The principle of yeast one 2hybrid system 3.2三雜交系統(tǒng)(Three 2hybridsystem 近幾年來(lái),隨著雙雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用,Sen Gupta 33在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了酵母三雜交系統(tǒng),它的應(yīng)用范圍比雙雜交系統(tǒng)更加廣泛。它也是利用釀酒酵母細(xì)胞的GAL4蛋白調(diào)節(jié)半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn),其主要特征是兩個(gè)融合蛋白在空間上的靠近需要第三個(gè)分子的參與,第三分子可以是蛋白質(zhì)、激酶

17、、多肽、DNA 、RNA 或小分子配體等。它們可通過(guò)修飾誘餌蛋白或靶蛋白使二者發(fā)生相互作用,或者誘導(dǎo)二者使其發(fā)生構(gòu)象改變后產(chǎn)生相互作用,進(jìn)而啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。其本質(zhì)與雙雜交系統(tǒng)是相同的,但是該系統(tǒng)需要第三個(gè)分子的介導(dǎo)把兩個(gè)雜交蛋白結(jié)合在一起11。其基本原理如圖3所示:誘餌蛋白X 和DNA BD 融合,靶蛋白Y 和轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域AD 融合,蛋白質(zhì)X 和Y 由于第三個(gè)分子Z 的介導(dǎo)從而導(dǎo)致AD 和BD 在空間上接近,啟動(dòng)了下游報(bào)告基因的表達(dá)。根據(jù)第三個(gè)分子的成分不同可分為:蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)、激酶三雜交系統(tǒng)、RNA 三雜交系統(tǒng)和小配體三雜交系統(tǒng)。蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)29:該系統(tǒng)中誘餌蛋白和靶蛋白的相互作用

18、必須依靠第三種蛋白Z ,Z 使二者發(fā)生作用或者誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象變化,從而促使二者穩(wěn)定結(jié)合。激酶三雜交系統(tǒng)30:該系統(tǒng)可用來(lái)研究需翻譯后加工的蛋白。利用酪氨酸蛋白激酶將其中一種蛋白質(zhì)在特定位置上的酪氨酸磷酸化,磷酸化后的蛋白才能與另一種發(fā)生相互作用,當(dāng)然還可引入多種翻譯后修飾因子如甲基化酶、糖基化酶來(lái)研究需翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的相互作用。RNA 三雜交系統(tǒng)13:該系統(tǒng)用來(lái)研究RNA 與蛋白質(zhì)的相互作用,BD 2Bait 和AD 2Prey 不能直接發(fā)生1111期酵母雙雜交系統(tǒng)的改進(jìn)與研究進(jìn)展作用,但Bait 可通過(guò)與一種RNA 分子的部分序列結(jié)合,來(lái)檢測(cè)該RNA 分子的其他序列與未知蛋白Prey

19、 的相互作用。此外還有多肽三雜交系統(tǒng)31和小配體三雜交系統(tǒng)32。在對(duì)免疫抑制劑F K506的研究中,主要應(yīng)用了小配體三雜交系統(tǒng)。Belshaw 等15將免疫抑制劑F K506與環(huán)孢菌素A (Cyclo sporin A 構(gòu)建成異源二聚體,此二聚體介導(dǎo)了誘餌和靶蛋白之間的相互作用。K icitra 等22將F K506與地塞米松(Dexamet hasone 合成雜交分子后,作為誘餌蛋白(糖皮質(zhì)激素受體與BD 的融合蛋白的配體,從與AD 融合的靶蛋白cDNA 文庫(kù)中成功地篩選出F K B P12蛋白。Putz 等21把HIV 21病毒的Rev 蛋白突變體RevM10與DNABD 融合,構(gòu)建成誘餌

20、蛋白,利用RevM10蛋白能識(shí)別并結(jié)合其靶RNA 中的Rev 蛋白反應(yīng)成分,篩選同樣能與該RNA 結(jié)合并與DNA 2AD 融合的蛋白。三雜交系統(tǒng)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用,其應(yīng)用范圍比雙雜交系統(tǒng)廣泛,但對(duì)于在超過(guò)3種成分更為復(fù)雜的相互作用則無(wú)能為力。在對(duì)蛋白質(zhì)2藥物小分子的相互作用研究中,藥物小分子要能透入酵母細(xì)胞膜,對(duì)不能透入細(xì)胞膜的藥物小分子該方法不適用;并且適用于可溶蛋白,不能用于膜結(jié)合型蛋白的研究。圖3酵母三雜交系統(tǒng)原理圖Z:介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的第三個(gè)分子,可以是蛋白質(zhì),核酸或小分子配體Fig.3The principle of yeast three 2hybrid system Z:T

21、he third molecule which mediates the protein 2protein interaction ,which can be protein ,nucleic acid or ligand 3.3反向雙雜交系統(tǒng)(Re 2verse two 2hybrid system 在對(duì)蛋白質(zhì)中有重要作用的功能域、作用位點(diǎn)以及影響蛋白質(zhì)結(jié)合或解離因素的研究中,反向雙雜交系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。它最早是在1996年由Vidal等20提出的。該系統(tǒng)采取反向選擇篩選的方法,最大的特點(diǎn)就是將蛋白質(zhì)之間的解離作用變?yōu)橐环N選擇優(yōu)勢(shì)。其關(guān)鍵在于逆向報(bào)告基因的引入,常用的報(bào)告基因有3種即U R

22、A3,C YH2和L YS2。當(dāng)野生型BD 2X 與AD 2Y 間發(fā)生相互作用時(shí),啟動(dòng)了毒性報(bào)告基因的表達(dá),它對(duì)酵母菌株有毒性或者是致死的。當(dāng)二者解離時(shí)毒性報(bào)告基因不能表達(dá),菌株具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。不同的毒性報(bào)告基因都可用來(lái)提供陰性篩選 。圖4反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖AFig.4The principle of reversetwo 2hybrid system (A 圖5反向雙雜交系統(tǒng)原理示意圖B Fig.5The principle of reverse two 2hybrid system (B 211海洋湖沼通報(bào)2006年1期 酵母雙雜交系統(tǒng)的改進(jìn)與研究進(jìn)展 113 在反向雙雜交系統(tǒng)中

23、,一類(lèi)是采用反選擇性報(bào)告基因如 U RA3 或者 C YH2 ( 如圖 4 23 。 U RA3 基因編碼尿嘧啶合成途徑中起重要作用的酶 乳清酸核苷252磷酸脫羧酶 ,它把 52氟乳 清酸 ( 52FOA 轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì) , 使細(xì)胞不能生長(zhǎng) 。相反 , 如果融合蛋白的相互作用被阻斷 , U RA3 基因不表達(dá) ,酵母菌則表現(xiàn)為生長(zhǎng) 。在以 C YH2 作為報(bào)告基因的體系中 , 野生型相互 作用賦予酵母細(xì)胞放線菌素酮 ( 環(huán)己酰亞胺 敏感表型 24 。另一類(lèi)是由 Shin 等 28 在研究分裂 雜合系統(tǒng)時(shí)得出的 ( 如圖 5 23 : 用大腸桿菌轉(zhuǎn)錄抑制子 Tet R 作為報(bào)告基因 ,并在原有報(bào)

24、告基 因 ( 如 H IS3 的上游引入一個(gè) Tet R 產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)即 Tet 操縱基因 ,當(dāng)待測(cè)蛋白發(fā)生相互作用 時(shí)啟動(dòng)了 tet2R 基因表達(dá)抑制子 Tet R ,它結(jié)合 tet 操縱子后就抑制了報(bào)告基因 H IS3 的表達(dá) , 結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng) 。反之 , 當(dāng)待測(cè)蛋白之間的相互作用被阻斷時(shí)則無(wú)法啟動(dòng) tet2R 基因 , H IS3 就不受 tet 操縱子的控制而表達(dá) 。Shih 等 25 利用該方法鑒定了 cAM P2應(yīng)答組件結(jié)合蛋 白中磷酸化位點(diǎn)的 Ser133 突變會(huì)阻斷其與輔助啟動(dòng)因子的相互作用 。此外 ,Brachmann 34 等 還提出了反式單雜交系統(tǒng) ,并已成功分離鑒

25、定了 p53 突變體 。 反向雙雜交系統(tǒng)可以鑒定作用缺陷等位基因 、 解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì) ,它在研究蛋白 質(zhì)間的作用位點(diǎn) 、 蛋白質(zhì)與 RNA 、 蛋白質(zhì)與藥物小分子 、 癌癥以及蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)揮著越來(lái)越 26 重要的作用 ,在藥物篩選中有著更廣闊的應(yīng)用前景 。 3. 4 核外雙雜交系統(tǒng) 上述幾種技術(shù)對(duì)于相互作用的檢測(cè)是基于對(duì)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)上 ,但是對(duì)于一些有自 激活作用的不適用于雙雜交篩選的誘餌蛋白 ,以及大量的非核內(nèi)蛋白質(zhì)如細(xì)胞外分泌蛋白 、 膜 27 受體蛋白等的研究 , 就需要建立一個(gè)非轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上的雙雜交篩選體系 。Aro nheim 等 在 1997 年構(gòu)建了 SOS 蛋白

26、招募系統(tǒng) ( So s Recruit ment System 把蛋白質(zhì)相互作用的場(chǎng)所從核內(nèi) 轉(zhuǎn)移到酵母的細(xì)胞膜上 ,它通過(guò)應(yīng)用 2 個(gè)蛋白相互作用后對(duì) Ras 信號(hào)通路的恢復(fù)作用而取代 傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制 ,克服了傳統(tǒng)雙雜交系統(tǒng)的一些局限性 。 SOS 蛋白招募系統(tǒng)的基本作用原理如下 : 在正常情況下 , 當(dāng)有生長(zhǎng)信號(hào)刺激時(shí) , 酵母的 Ras 鳥(niǎo)苷酸交換因子 ( Ras guanyl nucleotide exchange factor , R GEF Cdc25 會(huì)富集到細(xì)胞膜 上 ,此時(shí) Cdc25 能夠促使 Ras 蛋白的 GD P 與 GTP 的交換 , 激活下游的信號(hào) , 使酵母

27、細(xì)胞生 長(zhǎng) 。在酵母溫度敏感缺陷株 cdc2522 中 ,cdc25 由于突變喪失了上述功能 , 使得此菌株只能在 25 下生長(zhǎng) ,而在限制溫度 37 無(wú)法生長(zhǎng) 。如人為地引入正常的 GEF ( SOS 蛋白 , 并使得 C C GEF 與 Ras 蛋白足夠接近 ,則可彌補(bǔ)這一缺陷 。將待測(cè)蛋白 X 與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的鳥(niǎo)苷酸交換 因子 ( GEF So s 蛋白融合 ,將 Y 蛋白與錨定于酵母細(xì)胞膜上的 Src 信號(hào)蛋白融合 ,使它們共表 達(dá)于一個(gè) cdc2522 基因敏感型突變的酵母菌株內(nèi) 。 Y 被定位在細(xì)胞膜上 ,蛋白 X 與 Y 發(fā)生相 互作用使 SOS 因子作用于細(xì)胞膜上 Ras 蛋白

28、 ,激活了 Ras 途徑 ,從而細(xì)胞能在 37 生長(zhǎng) 。 C 8 Ko 等 利用該系統(tǒng)以甲狀腺素受體 (21 的配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌蛋白 , 篩選到甲狀腺素 溫度下生長(zhǎng) ,從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果 。為了去除假陽(yáng)性 , Huang 14 等設(shè)計(jì)了一對(duì) Ras 基因特異 引物 ,在篩選過(guò)程中增加了一步 PCR 反應(yīng) ,這樣可有效去除哺乳動(dòng)物 Ras cDNA 造成的假陽(yáng) 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 的一個(gè)受體結(jié)合蛋白 - TRB P 。Aro nheim 等人利用該

29、技術(shù)找到了 c2J un 的兩個(gè)新的作用伙 伴。 SOS 蛋白招募系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)在于被研究蛋白質(zhì)的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì) 胞核 ,因此其應(yīng)用范圍更加廣泛 ,但同時(shí)也存在一些假陽(yáng)性問(wèn)題 : 在篩庫(kù)過(guò)程中如果存在 Ras 信號(hào)通路中的 Ras GTPase 家族成員的 cDNA ,則可能激活下游的信號(hào)通路 ,酵母便會(huì)在限制 114 海 洋 湖 沼 通 報(bào) 2006年 性 。 Aro nheim 36 利 用 哺 乳 動(dòng) 物 的 GA P ( GTPase activateing p rotein 抑制并減少假陽(yáng) 性。 3. 5 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng) 酵母菌屬于比較低等的真核生物 , 對(duì)于蛋

30、白質(zhì)翻譯后的加工修飾如糖基化 、 甲基化 、 磷 酸化以及二硫鍵的形成等修飾水平很低 ,要進(jìn) 一步研究蛋白的功能就需要建立高等生物的 雙雜交系統(tǒng) ,如在哺乳類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行相互作用 檢測(cè) 。哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)能夠檢測(cè)那些相 互作用依賴(lài)于蛋白翻譯后修飾的蛋白質(zhì) 35 。 其原理和酵母雙雜交系統(tǒng)相同 ,把編碼誘餌蛋 白和靶蛋白的基因克隆到相應(yīng)的載體上 ,采用 磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)入 Hela 等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中培 養(yǎng) ,當(dāng)二者發(fā)生相互作用時(shí) ,激活了報(bào)告基因 , 可通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè) 。 圖 6 SOS 核外雙雜交系統(tǒng)原理圖 Fig. 6 The p rinciple of SOS ult ra2

31、nucleus two2hybrid system 4 結(jié) 語(yǔ) 酵母雙雜交技術(shù)在研究蛋白質(zhì)之間的相互作用方面發(fā)揮了重要作用 ,在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防 治中同樣有重要的應(yīng)用價(jià)值 。當(dāng)某一種海洋病毒吸附宿主的病毒粘附蛋白確定以后 , 即可構(gòu) 建宿主靶細(xì)胞的 cDNA 文庫(kù)并以該粘附蛋白做為誘餌蛋白 ,利用雙雜交系統(tǒng)從文庫(kù)中 “釣” 取 與之相互作用的蛋白 。 綜上所述 ,隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步 ,酵母雙雜交系統(tǒng)正得到不斷地完善和發(fā)展 ,人 們將設(shè)計(jì)出更多更巧妙的相互作用陷阱來(lái)獲取新的未知蛋白和未知基因 ,為進(jìn)一步探討有關(guān) 疾病的發(fā)生機(jī)理和治療措施以及開(kāi)發(fā)新型藥物等方面提供更有價(jià)值的理論依據(jù) 。正如人

32、類(lèi)基 因組計(jì)劃曾經(jīng)給生物學(xué)家?guī)?lái)巨大的希望一樣 ,酵母雜交體系將給人們提供另一獲得大量生 物學(xué)信息的途徑 ,該體系的不斷完善和發(fā)展 ,必將在蛋白質(zhì)組學(xué)以及基因組學(xué)研究中發(fā)揮越來(lái) 越重要的作用 。 參考文獻(xiàn) : 340 :245246 1 Fields , S. , and So ng , O. A novel genetic system to detect p rotein2p rotein interactio ns. Nat ure , 1989 , 4 李凌云 劉鑫 齊義鵬 等 麻疹病毒絨猴細(xì)胞受體基因的克隆及功能鑒定 J . 科學(xué)通報(bào) ,2002 ,47 (16 : 12172122

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47、報(bào) 2006年 p rotein interactio ns and screening cDNA libraries. It has been imp roved and developed since it s original descriptio n. Recently , many new research techniques have been developed in or2 playing an important role in t he research of geno mics , p roteo mics and medicine exploitatio n. Thi

48、s paper summarizes it s t heo ry , imp rovement , develop ment and applicatio n. tem , rever se t wo2hybrid system , SOS recruit ment system and ot her derived systems. It is SOS recruit ment system Key words : Yeast t wo2hybrid system ; Yeast o ne2hybrid system ; Yeast t hree2hybrid system ; 1994-2

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