植物組織培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)

1、1 / 26植物組織培養(yǎng)的一些注意事項(xiàng)一、常用培養(yǎng)基主要特性1、高鹽成分培養(yǎng)基包括 MS、 LS、BL、BM、ER 等培養(yǎng)基。其中 MS 培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛，其鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量均較高，微 量元素種類齊全 , 其養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例均比較合適 , 廣泛用于植 物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。 LS、 BM、 ER 培養(yǎng)基 由 MS 培養(yǎng)基演變而來。2 、硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基包括 B5 、 N6 、 LH、 GS 等培 養(yǎng)基。1B5 培養(yǎng)基 B5 培養(yǎng)基除含有較高的鉀鹽外，還含有較低的銨態(tài)氮和較高的鹽酸硫胺素 , 較適合南洋杉、 葡萄及豆科與十字花科植物等的培養(yǎng)。2N6 培養(yǎng)基 N6 培養(yǎng)基

2、(朱至清等 1975 )系我國學(xué)者創(chuàng)造獲國家發(fā)明二等獎(jiǎng) , 適用于單子葉植物花藥培養(yǎng) , 柑橘花藥培 養(yǎng)也適合 , 在楸樹、針葉樹等的組織培養(yǎng)中使用效果也好。3SH 培養(yǎng)基是 礦鹽濃度較高的一種培養(yǎng)基，其中銨與磷酸是由磷酸二氫銨( NH4 H2 PO4 ) 提供的 , 這種培養(yǎng)基適合于某些單子葉及 雙子葉植物的培養(yǎng)。3 、中等無機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基1H 培養(yǎng)基本培養(yǎng)基大量元素約為 MS 培養(yǎng)基的一半，僅磷 酸二氫鉀及氯化鈣稍低 , 微量元素種類減少 , 而含量較 MS 為高 , 維生素種類比 MS2 / 26多。適于花藥培養(yǎng)。2尼奇培養(yǎng)基 (Niotsch 1969 ) 此培養(yǎng)基與 H 培養(yǎng)基成分

3、基 本相同 , 僅生物素比 H 培養(yǎng)基高 10 倍。也適合于花藥培養(yǎng)。3米勒培養(yǎng)基 (Miller 1963 ) 此培養(yǎng)基和 Blaydes(1966) 培養(yǎng)基二者成分完全相同。 適合大豆愈傷組織培養(yǎng)和花藥等培養(yǎng) 用。4 、低無機(jī)鹽培養(yǎng)基大多情況下用于生根培養(yǎng)基。 有以下幾 種:1改良懷特培養(yǎng)基 (White 1963 )2WS 培養(yǎng)基(Wolter & Skoog 1966)3克諾普液 ( Knop 1965 ) 花卉培養(yǎng)上用得多。4貝爾什勞特液 (Berthelot 1934)5HB 培養(yǎng)基(Holley & Baker 1963)此培養(yǎng)基在花卉脫毒培養(yǎng)和木本植物的莖尖培養(yǎng)

4、中效果良好。 其成分是大量元素比 1/ 2 克諾普( Knop ) 液稍多 , 微量元素用貝爾什勞特液 , 每升培養(yǎng)基中加 0 . 5ml二、與培養(yǎng)基有關(guān)的一些細(xì)節(jié)問題1 培養(yǎng)基所用藥品應(yīng)采用等級(jí)較高的化學(xué)純CP（三級(jí)）及分極純 AR（二級(jí)）,以免雜質(zhì)對(duì)培養(yǎng)物造成不利影響。2、調(diào)節(jié) Ph 也可用精密 pH 試紙（應(yīng)在干燥器中保存，以免吸濕3 / 26而失效） 。培養(yǎng)基過酸的可用 1mol/ L 氫氧化鈉 （ NaOH） 來調(diào)節(jié); 培養(yǎng)基過堿的可用 1mol/ L 鹽酸（ HCl ） 來調(diào)節(jié)（ 1mol/ L NaOH 的配制方法是稱40gNaOH, 溶解后加入蒸餾水 , 定容到 1 000ml

5、 即可。 1mol/ L HCl 的配制方法是量取 12mol/ L HCl 84ml ,加水定容至 1 000ml） 。經(jīng)高壓蒸汽滅菌后 , 由于某些成分的分解 （如蔗糖的分解 ） 或氧化 , 酸度會(huì)增加 （ pH 值一般可降低 0 .2 ） 。有時(shí)玻璃器皿質(zhì)量較差 , 其中一部分物質(zhì)溶解 , 也會(huì)影響 酸度的變化。這些在調(diào)整 pH 值時(shí)都要考慮進(jìn)去。分裝后應(yīng)立即 滅菌, 若因故不能及時(shí)滅菌 , 最好放入冰箱中在 24h 內(nèi)完成滅 菌工作。滅菌時(shí)壓力表讀數(shù)為 0 . 8kg/cm21 . 1kg/ cm, 121C時(shí)保持 15min20min 即可。3、某些生長調(diào)節(jié)物質(zhì) , 如吲哚乙酸、玉米

6、素及某些維生素 等物質(zhì)遇熱不穩(wěn)定 , 因此不能進(jìn)行高壓滅菌 , 而需用過濾方法滅菌 , 經(jīng)過濾滅菌的溶液 , 可在瓊脂培養(yǎng)基溫度下降到大約40C時(shí)加入到已高壓滅菌的培養(yǎng)基中。4、配好的培養(yǎng)基可放到培養(yǎng)室中預(yù)培養(yǎng) 3d , 若沒有污染反 應(yīng), 則證明是可靠的 , 可以使用。暫時(shí)不用的培養(yǎng)基最好置于 10C下保存，含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基在 4C5C低溫下保 存則更理想。 含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基應(yīng)在配制一周內(nèi)用完 其他培養(yǎng)基至多也不能超過一個(gè)月。 一般情況4 / 26下 , 兩周內(nèi)應(yīng)用完 以免干燥變質(zhì)。三、培養(yǎng)材料及消毒1、 取材季節(jié)的影響：大多數(shù)植物應(yīng)在其生長開始的季節(jié)采 樣, 生長末期或已

7、進(jìn)入休眠期 , 則外植體對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)遲鈍或無 反應(yīng)。2、 器官的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡：沿植物的主軸 , 越向上的 部分所形成的器官其生長的時(shí)間越短 , 其生理年齡也越老 , 越 接近發(fā)育上的成熟 , 越易形成花器官。 反之, 越向下, 其生理年 齡越小。木本植物的組織培養(yǎng)中 , 以幼齡樹的春梢嫩枝段或基部 的萌條較好 , 下胚軸與具有 3 對(duì) 4 對(duì)真葉的嫩莖段 , 生長效 果也較好 。一般情況下 , 幼年組織比老年組織具有較高的形態(tài) 發(fā)生能力。3、材料大小的影響：材料越小成活率越低 , 莖尖培養(yǎng)存活 的臨界大小應(yīng)為一個(gè)莖尖分生組織帶 1 個(gè)2 個(gè)葉原基，約 0 .2m m0 .3mm 大小。葉片

8、、花瓣等約為 5mrm,莖段則長約 0 .5mm。因此,除非用于去除病毒否則不宜將外植體切的過小。但并不是說外植體越大越好 , 外植體過大易造成污染 ,有實(shí)驗(yàn) 證明外植體越大污染率越高。4、材料的滅菌：一般是組織越大越易污染 , 夏季比冬季帶 菌多，甚至不同年份污染的情況也有區(qū)別。 取材最好選在中午或 下午 , 避開陰雨天取5 / 26材可減少污染率。 消毒是為了消滅病菌 , 以 保證無菌組織培養(yǎng)的進(jìn)行。 但不同植物及一株植物不同部位的組 織, 其帶菌程度不同 , 它們對(duì)不同種類、不同濃度的消毒劑的敏 感度也不一樣。 最初所使用的消毒劑種類 , 濃度及消毒時(shí)間的長 短都要進(jìn)行摸索 , 以達(dá)到最

9、佳的消毒效果。材料有絨毛最好在消毒液中加入幾滴吐溫 - 80 , 對(duì)與難消毒 的根及地下部位材料 可將其浸入消毒液中進(jìn)行抽氣減壓 , 以幫 助消毒液的滲入 , 從而達(dá)到徹底滅菌的目的。潘學(xué)峰等 ( 1998) 報(bào)道, 12% 的雙氧水+ 0 .1% 的升汞混合液對(duì)南方地下莖生姜滅菌 10min 的效果最好。四、材料的接種1、接種室的消毒：植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)際上是一種無菌操 作和無菌培養(yǎng)技術(shù) , 做好接種室的消毒是至關(guān)重要的。 污染的主 要來源是空氣中的細(xì)菌和真菌孢子 , 因此 , 每次接種前應(yīng)進(jìn)行 地面的清潔衛(wèi)生工作 , 并用 70%酒精噴霧使空氣的灰塵沉降 , 并 用紫外線燈照射 20min

10、。接種前超凈工作臺(tái)面要用新潔爾滅或酒 精擦洗 , 并定期清洗過濾膜 , 以延長使用壽命。2、 無菌操作要求： 工作人員使用的工作服、 帽子、口罩等 , 要經(jīng)常保持干凈 , 并定期進(jìn)行消毒 , 即將洗凈、晾干的衣帽、 口 罩等用紙包好后與培養(yǎng)基一起進(jìn)行高壓滅菌。工作人員的頭發(fā)、 衣服、手指中都帶有許多雜6 / 26菌 , 為此要穿上工作服 , 戴上帽子 , 也必須剪除指甲 , 并用肥皂擦洗 , 最好再在新潔爾滅溶液中浸 泡 10min , 接種操作前則用 70%酒精擦洗。工作人員的呼吸所產(chǎn) 生的污染 ,主要是在接種時(shí)談話或咳嗽所引起的 , 因此 , 在操作時(shí)應(yīng)禁止談 話并應(yīng)戴上口罩。3、材料的分

11、離、切取和接種切割動(dòng)作要快 , 防止擠壓使材料受損傷而招致培養(yǎng)失敗 , 也要避免使用生銹的刀片 , 以防止氧化現(xiàn)象產(chǎn)生。 接種時(shí)要防止 交叉污染的發(fā)生 ,刀和鑷子等接種工具使用一次應(yīng)放入 70% （ 或 95%）酒精中浸泡 , 然后灼燒放涼備用。接種時(shí)輕輕取下封口紙 , 動(dòng)作要慢以免氣流沖入瓶中造成 污染。將瓶口靠近酒精燈火焰 , 瓶口傾斜 , 以免空氣中的微生物 落入瓶中 , 將瓶口外部在燈焰上燎數(shù)秒鐘 , 將灰塵雜物等固定在 原處 , 然后用鑷子將外植體送入瓶中 , 材料在培養(yǎng)容器內(nèi)的分 布要均勻 , 以保證必要的營養(yǎng)面積和光照條件。莖尖、 莖段等基 部插入固體培養(yǎng)基中 , 葉片通常將葉背

12、接觸培養(yǎng)基 , 這是由于 葉背氣孔多 , 利于吸收水分和養(yǎng)分的緣故。7 / 26五、材料的初代培養(yǎng)1、實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)1）、單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：單因子實(shí)驗(yàn)是組織培養(yǎng)中最常用的 實(shí)驗(yàn)方法 , 尤其在選擇適當(dāng)?shù)募に胤N類和濃度配比上使用最多。2 ）、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)植物離體培養(yǎng)的成功是由多種因素決定 的。正交設(shè)計(jì)是多因素分析的有力工具 , 它可以很方便的從眾多因素中選出主要影響因素及最佳水平 , 因?yàn)樗梢杂幂^少的實(shí) 驗(yàn)次數(shù)得到較多的信息。 例如 , 一個(gè) 7 因素水平的實(shí)驗(yàn) , 若將各 因素水平全部組合都做一遍 , 需要 27= 128 次, 而正交設(shè)計(jì)只 需做 8 次實(shí)驗(yàn)就可以了 , 雖然實(shí)驗(yàn)次數(shù)減少了

13、, 但因?yàn)楦饕蛩?水平搭配均勻 , 8 次實(shí)驗(yàn)基本代表了全部實(shí)驗(yàn)的情況。正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) , 主要工具是正交表。 大多數(shù)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)書 都列出了可供選擇的正交表，如 L4( 23) , L8(27)見(表 2 - 11 , 表 2 - 12) 。字母 L 右下角號(hào)碼 8 表示它有 8 個(gè)實(shí)驗(yàn)要做 , 括號(hào) 內(nèi)的指數(shù) 7 表示這張表所安排的實(shí)驗(yàn)最多可考察 7 個(gè)因素(也可 安排 2 個(gè)6 個(gè)，超過 7 個(gè)要選擇其他正交表)，底數(shù) 2 表示 被考察的因素只要求兩個(gè)水平。 在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前可根據(jù)要測(cè)試因素 的多少及每種因素所考察的水平 , 選擇適合的正交表 , 然后按 表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 現(xiàn)舉一個(gè)例子來說明 ,

14、設(shè)影響某種植物試管苗生長 的因素有光照時(shí)間、光照強(qiáng)度、pH 值、溫度、蔗糖濃度、BA 濃度、 NAA 濃度 7 個(gè)因素, 每個(gè)因素選擇兩個(gè)水平 , 即, 光照時(shí)間 ( 10h , 14h ) 、光照強(qiáng)度 (1000lx , 2000lx )、 pH 值( 5 . 5 ,8 / 265.8 )、溫度(20C, 25C)、BA 濃度(0.5,2.0 )、NAA 濃度( 0 . 5 ,1 . 0) 、蔗糖濃度 (2% , 4%) ?，F(xiàn)根據(jù)因素和 水平的多少選擇一個(gè)適合本實(shí)驗(yàn)的正交表，選 L8(27)最理想，填表時(shí),因素水平對(duì)號(hào)入座,見表（2 -13 ）。第一號(hào)實(shí)驗(yàn)是光 照時(shí)間 10h/ d、光照強(qiáng)度

15、1000lx、pH 值 5.5、BA 濃度 2.0、NAA 濃度 0.5、蔗糖濃度 4% ,其他實(shí)驗(yàn)依次類推。根據(jù) 8 個(gè)實(shí) 驗(yàn)結(jié)果，如出苗數(shù)量、苗高、生根數(shù)、移栽成活率等，綜合考慮, 根據(jù)需要選取各最適培養(yǎng)條件。也可通過一定的計(jì)算方法（參考統(tǒng)計(jì)學(xué)書），算出極差（R）,極差（R）表示每個(gè)因素在實(shí)驗(yàn)中 所起作用的大小，R 越大表示該因素的不同水平對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的 影響越大，但若沒有可計(jì)算的指標(biāo)時(shí)，還是選擇單因子實(shí)驗(yàn)較 好。表2 - 11J（丹正交表123111122123122斗2219 / 26表2 - 12 Lfi(2j正交表12345671111221222122111312222214221

16、212251121122621112217121111182221212S 2 - 13某植物試管苗生長正交實(shí)驗(yàn)方秦表光愿吋間h d光照強(qiáng)度1XmH值溫度tBAmg LNAAmg L麓糖%11(10)1(1 000)1C5.5)2(25)22)1(0-5)2(4)42(14)125想）21(0.5)11(2)312(2 000)2222(1)14221212751121(20)1226211122171匕1111182212122、初代培養(yǎng)物的建立1）、保證無菌2）、條件合適：首先，一定要選擇好合適的作物種類、品種 及培養(yǎng)的部位；其次,一定要選擇合適的培養(yǎng)基，激素及其他添 加物；還要注意掌握適

17、宜的環(huán)境條件。 所以在進(jìn)行一種植物的組 織培養(yǎng)之前，應(yīng)查找該種植物有關(guān)方面的資料，根據(jù)這種植物10 / 26過去所采用的培養(yǎng)部位、 培養(yǎng)基、 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)技術(shù)等 , 再?zèng)Q 定自己的工作步驟。3）、操作技術(shù)過關(guān)3、污染的防治1）、植物材料的選擇及防止污染 通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料帶菌多 ; 老 的材料比幼嫩的材料帶菌多 ; 田間生長的材料比溫室生長的材 料帶菌多 ;帶泥土的材料比不帶泥土的材料帶菌多。 為此對(duì)于培 養(yǎng)材料的取材就應(yīng)很認(rèn)真地加以選擇 , 以減少污染的發(fā)生。用莖尖作外植體時(shí) , 應(yīng)在室內(nèi)或無菌條件下對(duì)枝條進(jìn)行預(yù) 培養(yǎng)。將枝條用水沖洗干凈后插入無糖的營養(yǎng)液或自來水中

18、, 使 其發(fā)枝 , 然后以這種新抽的嫩枝條作為外植體 , 便可大大減少 材料的污染?；蛟跓o菌條件下對(duì)采自田間的枝條進(jìn)行暗培養(yǎng) ,待 抽出徒長的黃化枝條時(shí)取材 , 也可明顯地減少污染。對(duì)木本植物等難以消毒的材料可采用多次滅菌法。 如將切好 的外植體放入 1 .3% 次氯酸鹽溶液中 （商品漂白粉 25%的溶液 ）消 毒 30min ,然后用無菌水沖洗 3次,再放在無菌條件下,次日用 2 . 6% 次氯酸鈉滅菌 30min , 然后用無菌水沖洗 3 次。也可采用 多種藥液多次浸泡法 , 以加強(qiáng)滅菌效果。材料內(nèi)部易感染病菌,在這種情況下,必須在培養(yǎng)基中加 入抗生素類，防止初代培養(yǎng)物污染。11 / 26表2* U培養(yǎng)基中抗生物質(zhì)對(duì)偵肪樂菌的效果培養(yǎng)種類濃庫（n】gL）抗生物兩銀杏冬肯月李100+20+ + -F + + + + + +-F地霉素50+ + + + + + -F +夾竹桃需素20斗+斗+ + + + + +斗+ +斗+桿繭at50+