注射用紫杉醇脂質體包封率有關物質含量測定檢驗方法學確認方案

1、注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認方案文件編號：VP-4F97MV-002012年10月南京綠葉思科藥業(yè)有限公司Nanjing Luye Sike Pharmaceutical Co.,Ltd目 錄1.概述12.目的13.范圍14.風險評估15.計劃確認時間16.確認人員及職責17.確認前準備28. 確認內容39. 可接受標準810. 偏差調查及異常情況811. 綜合分析與結果評價812. 驗證結論和監(jiān)測建議813. 附件91. 概述現(xiàn)行的注射用紫杉醇脂質體質量標準為國家藥品標準WS-718(X-529)-2002，為了確認包封率、有關物質、含量測定檢驗方法在本公司質管

2、部實驗室條件下的適用性，特制定本確認方案。2. 目的確認注射用紫杉醇脂質體質量標準（國家藥品標準WS-718(X-529)-2002）中包封率、有關物質、含量測定檢驗方法在本公司質管部實驗室條件下的適用性。3. 范圍本確認方案適用于注射用紫杉醇脂質體國家藥品標準WS-718(X-529)-2002中包封率、有關物質及含量測定檢驗方法在本公司質管部實驗室的方法學確認。4. 風險評估編號風險影響SPD風險等級確認活動1未按照方案執(zhí)行。導致確認結果不可信。322高確認前對參與確認的人員進行培訓。2未按照SOP執(zhí)行操作。導致確認結果不可信。322高確認過程和結果由另一人進行復核。注：S: 嚴重性 P:

3、可能性 D:可檢測性5. 計劃確認時間確認實施時間計劃為2012年10月26日至 2012年11月10日。 6. 確認人員及職責6.1 確認小組組長姓名部門職務責任王晟質管部檢驗員負責確認方案的起草，在方案批準后，對確認小組成員進行本方案的培訓。負責確認方案的實施。確認過程中，如有偏差，及時報告并配合調查，保證按偏差處理程序進行調查和處理。確保報告的生成、審核和批準。6.2 確認小組成員姓名部門職務責 任毛圣淼質管部檢驗員在方案批準后，按確認方案實施，收集、整理數(shù)據(jù)，完成確認記錄，對確認過程中出現(xiàn)的偏差及時報告并配合調查。待確認完成后，起草確認報告。7. 確認前準備7.1 確認相關文件（檢查記

4、錄見附表一：確認文件檢查記錄）7.1.1 方案建立的依據(jù)l 注射用紫杉醇脂質體質量標準（WS-718(X-529)-2002）l 中國藥典（2010年版） 藥品質量標準分析方法驗證指導原則l 藥品GMP指南（2011年版） 分析方法的驗證和確認7.1.2 公司相關管理制度l 偏差管理規(guī)程（SMP-QA-024）l 驗證程序管理規(guī)程（SMP-QA-032）l 驗證文件管理規(guī)程（SMP-QA-030）7.1.3 確認必備的操作規(guī)程無。7.1.4 相關質量標準和檢驗規(guī)程及檢驗儀器的操作規(guī)程l Agilent1200 高效液相色譜儀操作維護保養(yǎng)規(guī)程（SOP-EM-521）l METTLER-TOLED

5、O XS105分析天平操作規(guī)程（SOP-EM-519）7.2 參與確認人員的培訓確認開始前必須保證所有人員都經過相應的培訓，并做好培訓記錄。（見附表二：人員培訓記錄）7.3 支持儀器/設備有效期確認確認開始前必須對確認中所需要的檢測儀器/設備的有效期進行檢查，保證所用檢驗儀器/設備在確認實施中是處于合格有效的，并做好檢查記錄。（見附表三：檢驗儀器的有效性記錄）8. 確認內容8.1 試劑及儀器設備試劑列表試劑名稱來源紫杉醇對照品自標（云南漢德）甲醇（色譜純）Tedia Company,InC. USA注射用水制水三室分析儀器列表設備名稱生產公司名稱型號設備編號電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司X

6、S105002高效液相色譜儀美國安捷倫科技公司Agilent 1200014色譜柱漢邦科技4C18254F090109048.2 包封率檢驗方法學確認 檢驗方法色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇:水（3:1）為流動相，檢測波長為227nm。理論板數(shù)按紫杉醇峰計算，應不低于1000。供試品溶液的制備：取本品1瓶，加5%葡萄糖注射液7.5ml,旋渦混勻10分鐘,使成每1ml中含紫杉醇約為4mg的乳濁液。測定法：取用水充分溶脹后的葡聚糖凝膠(SephadexG-50，100-300µ)加入內徑為0.7cm的層析柱中,使凝膠層高約為21cm，用水100ml分次加入柱中，使柱平衡

7、，精密吸取供試品溶液0.2ml,沿管壁加至凝膠層面上，用少量水沖洗層析柱壁，每次1ml，共兩次，使樣品進入凝膠柱，然后用細玻璃棒輕輕攪勻樣品層（約1cm高）。用水洗脫，自洗脫液出現(xiàn)輕微渾濁，即開始定量收集洗脫液15ml，搖勻，精密量取2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為測定被包封的紫杉醇含量ME的溶液。凝膠柱再用不同濃度的乙醇梯度洗脫（沿管壁緩緩依次加入33%乙醇3ml，66%乙醇3ml及無水乙醇），棄去洗脫液10ml，立即開始定量收集游離紫杉醇部分，共收集5ml，作為測定MF的溶液。照含量測定項下的色譜方法，取ME 和MF溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積

8、按下式計算包封率和回收率：包封率（%）=×100% 回收率（%）=式中：ME為被包封在脂質體中的紫杉醇的峰面積 MF為未被包封的游離紫杉醇的峰面積。 為總紫杉醇的峰面積。8.2.2 確認項目的確定根據(jù)藥品GMP指南（2011年版） 分析方法的驗證和確認，參照含量測定法的確認項目，應該要確認的項目有專屬性、精密度；由于包封率的樣品由收集獲得，可能存在收集不完全而使結果產生偏差，所以準確度也需確認，在本方案中增加回收率實驗。則需要確認的項目為專屬性、精密度、準確度。8.2.3 專屬性8.2.3.1 操作方法按處方量精密稱取輔料，置于20ml西林瓶中，加入5%葡萄糖注射液7.5ml，渦旋振

9、蕩10min，配置成空白輔料溶液。取空白輔料溶液，按照項下的測定法操作，將收集到的ME、MF和ML各精密量取20l注入液相色譜儀。記錄色譜圖。8.2.3.2 接受標準用空白輔料溶液收集得到的ME、MF和ML色譜圖在紫杉醇峰位置均應無干擾。 進樣精密度8.2.4.1 操作方法按照項測定法配制ME溶液，分別精密量取20l注入液相色譜儀，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖。8.2.4.2 接受標準連續(xù)6次測定的ME主峰面積的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。8.2.5 重復性8.2.5.1 操作方法取注射用紫杉醇脂質體3瓶，分別加入5%葡萄糖注射液6.2、7.5、9.4ml渦旋振蕩溶解，每瓶按照項下的測

10、定法分別操作3次，計算包封率。8.2.5.2 接受標準9次包封率的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。8.2.6 回收率8.2.6.1 操作方法取注射用紫杉醇脂質體3瓶，分別加入5%葡萄糖注射液6.2、7.5、9.4ml渦旋振蕩溶解，每瓶按照項下的測定法分別操作3次，計算回收率。8.2.6.2 接受標準9次回收率均應在98.0102.0%之間，其相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。8.3 有關物質檢驗方法學確認8.3.1 檢驗方法色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇:水（3:1）為流動相，檢測波長為227nm。測定法：取本品適量，加甲醇制成每1ml中約含紫杉醇1.5mg的溶

11、液，作為供試品溶液；精密量取適量，加甲醇稀釋制成每1ml中含紫杉醇0.045mg的溶液，作為對照溶液。照含量測定項下的色譜方法，取對照溶液20l注入液相色譜儀，調節(jié)檢測器靈敏度，使主成分峰的高達記錄儀滿量程的30%；再準確量取對照溶液和供試器溶液各20l，注入液相色譜儀，記錄供試品溶液色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液的色譜圖中如顯雜質峰，計算各雜質峰面積的總和，不得大于對照溶液的主峰面積的1.5倍（4.5%）。8.3.2 確認項目的確定 根據(jù)藥品GMP指南（2011年版） 分析方法的驗證和確認，有關物質應該要確認的項目有專屬性、定量限、精密度；由于有關物質檢測沒有規(guī)定已知雜質，因此不

12、進行準確度確認。 專屬性8.3.3.1 操作方法精密稱取注射用紫杉醇脂質體0.63g，用甲醇溶液定容于10ml容量瓶，制成每1ml中約含紫杉醇1.5mg的供試品溶液。按處方量配制空白輔料溶液：精密稱取各輔料，置于20ml容量瓶中，用甲醇溶解定容。精密量取上述溶液各20ul，按照有關物質供試品溶液方法注入液相色譜儀，記錄色譜圖。8.3.3.2 接受標準在該色譜條件下，空白輔料在紫杉醇位置不出峰。 進樣精密度8.3.4.1 操作方法取1瓶注射用紫杉醇脂質體，精密稱取供試品0.63g，加甲醇溶于10ml容量瓶中，制成每1ml中約含紫杉醇1.5mg的供試品溶液，精密量取供試品溶液3ml,加甲醇溶于10

13、0ml容量瓶中，制成每1ml中含紫杉醇0.045mg的對照溶液。分別精密量取對照溶液20ul，按照有關物質方法注入液相色譜儀，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖。8.3.4.2 接受標準6次測得的對照主峰面積的相對標準偏差（RSD）應不大于5.0%。8.3.5 定量限精密稱取紫杉醇對照品15mg，用甲醇溶液定容于10ml容量瓶，制成每1ml中約含紫杉醇1.5mg的供試品溶液。用甲醇逐步稀釋供試品溶液并精密量取20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖，觀察紫杉醇峰的信噪比，直至峰高為基線噪音的10倍時，記錄此時紫杉醇對照品的進樣量，即為其定量限。 重復性8.3.6.1 操作方法取4瓶注射用紫杉醇脂質體，分別精密

14、稱取供試品0.63g，加甲醇溶于10ml容量瓶中，制成每1ml中約含紫杉醇1.5mg的供試品溶液，精密量取供試品溶液3ml,加甲醇溶于100ml容量瓶中，制成每1ml中含紫杉醇0.045mg的對照溶液，分別精密量取20ul注入液相色譜儀，計算有關物質的值。共配制6份供試品溶液進行檢驗。8.3.6.2 接受標準6份供試品溶液有關物質的值的相對標準偏差（RSD）應不大于5.0%。8.4 含量測定檢驗方法學確認 檢驗方法色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇：水（3:1）為流動相，檢測波長為227nm。理論板數(shù)按紫杉醇峰計算，應不低于1000。測定法：取本品3瓶，分別加甲醇使溶解，轉移至2

15、00ml量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇5ml，搖勻，用流動相稀釋至刻度。精密量取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取紫杉醇對照品約10mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。含紫杉醇(C47H51NO14)應為標示量的90.0110.0%。 確認項目的確定 根據(jù)藥品GMP指南（2011年版） 分析方法的驗證和確認，含量測定的確認項目為專屬性和精密度，準確度經評估后確定是否需進行確認。由于含量測定中供試品溶液的配制為甲醇溶解和稀釋，準確度

16、不會受實驗室條件的影響，由于準確度已經方法學驗證，本次不再進行確認。8.4.3 專屬性由于注射用紫杉醇脂質體含量測定和有關物質的色譜條件一致，且有關物質測定方法中各輔料的濃度遠大于含量測定方法中輔料的濃度，故含量測定方法的專屬性無需另外確認。8.4.4 進樣精密度8.4.4.1 操作方法精密稱取紫杉醇對照品10mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制成含紫杉醇0.04mg/ml的對照品溶液。精密量取20l注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。8.4.4.2 接受標準 6次的紫杉醇的峰面積的相對標準偏差（RSD）不得大

17、于2.0%。 重復性.1 操作方法對照品溶液：精密稱取紫杉醇對照品約10mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置10ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。供試品溶液：取本品3瓶，分別加甲醇使溶解，轉移至200ml量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度；精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇5ml，搖勻，用流動相稀釋至刻度。共制備6份供試品溶液。精密量取供試品溶液和對照品溶液各20µl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。8.4.5.2 接受標準 6份供試品含量的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。9. 可接受標準 確認按照確認方案執(zhí)行，各檢測項目符合合格標準。

18、項目標 準包封率進樣精密度連續(xù)6次進樣的主峰面積的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。專屬性用空白輔料溶液收集得到的ME、MF和ML色譜圖中在紫杉醇峰位置均應無干擾。重復性9次包封率的值的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%?；厥章?次回收率均應在98.0102.0%之間，其相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。有關物質進樣精密度連續(xù)6次測得的有關物質值的相對標準偏差（RSD）應不大于5.0%。專屬性空白輔料在紫杉醇位置不出峰。定量限定量限的紫杉醇峰的性噪比應10.0。重復性所得6份有關物質的值的相對標準偏差（RSD）應不大于5.0%。含量測定進樣精密度連續(xù)進樣6次的峰面積的相對標準偏

19、差（RSD）不得大于2.0%。專屬性空白輔料在紫杉醇位置不出峰。重復性六份含量的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。10. 偏差調查及異常情況實驗過程中任何失敗的測試，方案實施過程中任何驗證項目偏離標準均需復核和評估并查出原因。11. 綜合分析與結果評價確認小組成員負責完成各項確認記錄并起草確認報告。確認組長綜合確認實施情況及結果，就注射用紫杉醇脂質體質量標準（國家藥品標準WS-718(X-529)-2002）檢驗方法在本公司質管部實驗室條件下是否適用作出評定及結論。12. 確認結論和監(jiān)測建議確認小組根據(jù)確認過程和結果提出確認結論和日常監(jiān)測建議，報確認委員會審批，由確認委員會決定本次確認是

20、否有效和是否發(fā)放確認合格證書。13. 附件附表一：文件檢查記錄附表二：人員培訓記錄附表三：檢測儀器的有效性記錄附表四：確認結果記錄附表五：異常情況統(tǒng)計表附表六：偏差清單附表一： 文 件 檢 查 記 錄確認項目名稱： 注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號： VA-4F97MV-00 第1頁 共1頁> 序號文件名稱文件編號存放處結論：檢查人/日期：復核人/日期：附表二： 培 訓 記 錄確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F97MV-00 第1頁 共1頁> 培訓主題：主講人：培訓部門：培訓時間：培

21、訓方式：培訓地點：培訓內容：部門/班組姓名簽字部門/班組姓名簽字附表三：檢 測 儀 器 的 有 效 性 記 錄 確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F97MV-00 第1頁 共1頁> 序 號儀器名稱檢定/計量/校驗編號有效期至結論：檢查人/日期：復核人/日期：附表四：確認結果記錄確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F97MV-00 第 1 頁 共 8 頁包封率進樣精密度溫度：，濕度： %。儀器： 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：峰面積AsAs RSD(%)可

22、接受標準：連續(xù)6次進樣的主峰面積的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。結論：符合規(guī)定 不符合規(guī)定檢驗人/日期 復核人/日期 專屬性溫度：，濕度： %。儀器： 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：可接受標準：用空白溶液收集得到的ME、MF及空白溶液色譜圖中在紫杉醇峰位置均應無干擾。結論：符合規(guī)定 不符合規(guī)定檢驗人/日期 復核人/日期 重復性溫度：，濕度： %。儀器： 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：附表四：確認結果記錄確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F97MV-00 第 2 頁 共 8 頁ME峰面積ME

23、峰面積平均MF峰面積MF峰面積平均ML峰面積ML峰面積平均包封率（%）回收率（%）包封率RSD（%）123456789可接受標準：9次包封率的相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。結論：符合規(guī)定 不符合規(guī)定檢驗人/日期 復核人/日期 回收率附表四：確認結果記錄確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F97MV-00 第 3 頁 共 8 頁溫度：，濕度： %。儀器： 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：ME峰面積ME峰面積平均MF峰面積MF峰面積平均ML峰面積ML峰面積平均包封率（%）回收率（%）回收率RSD（%）1234567

24、89可接受標準：9次回收率均應在98.0102.0%之間，其相對標準偏差（RSD）應不大于2.0%。附表四：確認結果記錄確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F97MV-00 第 4 頁 共 8 頁結論：符合規(guī)定 不符合規(guī)定檢驗人/日期 復核人/日期 有關物質進樣精密度溫度：，濕度： %。儀器： 電子天平，儀器編號： ； 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：稱樣量（g）定容體積(ml)峰面積AsAs RSD(%)可接受標準：6次測得的對照主峰面積的相對標準偏差（RSD）應不大于5.0%。結論：符合規(guī)定 不符合規(guī)定檢驗人/日期

25、復核人/日期 專屬性溫度：，濕度： %。儀器： 電子天平，儀器編號： ； 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：附表四：確認結果記錄確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F97MV-00 第 5 頁 共 8 頁輔料膽固醇卵磷脂葡萄糖蘇氨酸稱樣量（g）定容體積(ml)紫杉醇位置有無峰可接受標準：空白輔料在紫杉醇位置不出峰。結論：符合規(guī)定 不符合規(guī)定檢驗人/日期 復核人/日期 定量限溫度：，濕度： %。儀器： 電子天平，儀器編號： ； 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：稱樣量（mg）定容體積(ml)稀釋倍數(shù)最終濃度(µg/ml)定量限(ng)信噪比可接受標準：空白輔料在紫杉醇位置不出峰。結論：符合規(guī)定 不符合規(guī)定檢驗人/日期 復核人/日期 重復性溫度：，濕度： %。儀器： 電子天平，儀器編號： ； 高效液相色譜儀，編號： ；色譜柱系列號 。結果：附表四：確認結果記錄確認項目名稱：注射用紫杉醇脂質體包封率、有關物質、含量測定檢驗方法學確認確認項目編號：VA-4F