HE染色試驗技術(shù)及注意事項（厚義書苑）

1、HE染色試驗技術(shù)及注意事項1深思慮 HE染色又稱蘇木素-伊紅染色法，是普通光學(xué)顯微鏡觀察與鑒別細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的一種染色方法。2深思慮報告內(nèi)容lHE染色原理l試劑l染色步驟l注意事項l幾種常見的染色問題3深思慮HE染色原理蘇木素蘇木紅藍(lán)色色精分化和藍(lán)化氧化+鋁細(xì)胞核負(fù)電荷色酸（染料有色部分）伊紅染色染色正負(fù)電荷的極性吸附正電荷色酸（染料無色部分）水解滲透作用或者彌散作用完成4深思慮試劑l蘇木素染液（細(xì)胞核著色）l鹽酸乙醇分化液l稀氨水l伊紅染液l二甲苯l梯度濃度乙醇5深思慮染色步驟常常規(guī)規(guī)脫蠟脫蠟蘇蘇木素染色（木素染色（5-15min），水），水洗洗鹽鹽酸乙醇溶液分化（酸乙醇溶液分化（30s

2、），），水洗水洗伊伊紅紅染色（染色（1-3min），水），水洗洗氨水反氨水反藍(lán)藍(lán)（30s），），水洗水洗90%乙醇（乙醇（5min）80%乙醇（乙醇（30s）100%乙醇（乙醇（2次次10min）二甲苯（二甲苯（3次次5min）封片封片染色脫水透明封片脫蠟 染色的時間，應(yīng)根據(jù)室溫，及組織的具體情況來確定，染色的時間，應(yīng)根據(jù)室溫，及組織的具體情況來確定，做之前做預(yù)實驗。做之前做預(yù)實驗。6深思慮7深思慮注意事項l （1）脫蠟。切片脫蠟后才能染色，且脫蠟應(yīng)徹底。脫蠟好壞主要取決于二甲苯的溫度和時間，如果二甲苯是用過一段時間，切片又比較厚，室溫低應(yīng)增加脫蠟時間，脫蠟不凈是影響染色不良的重要原因之一。l

3、 （2）染色。根據(jù)實際情況，通過預(yù)實驗得到最佳染色時間。一般情況下新配的蘇木素染液中只需染13min 左右，應(yīng)根據(jù)染片的多少，逐步把染色時間延長。分化時間不易過長，分化應(yīng)在鏡下觀察，分化過度，應(yīng)水洗后重新在蘇木素染液中染色，在水洗分化和使切片在自來水或稀的氨水中充分變藍(lán)（藍(lán)化）。新配的伊紅染色塊，切片染色不易過長，應(yīng)根據(jù)染切片的多少逐步延長染色時間，切片使伊紅染后，分化時間要短。8深思慮l （3） 脫水。染色后通過各級酒精脫水，從低濃度到高濃度。低濃度酒精對伊紅有分化作用，切片經(jīng)過低濃度時要短，向高濃度逐漸延長脫水時間，脫水不徹底，使切片發(fā)霧，在顯微鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。l （4）透明與封片。

4、切片染色脫水后必須經(jīng)二甲苯處理，使切片透明，才能用樹膠封片。應(yīng)引起注意的是，二甲苯純度不純使切片透明不夠，會影響切片質(zhì)量。9深思慮幾種常見的染色問題l脫蠟脫蠟： 切片中白色的區(qū)域脫蠟不徹底，染色液由于石蠟斑點的殘留而不能滲透著色。原因：原因：烤( 烘) 片溫度太低，脫蠟前沒有充分烤( 烘) 干。 二甲苯脫蠟時間不足， 或二甲苯使用過久，造成脫蠟不盡。對策：對策：用無水乙醇去掉玻璃片上的水分，重新二甲苯脫去石蠟。 切片需退回到脫蠟步驟，延長脫蠟時間，或跟換二甲苯，駝色、漂白、重新染色。10深思慮l染色：染色：（1）蘇木素染色）蘇木素染色原因：原因：染色時間短；蘇木素過度氧化，失去染色能力；分化時

5、間過長。 蘇木素染色太淺，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)顏色對比度差。對策：對策：切片重新染色。11深思慮 細(xì)胞核過染， 核膜、核仁等不清晰， 細(xì)胞質(zhì)( 尤其是皮膚上皮細(xì)胞) 含有大量的細(xì)胞核染色液蘇木精， 導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例失調(diào)。原因：原因：與圖2相反，染色液時間過長、切片太厚、分化步驟時間太短。對策：對策：如果切片不是因為太厚，脫色、漂白、重新染色， 對于染色和分化時間做些適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。若太厚則需要重新切片。12深思慮 切片細(xì)胞核棕色， 表明蘇木精沒有充分藍(lán)化， 或蘇木精過度氧化失去染色能力原因：原因：蘇木精染色液過度氧化和切片在蘇木精染液染色后返藍(lán)不足。對策：對策：染色前檢查蘇木精染色液的染色能力，過

6、渡氧化，應(yīng)及時更換。其次，在蘇木精染色后， 給切片以足夠的藍(lán)化時間。13深思慮染色后有雜質(zhì)原因：原因：蘇木精染色液中的金屬膜，黏附在玻片上。對策：對策：每天染色前仔細(xì)過濾蘇木精染色液，或建議使用半氧化蘇木精染色液。14深思慮（2）伊紅著色 切片中央?yún)^(qū)域伊紅染色不均勻， 可能為弱堿性溶液殘留導(dǎo)致伊紅拒染所致原因：原因：伊紅染液的pH 值可能大于5 ；也可能是藍(lán)化液殘留過多；切片太??；或切片經(jīng)伊紅染色后在乙醇脫水時間過長。對策：對策：檢查伊紅染液的pH值，用乙酸將其調(diào)節(jié)在4.6-5.0 之間，使伊紅染色色彩艷麗。確保每次藍(lán)化后，用自來水沖干凈。檢查切片的厚度。脫水時不要讓切片在低濃度乙醇停留時間過

7、長， 因為含水多的低濃度乙醇會將伊紅的顏色分化掉。15深思慮原因：原因：伊紅染色液濃度太高；切片在伊紅染色時間過長；切片在伊紅染色后經(jīng)乙醇脫水步驟時過的太快， 而使乙醇分化伊紅的作用不能產(chǎn)生。對策：對策：適當(dāng)稀釋伊紅染色液，減少伊紅染色時間，或者使切片在乙醇脫水等步驟時，停留時間相對均勻。同樣， 也要檢查切片的厚度是否合適。 伊紅深染導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)沒有層次，缺乏對比16深思慮 在顯微鏡下呈現(xiàn)大量水珠或云霧狀改變原因：原因：切片經(jīng)梯度乙醇處理后沒有完全脫水， 導(dǎo)致二甲苯透明中性樹膠封固后殘留大量水分。也可能是封片的時候出現(xiàn)的氣泡。對策：對策：移去蓋玻片， 用二甲苯溶解封固劑如中性樹膠。將切片

8、置入新鮮的無水乙醇換幾道。待切片重新脫水完全后，用新二甲苯透明， 中性樹膠封固。所有用于脫水和透明的液體，在使用一定時間以后，應(yīng)即時更換。將切片浸如二甲苯中，重新封片。l封片：封片：17深思慮蓋玻片上有封固劑所致切片組織模糊不清原因：原因：蓋玻片上可能有封固切片的封固劑。對策：對策：移去蓋玻片， 重新用干凈的蓋玻片封片。18深思慮 封片后鏡下則會出現(xiàn)類似色素的點狀結(jié)晶或類似“裸核”樣的改變原因：原因：切片封片前放置在空氣中時間太長， 以至于二甲苯揮發(fā)切片干燥所致。對策：對策：移去組織切片上的蓋玻片和封固劑， 重新處理。將切片水洗數(shù)分鐘，然后重新脫水、透明、封固。封片過程中要保持組織切片的輕度濕潤，盡量不要讓其干燥。19深思慮原因：原因：蓋玻片彎曲或不平整；