(上)證明力與證據(jù)能力規(guī)則演變規(guī)律探究

1、超高壓提取山茱萸中熊果酸優(yōu)化工藝研究請(qǐng)?jiān)诖宋纳线M(jìn)行修改，并不接受修訂。請(qǐng)補(bǔ)充作者和基金項(xiàng)目信息。摘要：【目的】研究超高壓法提取山茱萸中熊果酸的最佳工藝條件，探討山茱萸中熊果酸提取的適宜方法?！痉椒ā吭趩我蛩卦囼?yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)超高壓提取山茱萸中熊果酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以熊果酸得率為指標(biāo)，考察料液比(g：mL)、乙醇濃度、超高壓壓力、加壓時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響；同時(shí)與回流提取法和超聲提取法進(jìn)行比較?！窘Y(jié)果】超高壓提取山茱萸中熊果酸的優(yōu)化工藝條件為：固液比1:22、乙醇濃度7570%、超高壓壓力320 MPa, 超高壓時(shí)間4 min，該條件下熊果酸得率可達(dá)0.322%?！窘Y(jié)論】超

2、高壓提取熊果酸得率高，提取時(shí)間短，是一種提取山茱萸中熊果酸的適宜方法。關(guān)鍵詞：超高壓；山茱萸；熊果酸；提取工藝中圖分類號(hào):TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：BStudy on extraction of ursolic acid from Cornus officlnalis seb.et zucc by ultra high pressure method Abstract: ：請(qǐng)根據(jù)修改后的中文摘要重新撰寫(xiě)英文摘要?！綩bjective】To study the optimum ursolic acid of extracting.conditions ursolic acid from Cor

3、nus officlnalis seb.et zucc by ultra high pressure(UHP). 【Objective】Basid on signal factor test, the L9(34) orthogonal design was used to optimum UHP extraction conditions which extract ursolic acid from Cornus officlnalis seb.et zucc . Using extraction yield of ursolic acid as index, the influence

4、of solid to liquid ratio, ethanol concentration,UHP pressure, UHP time were studied, and the yield with UHP method was compared to reflux extraction method and ultrasonic wave extraction method.Ultra high pressure (UHP) method was studied and was compared to reflux extraction method and ultrasonic w

5、ave extraction method. According to the signal factor test, the L9(34) orthogonal design was used to optimum extraction conditions. Using with extraction yield of ursolic acid as index, the influence of solid to liquid ratio, ethanol concentration,UHP pressure, UHP time were studied. 【Result】Optimum

6、 extraction conditions by UHP extraction were as follows: solid to liquid ratio1:22(g:mL), ethanol75ethanol70%, UHP pressure 320Mpa and UHP time 4min, The yield of UA was 0.322%.【Conclusion】The UHP extraction method was a suitable method for it has higher yield and shorter extraction time.Key words:

7、 Ultra high pressure; Cornus officlnalis seb.et zucc.; ursolic acid; extraction 【研究意義】山茱萸( Cornus officlnalis Sieb.et Zucc.)為山茱萸科山茱萸屬小喬木（蘇秀梅，2012），其果實(shí)含有豐富的功能性成分。研究表明，山茱萸中的熊果酸具有抗氧化、降血糖等作用（楊劍芳等,2006；袁菊麗和姜紅波,2011；張茜等,2011）。因此，提取山茱萸中熊果酸成分，以開(kāi)發(fā)保健食品具有廣闊的前景。【前人研究進(jìn)展】目前，一些研究者已經(jīng)研究了一些山茱萸中熊果酸的提取方法。張如新等（2008）采用超聲

8、法提取山茱萸中熊果酸成分，得到超聲波法提取山茱萸中熊果酸的最佳工藝參數(shù)為：用15倍量無(wú)水乙醇浸泡24 h，在輸入功率40%下超聲10 min, 熊果酸得率為0.86。胥佰濤等（2009）采用發(fā)酵結(jié)合超聲波輔助法提取山茱萸中的熊果酸，在30下、酵母接種量和原料質(zhì)量比為3:80、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，發(fā)酵效果好,在酒精濃度85、溫度50、超聲功率100 W、時(shí)間30 min條件下提取效果最好，熊果酸得率為0.2512。阮麗紅和姜春鵬（2010）采用超微粉碎回流提取法提取山茱萸中熊果酸成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較適宜的工藝條件為：粉碎粒度20m、提取溫度70、提取時(shí)間22min、乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，熊

9、果酸得率可達(dá)0.213%。張永生等（2011）通過(guò)乙醇回流提取法對(duì)山茱萸中熊果酸的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到優(yōu)化的工藝條件為乙醇濃度為75、料液比為12 mL/g、提取時(shí)間為1.5 h，熊果酸得率達(dá)0.31。【本研究切入點(diǎn)】超高壓提取是在常溫條件下提取植物原料中有效成分的新技術(shù)，該技術(shù)具有提取時(shí)間短、能耗低、有效成分破壞小的優(yōu)點(diǎn)。凌慶枝等（2008）采用超高壓技術(shù)提取桑葉多糖；縱偉和李翠翠（2012）采用超高壓法在常溫下提取鐵皮石斛中的多糖成分；董海麗和劉紅（2012）采用超高壓方法提取柿葉中熊果酸。但目前超高壓技術(shù)在山茱萸中熊果酸提取的應(yīng)用上仍未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在單因素試驗(yàn)的

10、基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)超高壓提取山茱萸中熊果酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并且將之與回流提取法和超聲提取法進(jìn)行比較，探討山茱萸中熊果酸提取的適宜方法。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)于2011年12月于鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品檢測(cè)中心進(jìn)行。山茱萸采于河南省西峽縣，60烘干、粉碎至20目、真空包裝備用；熊果酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；乙醇試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器包括：UHP900×2-Z超高壓處理裝置（包頭科發(fā)公司）、JY88-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（上海新芝生物技術(shù)研究所）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、Agilent 1100 高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司）。

11、1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 超高壓提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，加入不同體積、不同濃度的乙醇溶液，混合均勻后裝入聚乙烯塑料袋中進(jìn)行真空包裝，然后放入超高壓裝置的壓力腔中，高壓處理一定時(shí)間處理后過(guò)濾，3500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測(cè)定熊果酸含量，計(jì)算熊果酸得率。1.2.2 回流提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，按固液比1:20(g:mL)加入75%的乙醇溶液，加熱回流2 h后過(guò)濾，3500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測(cè)定熊果酸含量，計(jì)算熊果酸得率。1.2.3 超聲提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，按固液比1:20(g:mL)加入75%的乙醇溶液

12、，采用220 W超聲處理30 min后過(guò)濾，3500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測(cè)定熊果酸含量，計(jì)算熊果酸得率。1.2.4 熊果酸的HPLC測(cè)定 參照HPLC方法測(cè)定熊果酸（楊劍芳等,2007），色譜柱：Phenomsil BDS C18，4.6 mm×200 mm，5 m ；流動(dòng)相：CH3OH：H2O：HAc 為85150.3；流速：1 mL/min；柱溫：35；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm。峰面積A與熊果酸濃度C（mg/mL）之間的回歸方程為A=381.63C-3.0644（R2=0.9996）。2 結(jié)果與分析2.1 超高壓提取山茱萸中熊果酸單因素試驗(yàn)2.1.1 固液

13、比對(duì)熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑， UHP壓力350 MPa下保壓4 min進(jìn)行提取，不同固液比對(duì)熊果酸提取得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著固液比中溶劑用量的增加，熊果酸的提取得率增加，但當(dāng)固液比達(dá)到1:20（g：mL）后，再增加溶劑用量，熊果酸得率增加緩慢。同時(shí)，過(guò)多的溶劑用量會(huì)帶來(lái)后續(xù)濃縮強(qiáng)度增加的問(wèn)題。因此，綜合考慮，采用固液比1:20較好。 圖1 固液比對(duì)熊果酸得率的影響橫坐標(biāo)直接改為1:5，其他的一樣。Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of ursolic acid 2.1.2 乙醇濃度對(duì)熊果酸提

14、取得率的影響 采用不同濃度的乙醇溶液為溶劑，固液比1:20（g：mL）、UPH壓力350 MPa下保壓4 min進(jìn)行提取，乙醇濃度對(duì)熊果酸提取得率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，熊果酸的提取得率增加，但當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%后，再增加乙醇濃度，熊果酸得率反而下降。這是由于按相似相溶原理，溶劑的極性與熊果酸相當(dāng)，則熊果酸溶解度最大。70%乙醇溶液的極性與熊果酸相當(dāng)，乙醇濃度過(guò)小或過(guò)大，則溶劑的極性與熊果酸不相當(dāng)。 圖2 乙醇濃度對(duì)熊果酸得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of ursolic acid2.1.

15、3 UHP壓力對(duì)熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑，固液比1:20（g：mL），在不同UHP壓力下保壓4 min進(jìn)行熊果酸提取，UHP壓力對(duì)熊果酸提取得率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著UHP壓力的增加，熊果酸的提取得率增加，但當(dāng)UHP壓力達(dá)到300 MPa后，再增加壓力，熊果酸得率反而下降。這是由于超高壓提取的過(guò)程是加壓后造成細(xì)胞破裂，使內(nèi)容物溶出，在300 Mpa時(shí)，細(xì)胞破裂，熊果酸溶出增加；再繼續(xù)增加壓力，細(xì)胞過(guò)度破裂，造成細(xì)胞中其他雜質(zhì)過(guò)多溶出，有效成分的傳質(zhì)速率降低，影響熊果酸游離到細(xì)胞外。因此，UHP壓力為300 MPa時(shí)提取熊果酸較好。 圖3 壓力對(duì)熊果酸得率的影響 F

16、ig.3 Effect of UHP pressure on the yield of ursolic acid2.1.4 保壓時(shí)間對(duì)熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑，固液比1:20（g：mL），在UHP壓力300MPa下保壓不同時(shí)間進(jìn)行熊果酸提取，保壓時(shí)間對(duì)熊果酸提取得率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著保壓時(shí)間的增加，熊果酸提取得率增加，但當(dāng)保壓時(shí)間達(dá)到4 min后，再繼續(xù)增加保壓時(shí)間，熊果酸得率增加緩慢。這是由于超高壓提取過(guò)程就是加壓后造成細(xì)胞破裂，使內(nèi)容物溶出。本研究中，保壓4 min時(shí)細(xì)胞已經(jīng)破裂，熊果酸和周圍溶劑之間達(dá)到傳質(zhì)平衡，再增加保壓時(shí)間，熊果酸得率基本不變。因此，

17、保壓時(shí)間為4 min時(shí)熊果酸提取效果較好。 圖4 保壓時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響 Fig.4 Effect of UHP time on the yield of ursolic acid2.2 熊果酸提取工藝條件的優(yōu)化在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9(34)正交試驗(yàn)表，以熊果酸得率為指標(biāo)，考察固液比、乙醇濃度、UHP壓力、UHP時(shí)間對(duì)熊果酸得率的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。由表2極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)熊果酸得率的影響程度依次為：DCBA，即UHP時(shí)間UHP壓力乙醇濃度固液比。優(yōu)化的提取條件為 A3B3為何不是B1，此外，請(qǐng)補(bǔ)充此工藝條件下熊果酸的得率。C3D2A3B1C3D2,即：U

18、HP時(shí)間4min、UHP壓力320Mpa、乙醇濃度7570%、固液比1:22。在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，熊果酸的得率為0.322%。為何要突然出現(xiàn)此句話？且山茱萸的用量應(yīng)是在試驗(yàn)材料中就應(yīng)說(shuō)明。 表1 因素與水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test因素/水平Factors/levels(A)固液比(g/mL) solid to liquid ratio(B) 乙醇濃度（%）ethanol concentration(C)UHP壓力(MPa) pressure(D)UHP時(shí)間 (min) time11:18652803.521:2070300

19、4.031:22753204.5 表2 正交試驗(yàn)結(jié)果 Tab.2 Result of orthogonal test編號(hào)number(A)固液比(g/mL) solid to liquid ratio(B) 乙醇濃度（%）ethanol concentration(C)UHP壓力(MPa) pressure(D)UHP時(shí)間 (min) time得率(%)yield11:18652803.50.22121:18703004.00.31831:18753204.50.30441:20653004.50.26251:20703203.50.26761:20752804.00.28471:226532

20、04.00.31281:22702804.50.27191:22753003.50.289k10.2810.2650.2590.259k20.2710.2850.2900.305k30.2910.2920.2940.279R0.0200.0270.0350.046對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn)，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，UHP時(shí)間和UHP壓力對(duì)熊果酸得率在所考察的范圍內(nèi)影響顯著,而乙醇濃度和固液比對(duì)熊果酸得率在所考察的范圍內(nèi)影響均不顯著。表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Result of variance analysis因素 factors偏差平方和sum of square自由度f(wàn)ree

21、domF/F0.05 顯著性significanceA0.00120.571不顯著(no)B0.00120.571不顯著(no)C0.00221.143顯著(yes)D0.00321.714顯著(yes)誤差error0.018采用山茱萸2 kg，按上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，熊果酸得率為0.322%。為何要突然出現(xiàn)此句話？且山茱萸的用量應(yīng)是在試驗(yàn)材料中就應(yīng)說(shuō)明。2.3 不同提取方法熊果酸提取得率比較將山茱萸分別采用超高壓、回流和超聲法進(jìn)行提取，比較提取后熊果酸得率和提取所用的時(shí)間可知，3種不同的提取方法中，超高壓法熊果酸提取得率不僅高，且提取時(shí)間短（表4）。 表4 3種方法提取山茱萸中熊果酸的

22、得率和提取時(shí)間 Tab 4. Compare of extraction yield and time of three methods 方法method超高壓提取法ultra high pressure method回流提取法reflux extraction超聲提取法ultrasonic extraction 得率(%)yield0.3220.3150.287時(shí)間(min) time4120303 討論山茱萸是一種資源豐富的藥食兩用植物資源，是開(kāi)發(fā)保健食品的較好原料，對(duì)其活性成分熊果酸的分離提純及藥理學(xué)進(jìn)行深入研究，開(kāi)發(fā)精制、深加工轉(zhuǎn)化產(chǎn)品是其發(fā)展方向。目前，山茱萸熊果酸最常用的提取方法是

23、回流法，該方法對(duì)設(shè)備條件要求不高，操作方法簡(jiǎn)單，但熊果酸提取率不高，且提取時(shí)間長(zhǎng)；通過(guò)采用超聲強(qiáng)化提取可提高其得率，縮短時(shí)間，但超聲容易造成有效成分破壞，且提取時(shí)間仍然需要30 min以上；超微粉碎法通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壞，提高提取熊果酸提取得率，但其對(duì)細(xì)胞的破壞程度有限，得率仍有待提高。本研究采用的超高壓提取法，其是通過(guò)加壓破壞山茱萸細(xì)胞，促進(jìn)熊果酸溶出，在提取過(guò)程中，細(xì)胞在壓力作用下被破壞，但由于為非熱提取，熊果酸破壞小，且提取過(guò)程中細(xì)胞在幾分鐘內(nèi)即被破壞，提取時(shí)間極大縮短，得率得到提高。4 結(jié)論采用超高壓法提取山茱萸中熊果酸的優(yōu)化工藝條件為固液比1:22、乙醇濃度7570%、UHP時(shí)間4 m

24、in、UHP壓力320 MPa，熊果酸得率可達(dá)0.322%，具有提取時(shí)間短、得率高的特點(diǎn)，在提取山茱萸中熊果酸中具有很好的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)：根據(jù)我刊要求，應(yīng)將所有作者羅列出來(lái)，并修改英文。董海麗,劉紅.2012.超高壓提取柿葉中熊果酸工藝條件的優(yōu)化J.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),16: 3567-3569.Dong H L. Liu H.2012. Optimization for utra hgh pessure etraction of usolc aid in dospyros kaki L.f. laves J.Hubei Agricultural Sciences,16: 3567-3569.凌

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26、d from cornus offtcinalis by wet ultrafine grinding technolioyJ.Hubei Agricultural Sciences, 10:2521-2523.蘇秀梅. 2012.吳茱萸與山茱萸的鑒別J.海峽藥學(xué), (03) :44-45Shu X M.2012. Dsting of tetradium ruticarpum and cornus offtcinalis J.Strait Pharmaceutical Journal., (03) :44-45胥佰濤,何國(guó)慶,李心泓, 海寧 沈生榮等.2009.超聲波輔助法提取山茱萸發(fā)酵產(chǎn)物中

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28、Sci.) 35(3):272-277楊劍芳,路福平,高文遠(yuǎn), 黃明勇等.2006.山茱萸的化學(xué)、藥理及開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究進(jìn)展J.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, (12):127-133.Yang J F, Lu F P, Gao W Y,et alHuang M. Y.2006 .Research and development of chemical compositions and pahrmacology of cornus officinalis J.Progresss in Modern Biomedicine, (12):127-133. 楊劍芳,路福平,高文遠(yuǎn), 黃明勇.等.2007.HPLC法

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