第25章 病毒感染的檢查方法

1、第25章 病毒感染的檢查方法與防治原則第一節(jié) 病毒的診斷隨著對病毒感染從生物學及分子生物學水平的研究進展，病毒的診斷技術已由傳統(tǒng)方法擴展至新的快速診斷技術。病毒感染的快速診斷有利于對病毒感染者的治療；例如對有些病毒（如皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒）感染已有較特異的抗病毒藥物治療。早期診斷及早期治療對控制病毒感染十分重要。此外，從群體感染角度分析，確診病毒感染的病原在監(jiān)測病毒的流行病學（如新型流感病毒、肺出血型漢坦病毒的發(fā)現(xiàn)等）方面也有重要的現(xiàn)實意義。 標本的采集與送檢 用于分離病毒或檢測病毒及其核酸的標本應采集病人急性期標本。根據(jù)不同病毒感染采取不同部位的標本（如鼻咽分泌物、腦脊液、糞便或血液）

2、。由于病毒在室溫中很易被滅活，應在采集和運送標本中注意冷藏。如欲檢測抗體，早期單份血清可用于檢測IgM抗體，而欲檢測早期與恢復期的抗體效價的變化，則需采集早期與恢復期雙份血清。血清抗體檢測標本應保存于20。病毒的分離、培養(yǎng)與鑒定 目前最常用的方法是細胞培養(yǎng)。在注明欲檢測的病毒后，病毒分離培養(yǎng)的實驗室將選擇適當?shù)脑囵B(yǎng)細胞（敏感性高）及傳代細胞系（便于在實驗室保存）作病毒分離培養(yǎng)。接種標本后，細胞可出現(xiàn)病變或也可并不出現(xiàn)病變而需用血細胞吸附等方法檢測是否有病毒增殖，并進一步還需用特殊的抗體鑒定病毒的種類，例如用特異熒光抗體染色或抗體中和試驗等。當無病毒增殖時，可能標本中病毒含量較低，未被檢出，

3、則需要盲目傳代3次后方可明確標本中是否存在病毒。這一分離與鑒定病毒的全過程有時可長達23個月，而且僅在有設備、實驗條件及合格工作人員的實驗室方可進行。雖然這種方法所需時間長、步驟多，但在確定病原上是“黃金標準”，即其準確性高而無誤。如我國臺灣省確定由腸道病毒71型引起多數(shù)患兒發(fā)生腦膜炎并致死的研究報道，就是由分離培養(yǎng)及鑒定病毒所確診。如欲提高病毒感染細胞培養(yǎng)的敏感性，可將病毒接種于內(nèi)有蓋玻片的細胞培養(yǎng)瓶，經(jīng)低溫離心后，以增加病毒與細胞接觸的機率。再將蓋玻片進行培養(yǎng)，并用單克隆抗體染色，藉以通過檢測病毒的早期抗原進行診斷。在流感病毒的分離培養(yǎng)中，最敏感而特異的方法是雞胚接種，并用血凝和血凝抑制試

4、驗以鑒定病毒。此外，細胞培養(yǎng)也可應用。分離流感病毒在發(fā)現(xiàn)新變異株中具有重要價值。接種動物分離病毒的方法目前已很少應用，但對狂犬病病毒及乙型腦炎病毒的分離與鑒定中還需應用動物接種，并結(jié)合用特異抗體作中和試驗或作免疫熒光染色以鑒定病毒種類。 檢測病毒抗原及抗體方法 對于一些血清型別不多的病毒或在尋常細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中還不能成功增殖的病毒，直接檢測抗原是快速而實用的方法。這一方法要求標本中有一定量的抗原和具備高質(zhì)量的抗體；其原則為免疫學技術，即用特異標記的抗體檢測相應的抗原?？梢杂妹庖邿晒饣蛎庖呙笜擞浛贵w檢測在病毒感染局部脫落細胞或分泌物細胞中的抗原，也可用酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）或乳膠凝集法檢測抗

5、原。這一方法在數(shù)小時或一天內(nèi)可獲得結(jié)果。用特異的抗原可以檢測病毒感染者血清中的IgM抗體，以快速診斷病原體。應用的病毒抗原或是利用基因工程表達的重組抗原，也可以是用根據(jù)編碼基因片段推導的合成肽作為抗原。一般多用ELISA法檢測。由于IgM抗體出現(xiàn)于病毒感染早期，標本采集的時間對這一方法的檢測結(jié)果影響很大。此外，所用抗原的質(zhì)量與覆蓋抗原表位的幅度也會影響檢測結(jié)果。用特異抗原也可檢測IgG類抗體，但IgG抗體類型用于臨床診斷則必須具有早期與恢復期雙份血清，并且抗體的效價需有4倍或以上的升高或降低方有診斷價值。在有些病毒感染中，如獲得的血清標本已屬感染后期，也可在隨訪中測定抗體效價，如有4倍降低，可

6、作出輔助診斷。IgG抗體的檢測在調(diào)查某一病毒感染在某些地區(qū)人群中的感染率也有價值。此外，還可將病毒蛋白先經(jīng)凝膠電泳，再轉(zhuǎn)移至膜上，用血清標本與之作用后染色的方法（稱Western印跡法、免疫印跡法或蛋白印跡法）檢測血清中針對某種病毒抗原亞單位的抗體。例如這一方法已用于確診病人所產(chǎn)生的HIV抗體等。 檢測病毒核酸的方法 由于多數(shù)病毒基因均已成功地被克隆及進行了核苷酸序列測定，因此可以利用病毒基因作為探針，用核酸雜交的方法檢測標本中有無相應的病毒核酸。作為探針的病毒核酸可以用同位素或非放射性核素標記。用探針雜交后，為檢測核酸雜交體，可用放射自顯影法或用生物素親和素系統(tǒng)進行檢測。這一方法的敏感性一般

7、并不高，但對標本中含有病毒核酸量較多時則很實用。用凝膠電泳將標本中DNA電泳后，轉(zhuǎn)移至膜上（Southen印跡法），再用病毒探針作核酸雜交，可根據(jù)分子量大小分辨標本中病毒核酸存在的狀態(tài)，例如是整合型還是游離型。對于已測定基因核苷酸序列的病毒，可設計相應的病毒基因的引物，作多聚酶鏈反應（PCR）。其原則為先加入標本中提取的核酸（根據(jù)待測病毒為RNA病毒或DNA病毒而加入RNA或DNA），對RNA則需先轉(zhuǎn)錄成互補的DNA，加入耐熱的DNA多聚酶后，在一定溫度及條件下作PCR。通過擴增病毒基因片段可診斷標本中是否存在病毒核酸。本法十分敏感可達fg水平，但需注意操作時污染而出現(xiàn)的假陽性。檢測病毒核酸的

8、缺點為，病毒核酸陽性并不等于標本中存在有感染性的活病毒。此外，對于未知病毒及可能出現(xiàn)的新病毒則因不了解病毒核苷酸序列不能采用這些方法。第二節(jié) 抗病毒治療病毒感染機體引起疾病是病毒與機體相互作用的結(jié)果。因此，抗病毒治療應采取既針對病毒又針對機體的綜合措施，即一方面選用抑制病毒復制的藥物或制劑，另一方面需提高機體的免疫應答，促進消滅病毒感染細胞。 抗病毒藥物或制劑 由于病毒必須進入宿主細胞內(nèi)復制方顯示其生命活性，因此設計抗病毒藥物或制劑的策略基本上可分別從病毒感染細胞的吸附、穿入及脫衣殼、病毒核酸復制及裝配與釋放等不同環(huán)節(jié)設計不同藥物。雖然對HIV、鼻病毒等已明確其靶細胞表面的受體為CD4及粘附分

9、子ICAM1，但用重組表達的可溶性CD4并不能有效地抑制HIV復制；模擬ICAM1的抗病毒制劑尚未用于臨床研究。60年代已發(fā)現(xiàn)金剛烷胺（amantadine）可抑制甲型流感病毒脫衣殼，并已用于臨床研究，發(fā)現(xiàn)有一定的預防作用，但因副作用較大，也未被臨床廣泛采用。對抑制病毒基因復制、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)譯的藥物和制劑是開發(fā)抗病毒藥物的熱點，并已取得較好的效果。 1核苷類藥物 核苷類化合物是最早用于臨床的抗病毒藥物。設計的策略是用合成的異常嘧啶取代病毒DNA前體的胸腺嘧啶，通過使異常嘧啶在病毒DNA分子合成時摻入子代DNA中，阻抑子代病毒結(jié)構(gòu)基因的合成與表達，從而抑制病毒復制或復制出失去感染性的病毒。如目前常用

10、于眼皰疹病毒感染的碘尿苷（IDU，商品名皰疹凈）即為此類藥物。核苷類藥物除可作用于病毒的DNA，同時也可摻入細胞的DNA，阻抑細胞DNA的合成，故具有一定的毒性。為此，進而開展了如何較特異地作用于病毒或病毒感染細胞的新一代的系列藥物。無環(huán)鳥苷（acyclovir，商品名阿昔洛韋）及丙氧鳥苷（ganciclovir, DHPG），就是新一代的核苷類藥物。其作用機制是此類藥物進入感染細胞后，需經(jīng)皰疹病毒特異的胸苷激酶磷酸化成三磷酸型后，方可在病毒DNA復制中發(fā)揮作用。無環(huán)鳥苷三磷酸通過與dGPT 競爭皰疹病毒的DNA酶以阻斷病毒DNA鏈的復制與延長。由于在正常細胞中無環(huán)鳥苷并無作用，僅在有病毒感染

11、細胞方可發(fā)揮抗病毒作用，對病毒復制有高度選擇性，對宿主細胞DNA的合成很少影響，不僅提高了療效還可降低副作用。經(jīng)測定，無環(huán)鳥苷抑制單純皰疹病毒型復制與抑制宿主細胞生長的濃度相差約3000倍。因此除用于局部外，還可注射；可減少皰疹病毒腦炎的死亡率并延長病人生命。DHPG雖對病毒的治療效果比無環(huán)鳥苷增強100倍，但其毒性也較高。因此核苷類藥物治療劑的研制主要關鍵是提高對病毒感染細胞作用的特異性。在對逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV的研究中，進行了對逆轉(zhuǎn)錄過程中核苷類藥物研究。曾先后研制出不同結(jié)構(gòu)的二脫氧胸腺嘧啶核苷類藥物，如2、3二脫氧嘧啶核苷（ddt），2、3二脫氧次黃嘌呤核苷（ggI）等。它們可模擬天然的二脫

12、氧核苷底物，經(jīng)過一系列磷酸化后，作為類似的底物競爭并抑制病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶。三磷酸化的3疊氮2、3二脫氧胸腺嘧啶核苷（AZT）早在1987年已被批準用于HIV感染者。因AZT對病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制比對細胞DNA多聚酶的抑制強100倍，且可能AZT在某些細胞類型，如CD4T細胞中可更有效地被磷酸化，故用于HIV感染者后，能降低艾滋病的發(fā)病與病死率。但是發(fā)現(xiàn)治療后6個月，已開始出現(xiàn)耐藥毒株。最近，另一種核苷類藥物（3TC），在臨床應用中也正成功地抑制HIV的復制，此外3氮唑核苷（ribavarin商品名病毒唑）也是需在細胞酶作用下磷酸化的藥物。單磷酸三氮唑核苷酸與肌苷類似，可使細胞和病毒復制所必須的鳥嘌

13、呤核苷減少，故可抑制多種RNA和DNA病毒復制。主要用于RNA病毒感染的治療，但因其對細胞核酸也有抑制作用，故副作用較多。 2病毒蛋白酶的抑制物 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有些病毒除本身可編碼病毒復制或轉(zhuǎn)錄后剪接、加工酶外，還具有降解大分子病毒蛋白的酶。因此，已根據(jù)病毒蛋白酶的結(jié)構(gòu)進行設計并研制病毒蛋白酶的抑制劑。所用方法均是對基因工程表達病毒蛋白酶的結(jié)晶用X線衍射技術，和用電腦模擬技術，尋找酶的活性位點。在HIV中已設計出針對逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶活性位點的抑制劑，經(jīng)細胞中核實確有抑制病毒蛋白酶的作用后，已開發(fā)出藥品，并已獲準進行臨床試驗。其商品名稱分別為indinavir及ritonavir。華裔美國科學家用3T

14、C加蛋白酶抑制劑聯(lián)合治療HIV，被稱為“雞尾酒”治療方案，可較長期抑制病毒復制，受到普遍重視。 3其他 干擾素或干擾素誘生劑以及細胞因子IL12，TNF和一批中草藥等天然藥物如黃芪、板藍根、大青葉等也具有抑制病毒復制作用。 4、抗病毒基因治療 1978年有學者根據(jù)病毒基因組設計了部分能特異地與其互補的寡核苷酸（又稱反義RNA或asON），在體外發(fā)現(xiàn)可有效地抑制Rous肉瘤中病毒的復制?，F(xiàn)已發(fā)展有反義寡核脫氧核酸（asODN）、反義寡核苷酸（asON）、核酶（ribozyme）等不同類型的各種制劑。發(fā)展這類制劑首先需選擇病毒基因組中的靶基因，然后設計互補的DNA序列片段，一般為1530個聚寡核苷

15、酸。通過asODN與病毒的關鍵基因結(jié)合后，可阻抑病毒DNA的復制與RNA的轉(zhuǎn)錄。對RNA病毒asON是通過與靶基因的mRNA互補結(jié)合后，阻礙病毒mRNA與核糖體結(jié)合而阻抑轉(zhuǎn)譯病毒蛋白。此外，反義RNA與病毒mRNA結(jié)合形成的二聚體，因?qū)怂崦该舾卸杆俦唤到?，還間接阻斷了病毒蛋白質(zhì)的合成。在反義RNA基礎上發(fā)展的核酶是在設計序列時使其具有雙重特性，一方面通過互補序列與靶RNA結(jié)合，另一方面設計核酶的序列具有酶的活性，可通過特異的位點切割和降解靶RNA。這類抗病毒制劑的主要問題是，合成反義RNA或DNA、核酶等所需成本費較高；制劑不穩(wěn)定易被核酸酶降解以及如何使制劑能有效地到達靶細胞內(nèi)的病毒基因。

16、迄今，被批準進入臨床研究的只有針對抗巨細胞病毒的反義核酸，局部用于巨細胞病毒感染的脈絡膜及視網(wǎng)膜炎。 免疫制劑 鑒于病毒的中和抗體可阻斷病毒進入易感細胞，因此抗病毒的特異免疫球蛋白不僅用于預防，也可用于治療。我國已用針對乙腦病毒包膜抗原的單克隆抗體治療乙腦患者，有較好療效。因鼠源單克隆抗體在體內(nèi)存在時間短，并可能在人體誘生超敏反應，現(xiàn)國內(nèi)外均致力于使鼠源單克隆抗體人源化，或發(fā)展重組表達人源抗病毒的單克隆抗體。治療性疫苗在病毒治療中亦被重視，如已在臨床研究中應用了單純皰疹病毒、乙型肝炎病毒及HIV的治療性疫苗。狂犬病疫苗是在感染后潛伏期內(nèi)注射，也可被視為一種治療性疫苗。病毒的核酸疫苗除作為預防疫

17、苗外，亦有可供治療用的潛在價值。第三節(jié) 病毒感染的預防迄今，對病毒感染的治療藥物效果遠不如抗生素等對細菌感染的療效，因此對病毒感染的預防顯得尤為重要。減毒活疫苗因可在體內(nèi)增殖誘生免疫應答，接種量與接種次數(shù)均較滅活疫苗為少。鑒于病毒必須在細胞內(nèi)增殖，培養(yǎng)病毒的條件與要求比細菌更為復雜，成本也更昂貴，因此獲得減毒活疫苗株，用于預防病毒感染是首選的預防疫苗。但由于在許多種病毒中尚未能獲得穩(wěn)定而有強免疫原性的減毒活毒株，因此至今還有一些病毒疫苗采用滅活病毒。用與人類病毒抗原性有交叉免疫原性的動物病毒也可作為減毒活疫苗，如用牛痘苗預防天花是這類疫苗的典范。近來，國外試圖用牛輪狀病毒株，我國白植生等發(fā)展的

18、用羊輪狀病毒株與人輪狀病毒株雜交的減毒活疫苗均已獲準進行現(xiàn)場保護性試驗。無論是減毒活疫苗或滅活疫苗，提純病毒體是重要環(huán)節(jié)。一般，溶細胞型病毒因裂解細胞后被釋放入培養(yǎng)液，純化手續(xù)相對較簡單；以出芽方式或以細胞間橋方式釋放或播散的病毒，需要除去細胞成份，步驟較復雜?；蚬こ桃呙?通過對病毒的分子生物學及分子免疫學的研究，一些病毒保護性抗原表位及其相應的編碼基因已被闡明，從而可將保護性抗原編碼的基因片段克隆入表達載體，用以轉(zhuǎn)染細胞或真核細胞微生物（如酵母菌）及原核細胞微生物，便于大量制備，但也需經(jīng)純化除去細菌或酵母菌成份。雖然在多種病毒中均已開展對重組疫苗的研究，但迄今被廣泛應用的只有乙型肝炎重組疫

19、苗。必須指出，成功的重組疫苗產(chǎn)品必須有堅實的病毒學及免疫性的研究基礎。重組疫苗表達的是病毒蛋白，本質(zhì)相當于滅活疫苗，其優(yōu)缺點也與滅活疫苗相同。 核酸疫苗 包括DNA疫苗和RNA疫苗，是由載體（如質(zhì)粒DNA）和編碼病原體某種抗原的cDNA或mRNA組成。目前研究較多的是DNA疫苗。通過將病毒的核酸疫苗直接注入機體，核酸可進入機體細胞內(nèi)（尚未確定細胞的種類），表達編碼的病毒抗原，與細胞的MHC分子共同遞呈后，在輔助因子的協(xié)同下誘生機體的細胞免疫（包括Th細胞及CTL）和抗體應答。核酸疫苗的優(yōu)點為便于制備、貯存與運輸，可誘生體液和細胞免疫、免疫應答維持時間持久等。但核酸疫苗在小動物中與大動物中誘生免疫應答效果不完全一致，若用于人體，注射的核酸量極大，且需證明其安全性，如不引起自身免疫應答，不發(fā)生病毒核酸基因整合等。由于核酸疫苗可誘生CTL，而CTL被認為是清除病毒的主要機制，因此是一種具有重要發(fā)展前景的疫苗。有些病毒