響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草菌絲體多糖超聲波提取工藝的研究

1、響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草菌絲體多糖超聲波提取工藝的研究                  作者：董媛 朱靖宇 王虎義 左陶 馬東宵 滕利榮【摘要】  目的利用單因素及響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛹蟲草菌絲體多糖超聲提取工藝。方法通過單因素實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)因素與水平，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、超聲功率、提取時(shí)間為響應(yīng)因子，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，并與傳統(tǒng)水提法進(jìn)行比較分析。結(jié)果超聲提取蛹蟲草菌絲體中多糖的最佳工藝條件為：提取時(shí)間504 s

2、，提取功率466 W，液料比1041（mlg），提取率預(yù)測值為7.47%，驗(yàn)證值為7.45%，與預(yù)測值的相對(duì)誤差為0.27%。結(jié)論 經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化蛹蟲草菌絲體多糖超聲波提取工藝后，多糖得率比傳統(tǒng)水提法有所提高，且提取時(shí)間大大減少。 【關(guān)鍵詞】  響應(yīng)面 超聲波提取 蛹蟲草菌絲體多糖蛹蟲草Cordycepsmilitaris(L.exFr.)Link又名北冬蟲夏草、北蟲草，是蛹蟲草寄生在昆蟲綱鱗翅目夜蛾科昆蟲蛹體上所長出的子座與僵死蛹體的復(fù)合體。野生蛹蟲草分布于我國東北、華北、西南地區(qū)的多個(gè)省、市、自治區(qū)1。蛹蟲草能明顯降低大鼠體內(nèi)的過氧化脂質(zhì)和自由基水平，延緩器官和整個(gè)機(jī)體的衰老2。

3、蛹蟲草菌絲體多糖因具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與營養(yǎng)代謝等多種生物活性而備受生物學(xué)家的關(guān)注，有廣闊的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用空間。影響真菌菌絲體多糖提取率的因素很多，如提取功率、提取時(shí)間及液料比等，必須經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探索提取的最佳工藝，而大多數(shù)提取工藝的優(yōu)化采用的為正交實(shí)驗(yàn)方案等3，4，響應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化多糖提取工藝的研究報(bào)道較少5。   響應(yīng)面分析法（Response Surface Methodology，RSM）,將數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)相結(jié)合，采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系6，依此可對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析來尋求最佳工藝參數(shù)。&

4、#160;  本工藝在蛹蟲草菌絲體多糖的提取過程中，以液體深層發(fā)酵獲得蛹蟲草菌絲體為原料，將單因素和響應(yīng)面分析法應(yīng)用于超聲波提取蛹蟲草菌絲體多糖，研究了超聲提取的條件及其對(duì)提取結(jié)果的影響，并與傳統(tǒng)水浸提法進(jìn)行了比較，為其工藝路線的改造，降低生產(chǎn)成本以及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論參考。   1  材料與儀器   蛹蟲草菌種（CGMCC 5.0699），購于中國科學(xué)院微生物研究所； 蒽酮，濃硫酸，3,5-二硝基水楊酸，葡萄糖，所有試劑均為分析純；   HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），

5、 MLS-3750型高壓自動(dòng)滅菌鍋（日本SANYO），超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司），5810R型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf），JY92-超聲波細(xì)胞粉碎儀（廈門精密儀器有限公司），UV-3150紫外分光光度計(jì)（日本島津），BP221S電子天平（德國賽多利斯）。   2  方法   2.1  多糖的測定   多糖含量=總糖含量-還原糖含量   多糖提取率(%)=多糖含量(g)/菌絲體質(zhì)量(g)×l00   2.2  菌絲體多糖的超聲提取方法液體深

6、層發(fā)酵獲得蛹蟲草菌絲體，冷凍干燥至恒重，粉碎，過60目篩。分別稱取0.1 g菌絲體干粉，按一定液料比加入一定量去離子水，水浴中超聲波提取一定時(shí)間。提取液經(jīng)12 000 r/ min，4 ，離心10 min，上清測定總糖和還原糖的含量。   2.3  菌絲體多糖提取單因子實(shí)驗(yàn)在提取過程中，利用單因子實(shí)驗(yàn)對(duì)影響多糖提取率的液料比、超聲功率、提取時(shí)間3個(gè)主要因素進(jìn)行考察。   2.4  菌絲體多糖提取中心組合實(shí)驗(yàn)在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對(duì)菌絲體多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化

7、。按最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)并考察提取次數(shù)對(duì)提取率的影響。   3  結(jié)果   3.1  超聲波提過程中的單因素影響   從結(jié)果可以看出，提取時(shí)間480 s時(shí)多糖得率最大。提取時(shí)間低于480 s時(shí)多糖得率隨著提取時(shí)間的增加而增加，大于480 s時(shí)多糖得率反而有所降低。            從圖2中可以看出，超聲功率為440 W時(shí)菌絲體多糖得率最大。其后隨著超聲功率的增大多糖得率明顯下降。   圖

8、3  液料比對(duì)多糖提取率的影響   從結(jié)果可以看出，液料比低于100:1時(shí)，多糖得率隨著液料比的增加而增加，液料比為100:1時(shí)多糖得率已經(jīng)達(dá)到極值。因此選擇最佳液料比為100:1。   3.2  響應(yīng)面分析法對(duì)蛹蟲草菌絲體多糖提取工藝的優(yōu)化根據(jù)單因素探索的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以液料比、超聲功率、提取時(shí)間3個(gè)因素為自變量，菌絲體多糖提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法在3因素3水平上對(duì)菌絲體多糖提取過程進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最大限度提取的目的。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。表1  響應(yīng)面分析因素與水平對(duì)提取時(shí)間X1、超聲

9、功率X2和液料比X3各水平進(jìn)行如下編碼：X1=（Z1-480）/60，X2=（Z2-440）/80，X3=（Z3-100）/10，以X1，X2，X3為自變量，以多糖提取率Y為響應(yīng)值，分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。   表2中實(shí)驗(yàn)112為析因試驗(yàn)，1315為中心實(shí)驗(yàn)。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn),其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1，X2，X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。采用SAS RSREG 程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果見表3。表2  響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3  回歸分析結(jié)果對(duì)表中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得蛹蟲草菌絲

10、體多糖提取率對(duì)編碼自變量提取時(shí)間、超聲功率、液料比的二次多項(xiàng)回歸方程   Y=7.324 98+0.239 11X1+0.286 67X2+ 0.217 07X3-0.248  52X12-0.187 20X1X2+ 0.066 37X1X3-0.361 01X22+0.079 82X2X3- 0.315 06X32回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)來判定，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表3可以看出，方程中X1，X2，X3，X12，X22，X1X2對(duì)響應(yīng)值的影響最為顯著。在各影響因素中，提取功率對(duì)多糖提取率的影響最大。實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡單的線

11、性關(guān)系，二次項(xiàng)和交互項(xiàng)與響應(yīng)值都有很大的關(guān)系，說明方程的擬合是充分的，回歸方程也是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)R2為96.23 %。同時(shí)失擬項(xiàng)也進(jìn)一步表明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，因此可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。   根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，以確認(rèn)提取時(shí)間、超聲功率、液料比3因素對(duì)多糖提取率的影響，結(jié)果如圖46。   從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等值線中的最小橢圓的中心點(diǎn)。圖4表明X1、X2的交互作用顯著，在所選范圍內(nèi)，X1取不同的編碼值時(shí)X2對(duì)Y的

12、影響表現(xiàn)出不同的規(guī)律；同樣，X2取不同的編碼值時(shí)X1對(duì)Y的影響規(guī)律也呈一定的變化趨勢。從圖5、6可以看出，X1與X3，X2與X3的交互作用并不顯著，它們對(duì)Y值的影響規(guī)律并不會(huì)隨著另一因素的改變而有明顯變化。3個(gè)因素對(duì)Y值的影響以及各因素之間的交互影響與回歸分析結(jié)果吻合。SAS工具箱給出了能夠得到最大響應(yīng)值(Y)的X1，X2，X3對(duì)應(yīng)的編碼值X1=0.411，X2=0.338，X3=0.431，即在提取時(shí)間為504 s，液料比為1041，提取功率為466 W時(shí)提取率有最大值7.47%。   3.3  驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，按最佳提取條件提取，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

13、。3次平行實(shí)驗(yàn)的多糖提取率分別為7.48 %，7.47 %和7.39%，平均提取率為7.45 %，與理論預(yù)測值相比相對(duì)誤差為0.27 %，可見該模型能較好地模擬和預(yù)測蛹蟲草菌絲體多糖提取率。   3.4  提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提取1次后殘?jiān)侔醋罴褩l件提取第2次、第3次，測定各次提取液總糖、還原糖含量。結(jié)果提取1，2，3次的多糖提取率分別為7.46 %，1.49 %，0.51 %。以3次多糖的提取率為100 %計(jì)，第1次多糖的提取率為78.86 %，第2次為15.75 %，第3次為5.39 %。盡管增多提取次數(shù)可以增加多糖的提取率，但從經(jīng)濟(jì)角度看并不

14、合算。因此，選擇兩次提取較合適。   3.5  超聲提取法與水浸提法比較分別采用按響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳超聲提取條件和最優(yōu)水浸提條件提取蛹蟲草深層發(fā)酵菌絲體中多糖(文章已單獨(dú)發(fā)表),比較兩種方法。結(jié)果見表4。表4  超聲提取法和水浸提法比較從表4可知，超聲波提取法與傳統(tǒng)水提法相比,提取時(shí)間縮短96%，多糖得率提高5.62%。   4  結(jié)論   本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響蛹蟲草菌絲體多糖提取的主要因素提取時(shí)間、超聲功率、液料比進(jìn)行了探索，選取中心組合實(shí)驗(yàn)的范圍和水平，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)各因素的最佳水平范圍

15、及其交互作用進(jìn)行了研究和探討，建立了影響多糖提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，依據(jù)回歸分析結(jié)果知，蛹蟲草菌絲體多糖超聲提取的最佳工藝條件為：提取時(shí)間504 s，提取功率466 W，液料比1041（mlg）。在此條件下，實(shí)際提取率7.45%，與模型理論預(yù)測值7.47%的相對(duì)誤差為0.27%。該方法與傳統(tǒng)水提法相比，提取時(shí)間縮短96%，多糖得率提高5.62%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化蛹蟲草菌絲體多糖的超聲波提取工藝條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際價(jià)值?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 段 毅.蛹蟲草高效培養(yǎng)技術(shù)M.鄭州：河南科學(xué)技術(shù)出版社，2004：24.2 王 琦，韓曉龍.蛹蟲草對(duì)老年大鼠自由基代謝影響的研究J.遼寧師范學(xué)報(bào)，2002，4（4）：104.3 熊中良, 鄧春生. 真菌多糖免疫活性的研究進(jìn)展J. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 18 (2) : 118.4 高麗君, 王漢忠, 崔建華, 等. 白首