臨床基因檢測實驗室建設要求

1、臨檢試驗室建設標準與要求一、高通量測序（NGS）試驗室簡介1.1 NGS試驗室又叫高通量測序檢測試驗室。NGS是下一代測序技術(shù)( Next Generation Sequencing)即高通量測序技術(shù)的簡稱。高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)Sanger測序（稱為一代測序技術(shù)）革命性的轉(zhuǎn)變, 可同時對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 也稱為深度測序(Deep sequencing)。1.2 由于NGS技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，簡潔消滅試驗室污染導致檢測結(jié)果精確性下降；另外NGS技術(shù)要求高、影響因素多，試驗過程處理不當易

2、導致檢測結(jié)果精確性下降或檢測失敗。因此臨床基因擴增檢驗試驗室技術(shù)驗收和規(guī)范化管理是NGS技術(shù)本身需要，也是在臨床上順當應用該技術(shù)前提。二、NGS試驗室臨床應用的基本條件2.1 必需擁有符合臨檢中心相關(guān)規(guī)定的標準NGS試驗室。2.2 檢測設備必需符合標準NGS試驗室設置要求：高通量測序儀及配套服務器；高通量測序檢測試劑盒；通用電腦；自動分析軟件，試驗室樣本信息管理系統(tǒng)等。2.3 檢測人員必需通過特地的技能培訓，并獲得省級以上衛(wèi)生計生行政部門頒發(fā)的臨床基因擴增檢驗技術(shù)上崗證書。NGS試驗室必需建立嚴格的試驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保試驗室日常運行符合國家

3、衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果精確、確保試驗室衛(wèi)生平安，確保試驗室長期穩(wěn)定運行。2.4 NGS臨床應用必需在無菌無塵環(huán)境下進行操作。三、NGS試驗室建設基本要求3.1 主體結(jié)構(gòu)主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)全部陰角、陽角均接受鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決簡潔污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)堅固，線條簡明，美觀大方，密封性好。3.2 標準的各區(qū)分隔和氣壓調(diào)整將檢測過程分成試劑預備、樣本制備、PCR擴增和高通量測序四個獨立的試驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立試驗區(qū)設置有緩沖區(qū)， 同時各區(qū)通過氣壓調(diào)整，使整個檢測試驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染?？纱蜷_緩沖區(qū)

4、和 PCR 擴增區(qū)的排風扇往外排氣，在試驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調(diào)的回風口，空氣通過回風口向室內(nèi)換氣。3.3 消毒在每個試驗區(qū)和緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。在各區(qū)還設置移動紫外線燈，對試驗桌進行局部消毒。3.4 機械連鎖不銹鋼傳遞窗試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。3.5 地面地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可接受水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm800mm）接縫需要小于2mm。3.6 照明燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、

5、不積塵的特點。3.7 平面布局NGS試驗室應依據(jù)自己的檢驗項目、所接受的檢測技術(shù)平臺和工作量來打算分區(qū)的多少及各區(qū)域的空間大小，至少具體需要多少個區(qū)，同樣是“個體化”的，以“工作有序、互不干擾、防止污染、報告準時”作為基本原則。四、各項目試驗室建設標準n 產(chǎn)前篩查與產(chǎn)前診斷（全基因組低拷貝測序技術(shù)）1. 試驗室平面圖圖1：產(chǎn)前篩查與診斷試驗室平面圖2. 技術(shù)流程圖圖2：產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)流程圖3. 技術(shù)參數(shù)分區(qū)壓力溫度相對濕度照明專用走廊0Pa20-2540%60%主試驗室300LX，其余房間200300LX緩沖區(qū)+5Pa試劑預備室+15Pa標本與文庫制備區(qū)+10Pa文庫擴增與檢測區(qū)-5Pa測

6、序區(qū)-10Pa4. 分區(qū)功能4.1 試劑預備室主要功能：在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。4.2 標本與文庫制備區(qū)主要功能：血液處理、血漿制備、DNA提取、DNA片段化、DNA樣品的純化、DNA濃度檢測、末端修復、接頭連接、構(gòu)建樣本的測序文庫。4.3 文庫擴增與檢測區(qū)主要功能：文庫構(gòu)建后的PCR擴增與純化、文庫濃度檢測、文庫的混合及混合后的質(zhì)檢分析。4.4 測序區(qū)主要功能：測序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機測序、數(shù)據(jù)分析、報告審核及發(fā)放。5. 儀器配置5.1 試劑預備室主要儀器設備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。

7、5.2 標本與文庫制備區(qū)主要儀器設備：冷凍離心機、微量臺式離心機、掌上三管離心機、渦旋震蕩器、垂直混合儀、移液器、可移動紫外燈、生物平安柜、冰箱、托盤天平、Qubit 2.0核酸定量儀、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)）、條形碼打印機、一般打印機、掃描槍、磁力架等。5.3 文庫擴增與檢測區(qū)主要儀器設備：PCR儀、QPCR儀、Qubit2.0核酸定量儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、UPS、冰箱、移液器、磁力架等。5.4 測序區(qū)主要儀器設備：高通量測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PC

8、R儀等。n 胚胎植入前遺傳學診斷（全基因組低拷貝測序）1. 試驗室平面圖圖3：PGD試驗室平面圖2. 技術(shù)流程圖圖4：PGD技術(shù)流程圖3. 技術(shù)參數(shù)分區(qū)壓力溫度相對濕度照明專用走廊0Pa20-2540%60%主試驗室300LX，其余房間200300LX緩沖區(qū)+5Pa試劑預備室+15PaWGA制備室+10pa擴增一區(qū)-5pa標本檢測區(qū)-10Pa測序區(qū)-15Pa電泳區(qū)0Pa4. 分區(qū)功能4.1 試劑預備室主要功能：在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。4.2 WGA制備區(qū)主要功能：基因組DNA釋放、全基因組DNA擴增。4.3 電泳區(qū)主要功能： DNA電泳檢測及結(jié)果反饋、DNA打斷等4.4

9、擴增一區(qū)主要功能：DNA片段的末端修復與純化、接頭連接與純化、文庫混合、缺口平移。4.5 文庫檢測區(qū)主要功能：文庫濃度質(zhì)檢分析。4.6 測序區(qū)主要功能：測序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機測序、數(shù)據(jù)分析、報告審核及發(fā)放。5. 儀器配置5.1 試劑預備區(qū)主要儀器設備：冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。5.2 電泳區(qū)主要儀器設備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。5.3 WGA制備區(qū)主要儀器設備：PCR儀、超凈工作臺、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。5.4 擴增一區(qū)主要儀器

10、設備：PCR儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、UPS、移液器、磁力架等。5.5 文庫檢測區(qū)主要儀器設備： QPCR儀、Qubit2.0核酸定量儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、冰箱、移液器等。5.6 測序區(qū)主要儀器設備：高通量測序儀、PC電腦、打印機、UPS、恒溫金屬浴、純水儀、冰箱、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、超凈工作臺、可移動紫外燈、磁力架、PCR儀等。n 遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測序技術(shù)+Sanger測序驗證）1. 試驗室平面圖圖5：腫瘤診斷試驗室平面圖2. 技術(shù)流程圖圖6：腫瘤診斷技術(shù)流程圖圖7：一代測序試

11、驗流程圖3. 技術(shù)參數(shù)分區(qū)壓力溫度相對濕度照明潔凈走廊0Pa20-2540%60%主試驗室300LX，其余房間200300LX緩沖區(qū)+5Pa試劑預備室+15Pa標本與文庫制備區(qū)+10PaDNA打斷區(qū)+10Pa雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）-5Pa文庫擴增區(qū)（擴增二區(qū)）-10Pa文庫檢測區(qū)-10Pa測序區(qū)-15Pa電泳區(qū)0 Pa4. 分區(qū)功能4.1 試劑預備區(qū)主要功能：在NGS過程中使用到的試劑的配制、分裝和保存。4.2 標本與文庫制備區(qū)主要功能：樣本接收、樣本前處理、全基因組DNA提取以及各種樣本DNA或者RNA的提取、DNA片段化、DNA純化、DNA濃度測定、DNA片段的末端修復與純化、接頭連接與純

12、化。4.3 DNA打斷區(qū)主要功能： DNA打斷（片段化）。4.4 電泳區(qū)主要功能： 片段化DNA電泳檢測及結(jié)果反饋。4.5 雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）主要功能：目的DNA片段的雜交捕獲與純化，Sanger測序目的片段擴增與純化、Sanger測序PCR前預備。4.6 文庫擴增區(qū)（擴增二區(qū)）主要功能：雜交捕獲后擴增與純化、文庫濃度質(zhì)檢分析、及Sanger測序的PCR擴增反應與純化。4.7 測序區(qū)主要功能：測序模板制備（乳液PCR與磁珠富集回收）、上機測序、及Sanger測序。5. 儀器配置5.1 試劑預備區(qū)主要儀器設備：加樣器、冰箱、分析天平、微量臺式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈和超凈工作臺等。5.2 標本與文庫制備區(qū)主要儀器設備：微量臺式離心機、掌上三管離心機、恒溫金屬浴、移液器、可移動紫外燈、生物平安柜、冰箱、托盤天平、Qubit 2.0核酸定量儀、PCR儀、電腦（可連接互聯(lián)網(wǎng)）、條形碼打印機、一般打印機、掃描槍等。5.3 DNA打斷區(qū)主要儀器設備：Covaris S220超聲波打斷儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。5.4 電泳區(qū)主要儀器設備：電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冰箱、掌式離心機、渦旋振蕩器、移液器、可移動紫外燈等。5.5 雜交捕獲區(qū)（擴增一區(qū)）主要儀器設備：PCR儀、可移動紫外燈、超凈工作臺、冰箱、微量臺式