Western-blot-試劑配制及操作流程教學文案

1、1 Western-Blot操作流程試劑配制蛋白提取試劑.RIPA裂解液：50mMTris(MW121.14,PH7.5)3.02g150mMNaCl4.38g1%TritonX-1005ml1%脫氧膽酸鈉5g0.1%SDS0.5g蒸儲水至500ml。調pH值至7.5?；靹蚝?c保存，長期保存于-20Co使用時，加入蛋白酶抑制劑cooktail。.蛋白酶抑制劑cooktail所需母液成分：(1)100mmol/LPMSFPMSF異丙醇溶解后，分裝于17.4mg1ml1.5ml離心管中10mM亮肽素leupeptin:2.1mg/ml抑肽素Aprotinin:配制：成分PMSFLeupeptin

2、Aprotinin-20C保存。-20C保存4c保存終濃度1mmol/L（儲存濃度稀釋0.1mmol/L（儲存濃度稀釋1ug/ml（儲存濃度稀釋每ml裂解液所加母液量100倍）10ul100倍）10ul2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。蛋白定量試劑.G250考馬斯亮藍溶液（蛋白定量專用）考馬斯亮藍G250100mg95%乙醇50ml85%磷酸100ml蒸儲水至1000ml配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4c保存于棕色瓶中。1 .牛血清白蛋白BSA儲存?夜11mg/ml）：100mgBSA

3、粉末溶于20ml雙蒸水，定容至100ml,加少量防腐劑，4c保存。1. 上樣用試劑.4X上樣緩沖液1.0mol/LTris-HCl(pH6.8)2mlSDS0.8g澳酚藍0.04g甘油4ml去離子水定容至10ml?；靹蚝螅盅b于1.5ml離心管中，4c保存。使用時稀釋成1X。1.0mol/L二硫蘇糖醇（DTT）（10X）用20ml0.01mol/L乙酸鈉溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT分裝成1ml小份儲存于-20?C。使用時稀釋成1X。例如：上樣量20“-4X上樣緩沖液5“+DTT2“+樣本蛋白13“工作液制膠用（1-6）:1.1.0mol/LTris-HClTris(MW121.14)

4、蒸儲水溶解后，(用濃鹽酸調(pH6.8)12.114g100mlpH至6.8),室溫下保存。2. 1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）Tris（MW121.14）18.171g蒸儲水100ml溶解后，（用濃鹽酸調pH至8.8）,室溫下保存。3. 10%SDSSDS10g蒸儲水至100ml如溶解困難，可在50c水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。4. 10%過硫酸胺（AP）5. 過硫酸胺0.1g蒸儲水1ml（現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多裝幾管，使用時加入蒸儲水水即可，溶解后，4c保存，保存時間為1周）四甲基乙二胺

5、原液（TEMED）：4?C保存。6. 30%丙稀酰胺：4?C保存。10%下層膠(兩塊膠，15ml)：依次加入去離子水5.9ml30%丙烯酰胺5ml1.5MTris-HCl(pH8.8)3.8ml10%SDS150“10%AP150“TEMED6“每加一種成分隨即搖勻，為了加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，根據(jù)實驗當時的溫度適當調整，加入TEMED混勻后應即刻灌膠。灌膠后加正丁醇（1ml）消泡5%上層膠(兩塊膠，6ml):依次加入去離子水4.1ml30%丙烯酰胺1ml1MTris-HCl(pH6.8)0.75ml10%SDS60“10%AP60“TEMED6“每加一種成分隨即搖勻，為了

6、加快凝膠，可以將過硫酸胺和TEMED量加大，根據(jù)實驗當時的溫度適當調整，加入TEMED混勻后應即刻灌膠。7.5X電泳液緩沖液Tris（MW121.14）甘氨酸（MW75.07）SDS蒸儲水至1000ml溶解后室溫保存，用時稀釋8.10X轉膜緩沖液甘氨酸（MW75.07）Tris（MW121.14）蒸儲水至1000ml溶解后室溫保存，用時稀釋15.1g94g5.00g5倍，通常取160ml配制成800ml即可。151.1g30.3g10倍，并加入甲醇至20%。9. 通常取80ml母液，力口560ml蒸儲水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易產(chǎn)生沉淀）10XTBS緩沖液Tris

7、（MW121.14）24.2gNaCl80.0g蒸儲水至1000ml（濃鹽酸調pH至7.6）,溶解后室溫保存。10. 1XTBS校沖液10XTBS緩沖液100ml蒸儲水900mlTween-201ml因Tween-20比較粘稠，應緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫保存。11. .封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶）：1XTBS校沖液95-100ml脫脂奶粉5g溶解后4c保存，可于一周內使用。其他商品性試劑一抗、二抗、顯影液、定影液、ECL化學發(fā)光試劑操作步驟（一）蛋白樣品制備（1）單層貼壁細胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液，（暫不作可將培

8、養(yǎng)皿存于-80度）。2、向培養(yǎng)皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，搖床20min3、用勺子刮下細胞，并吸出液體至1.5ml離心管中，勺子在處理不同樣本前清水洗凈、擦干（注意冰上操作）4、超聲處理（可選）注意蛋白懸液放于冰上，15sec處理，dutycycle50-60每次處理后清水洗探頭、擦干，再作下一個5、于4c下12000rpm離心5min。6、將離心后的上清分裝轉移倒1.5min的離心管中放于-80C保存。（2）組織中總蛋白的提取：1 .將200mg組織塊剪碎，置于1ml裂解液中（5ml離心管）。2 .勻漿器進行勻漿，注意冰上操作，勻漿

9、后置于冰上。3 .10,000g,4C,10min,（5ml管）.取上清至1.5ml管，12,000g,4C,60min,.取上清至新1.5ml管,-80C儲存（二）蛋白含量的測定1、從-20C取出1mg/mlBSA,室溫融化后，備用。2、取7個5ml離心管，分別加入1mg/mlBSA:0、10、20、40、60、80、100ul,用蒸儲水補足各管至100uL3、樣本取5ul,加蒸儲水95ul,使總量亦為100ul,混勻。4、各管加G-250溶液2ml混勻，室溫靜止2分鐘。5、混勻后，在生物分光光度計上比色分析，測定595nm的光吸收，測定時濃度由低到高。6、于Excel根據(jù)標準品繪制標準曲線

10、，根據(jù)得出的公式計算樣本濃度。（三）SDS-PAGE電泳（1）清洗玻璃板：一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸儲水沖洗干凈后立在筐里晾干。（2）灌膠與上樣1、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（可以用1%瓊脂糖在垂直電泳槽的左、右和下部封邊）2、按前面方法配10%下層膠（15ml,兩塊膠，每塊膠在6.5ml左右），加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠后膠上加一層正丁醇（1ml左右），液封后的膠凝的更快。3、當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。棄去正丁醇，用水沖洗，并用吸水紙將水吸干。4、等待膠凝期間可計算含50-100ug蛋

11、白的溶液體積即為上樣量（根據(jù)自己的實驗需要進行選擇，沒有固定的量），目的蛋白GluT3一般在20-30“左右。取出上樣樣品至200“的EP管中，加入4X上樣緩沖液及DTT至終濃度均為1X（上樣總體積一般不超過30）。上樣前要將樣品于沸水中煮5-10min使蛋白變性（亦可以使用PCR儀進行變性，加快速度，這樣就不用將水煮沸了）。5、按前面方法配5%的上層膠（6ml,兩塊膠），加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中（從梳子的一頭開始插）。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減?。ㄒ蔡崾灸z已經(jīng)凝固），從而

12、使加樣孔的上樣體積減小，所以在上層膠凝固的過程中要在兩邊補膠（不補膠問題也不大）。等待上層膠凝固期間配制1X電泳緩沖液。6、加入1X電泳緩沖液，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。*電泳緩沖液一定要加至超過玻璃板的上緣（量要足夠多），否則電泳期間會出現(xiàn)電流過低的現(xiàn)象，進而影響電泳的效果。7、上樣（注意：最外兩泳道易跑歪，盡量不用。）Marker6科l（Marker加在最邊上的加樣孔中）樣本20-30科l實驗所用Marker電泳后出現(xiàn)10條帶：10,15,25,35,40,55,70,100,130,170KDa（3）電泳：電壓100V,電流300mA，功率50W,時間1.5hour。（

13、電泳15分鐘后可調節(jié)電壓到130V）電泳至澳酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜（一般要讓目的條帶跑過分離膠的1/3比較好）。電泳結束前20分鐘配制1X轉膜緩沖液。（四）轉膜（1）轉一張膜需準備4張濾紙和1張硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套（因為手上的蛋白會污染膜）。將切好的硝酸纖維素膜和濾紙置于1X轉模緩沖液浸濕。（2）夾子黑的一面：海綿-2張濾紙-膠-NC膜-2張濾紙-海綿將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以搟走里面的氣泡。在墊子上墊二層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）先將玻璃板撬開，隨后將濃縮膠輕輕

14、刮去，小心剝下下層膠蓋于濾紙上，用手調整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將硝酸纖維素膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠并除氣泡。在膜上蓋2張濾紙并除去氣泡（膜蓋下后不可再移動）。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。如果同時做兩塊膠，轉膜的時候應記住樣本的位置。（3）將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用100V轉移1.5h。* 實際上應該根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉膜時間，對于小分子量的蛋白，轉膜時最好墊兩塊硝纖膜，以免轉膜過頭，因為如

15、果第一張膜上蛋白質已經(jīng)轉過了，第二張膜上還有蛋白質可以進行檢測；對于大分子量的蛋白，轉膜時電壓要高一點，一般80-100V,時間也要延長一點，開始最好也用兩塊膜，特別是務必注意加強降溫措施。當然轉膜是要摸條件的，最好剛開始做的時候摸個轉膜的時間梯度。如果由于時間原因來不及做下面實驗，可以在4度下12V轉膜過夜；硝纖膜建議使用0.22科的小孔徑膜，不容易轉膜過頭；不同的轉膜裝置，轉移效率是不一樣的，所以換用轉膜裝置，最好再摸個條件；轉膜時電極方向注意是膜正膠負。如果同時做兩塊膠，轉膜結束應在膜上做標記，以便查詢相應樣本。轉膜結束前配制封閉液（5%脫脂牛奶）及1XTBS嗡沖液。（五）免疫反應（1）

16、封閉：將膜用移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉2ho一抗a.用parafilm膜制作與膜大小相同的槽；b.從封閉液中取出膜，1XTBST5minX歆;c.將一抗用封閉液稀釋至適當濃度（目的蛋白GluT31:300,actin1:2000）;d.將膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗體，室溫下孵育1-2h后（目的蛋白GluT31.5h,actin1h）,4度過夜，次日用1XTBSTft室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。（3）二抗同上方法準備二抗稀釋液（目的蛋白GluT31:1000,actin1:1000）并與膜接觸，室溫下孵育1h后，用1XTBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。（六）化學發(fā)光，顯影，定影（1）將A和B兩種試劑等量（常用各500“）在5ml離心管中等體積混合；打開X-光片夾，鋪上保鮮膜，將NC膜面朝上放于保鮮膜上，滴加此混合液1-3min后（見到熒光），用保鮮膜包好。將1X顯影液，自來水和定影液分別到入盤中；在紅燈下取出X光片，用切紙刀剪裁適當大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）;把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關上X-光片夾，開始計時