用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)酶活力的影響實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)酶活力的影響一、前言正交實(shí)驗(yàn)法正交實(shí)驗(yàn)法就是利用排列整齊的表-正交表來(lái)對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)、綜合比較、統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)通過(guò)少數(shù)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，以達(dá)到最高生產(chǎn)工藝效果。正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，使每次試驗(yàn)都具有較強(qiáng)的代表性，由于正交表具備均衡分散的特點(diǎn)，保證了全面實(shí)驗(yàn)的某些要求，這些試驗(yàn)往往能夠較好或更好的達(dá)到實(shí)驗(yàn)的目的。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括兩部分內(nèi)容:第一，是怎樣安排實(shí)驗(yàn);第二，是怎樣分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。酶活力酶活力（enzyme activity）也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來(lái)表示，酶催化反

2、應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測(cè)定酶活力實(shí)際就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來(lái)表示。在一般的酶促反應(yīng)體系中，底物往往是過(guò)量的，測(cè)定初速度時(shí)，底物減少量占總量的極少部分，不易準(zhǔn)確檢測(cè)，而產(chǎn)物則是從無(wú)到有，只要測(cè)定方法靈敏，就可準(zhǔn)確測(cè)定。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)并掌握正交法應(yīng)用原理。2.采用正交法測(cè)定多種因素對(duì)酶活力的影響。三、實(shí)驗(yàn)原理酶促反應(yīng)常常同時(shí)受到多種因素(包括激活劑和抑制劑等)的交互影響，可采用正交法進(jìn)行綜合研究，即通過(guò)少量試驗(yàn)收到更好的效果：多快好省。本實(shí)驗(yàn)以正交法同時(shí)測(cè)定S、E、溫度和pH值對(duì)trypsin活性的影響，以求得

3、酶活最大時(shí)相應(yīng)影響因素的最佳值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。四、實(shí)驗(yàn)器材和試劑實(shí)驗(yàn)器材：試管漏斗溫度計(jì)吸管恒溫水浴鍋分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)試劑：2%血紅蛋白液(Hb)15%三氯醋酸液(TCA)trypsin酶液0.04mol/L巴比妥緩沖液(pH 7, 8, 9)考馬斯亮藍(lán)染液 五、實(shí)驗(yàn)操作1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)為四因素三水平(總試驗(yàn)次數(shù)34=81)，可選用L9正交表（僅需9次試驗(yàn))，展開(kāi)后其特性為均衡搭配（1）每列中水平數(shù)1、2、3出現(xiàn)次數(shù)相同，均為3次；（2）每?jī)闪械臋M行數(shù)對(duì)(1-1/1-2/3-2/3-3)各出現(xiàn)一次。列號(hào)試驗(yàn)號(hào)12341111121222313334212352231623

4、127313283213933212.將各因素及其相應(yīng)水平參數(shù)依次填入得到實(shí)驗(yàn)安排表 試驗(yàn)號(hào)試劑/ml1682493572%血紅蛋白液0.20.50.80.20.50.80.20.50.8緩沖溶液pH72.6pH81.7pH91.7pH82.3pH92.3pH72.0pH92.0pH72.0pH82.037預(yù)溫5min50預(yù)溫5min60預(yù)溫5min酶液0.20.80.50.50.20.80.80.50.237反應(yīng)10min50反應(yīng)10min60反應(yīng)10min（1）各試管編號(hào)，分別加入對(duì)應(yīng)容量的底物(2% Hb)和相應(yīng)pH值的緩沖液，混勻；（2）同溫處理的3支試管同時(shí)預(yù)溫5min；（3）各試管

5、依序分別加入對(duì)應(yīng)容量的trypsin酶液(統(tǒng)一加樣時(shí)間間隔)，混勻；（4）同溫處理的3支試管置對(duì)應(yīng)恒溫水浴中反應(yīng)10min；（5）各試管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混勻以終止反應(yīng)；（6）非酶促對(duì)照：另取一試管，先加入2%血紅蛋白液0.5ml及pH8緩沖液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混勻靜置10min后再加入酶液0.5ml；（7）上述各管反應(yīng)液室溫靜置15min后過(guò)濾，取濾液待測(cè)酶活；（8）酶活測(cè)定(考馬斯亮藍(lán)法，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備略)：取試管若干支編號(hào)，分別加入對(duì)應(yīng)的樣品濾液1.0ml及考馬斯亮藍(lán)液4.0ml，混勻，室溫靜置3min，以非酶促對(duì)照管為空白，于波長(zhǎng)595nm比色測(cè)定

6、。3.數(shù)據(jù)記錄及分析將各管測(cè)定所得光密度值對(duì)應(yīng)填入表格，分別算出各因素一、二及三水平的試驗(yàn)結(jié)果總和、和，并分別取其平均值計(jì)算相應(yīng)的極差(各列中最大與最小值之差)；比較各因素極差的大小以評(píng)估各因素對(duì)酶活的影響，并對(duì)酶活最高時(shí)的各因素水平作一直觀分析。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)處理1.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)： pH值溫度pH7pH8pH9測(cè)量值平均值測(cè)量值平均值測(cè)量值平均值370.0030.00230.0680.06670.1850.18400.0020.0660.1850.0020.0660.182500.0590.05600.0960.09670.0790.08100.0580.0970.0820.0510.097

7、0.082600.1400.14170.1630.16100.0650.06600.1410.1590.0640.1440.1610.0692.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析：列號(hào)試驗(yàn)號(hào)1S/ml2E/ml3溫度/（）4pH試驗(yàn)結(jié)果A680nm1234567891 0.21 0.21 0.22 0.52 0.52 0.53 0.83 0.83 0.81 0.22 0.53 0.81 0.22 0.53 0.81 0.22 0.53 0.81 372 503 602 503 601 373 601 372 501 72 83 93 91 72 82 83 91 70.00230.05600.14170.096

8、70.16100.06670.06600.18400.0810（一水平試驗(yàn)結(jié)果總和）（二水平試驗(yàn)結(jié)果總和）（三水平試驗(yàn)結(jié)果總和）0.20000.92470.33100.16500.40100.28940.25300.23370.36870.24430.18870.4224/3/3/30.06670.30820.11030.05500.13370.09650.08430.07790.12290.08140.06290.1408極差0.24150.07870.04500.0779由上述表格各因素極差大小可看出，底物濃度對(duì)于酶活力影響最大，其次是酶濃度，再次是pH，最后是溫度。根據(jù)上表數(shù)據(jù)，以吸光度

9、值（/3、/3、/3）為縱坐標(biāo)，因素的水平數(shù)為橫坐標(biāo)作圖圖一 底物濃度對(duì)酶活力的影響從圖一可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增大，酶活力是逐漸降低的，約在底物濃度為0.5mol/ml時(shí)酶活力達(dá)到最低。圖二 酶濃度對(duì)酶活力的影響從圖二可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著酶濃度升高，酶活力是逐漸降低的，約在酶濃度為0.55mol/ml時(shí)酶活力達(dá)到最低。圖三 溫度對(duì)酶活力的影響從圖三可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，反應(yīng)速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在溫度為50時(shí)酶活力達(dá)到最高。圖四 pH對(duì)酶活力的影響從圖四可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著pH升高，反應(yīng)速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在pH為8時(shí)酶活力達(dá)到最高。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.每加入一種試劑都需要充分混勻。2.應(yīng)確保酶促反應(yīng)的溫度及反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性。八、思考題1.正交法有何優(yōu)點(diǎn)？答：通過(guò)少數(shù)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，使每次試驗(yàn)都具有較強(qiáng)的代表性，保證了全面實(shí)驗(yàn)的某些要求，這些試驗(yàn)往往能夠較好或更好的達(dá)到實(shí)驗(yàn)的