Western Blot 原理和操作方法(詳細(xì))

1、Western Blot 原理和操作方法(詳細(xì)工作原理蛋白質(zhì)的電泳分離是重要的生物化學(xué)分離純化技術(shù)之一,電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下,向著與其電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象.根據(jù)所采用的支持物不同,有瓊脂糖凝膠電泳,淀粉凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠電泳等.其中,聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE由于無(wú)電滲作用,樣品用量少(1-100g,分辨率高,可檢出10-9-10-12mol的樣品,凝膠機(jī)械強(qiáng)度大,重復(fù)性好以及可以通過(guò)調(diào)節(jié)單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例而得到孔徑不同的凝膠等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的應(yīng)用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量.PAGE能有效的分

2、離蛋白質(zhì),主要依據(jù)其分子量和電荷的差異,而SDS-PAGE(SDS變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異,因?yàn)镾DS-PAGE的樣品處理液是在要跑電泳的樣品中假如含有SDS和巰基乙醇(2-ME或二巰基赤蘚醇(DTT,其可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵,破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu),SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵,破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu),并與蛋白質(zhì)的疏水部分相結(jié)合,破壞其折疊結(jié)構(gòu),電泳樣品假如樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘使SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑巰基乙醇存在時(shí),蛋白質(zhì)分

3、子內(nèi)的二硫鍵被打開而不被氧化,蛋白質(zhì)也完全變性和解聚,并形成榛狀結(jié)構(gòu),穩(wěn)定的存在于均一的溶液中,SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上帶有大量的負(fù)電荷,平均每?jī)蓚€(gè)氨基酸殘基結(jié)合一個(gè)SDS分子,這時(shí)各種蛋白質(zhì)分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其原來(lái)所帶的電荷,從而使蛋白質(zhì)原來(lái)所帶的電荷可以忽略不計(jì),消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質(zhì)量的大小,這樣分離出的譜帶也為蛋白質(zhì)的亞基.樣品處理液中通常加入溴酚藍(lán)染料, 溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子,可以自由通過(guò)凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置,當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),即可停止電泳.另外樣品處理液中也可加入適量

4、的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部.重要參數(shù)聚丙烯酰胺凝膠(PAG制備原則:由于孔徑的大小取決于單體和雙體丙烯酰胺在凝膠中的總濃度(T以及雙體占總濃度的百分含量即交聯(lián)度(C決定的,因而制膠之前必須首先知道這兩個(gè)參數(shù).一般可以由下述公式計(jì)算:T%=(a+b/m*100%; 和 C%=a/(a+b*100%其中: a=雙體(bis的重量 ;b=單體(arc的重量 ;m=溶液的體積(ml當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí),常常先用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠制成4-10的梯度凝膠進(jìn)行試驗(yàn),以便選擇理想的膠濃度.如果蛋白質(zhì)的分子量已知,可參考下表選擇所需凝膠濃度:蛋白質(zhì)分子量范圍(Da 適宜的

5、凝膠濃度(%<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×105 10-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5分離膠:電泳凝膠濃度試劑 10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml 4.0 3.3 2.3 5.9 4.9 3.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml 3.3 4.0 5.0 5.0 6.0 7.51.5mol/lTris.cl(PH8.8 (ml2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.810%SDS(ml 0.1 0.1 0.1 0

6、.15 0.15 0.1510%AP(ml 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(l 4 4 4 6 6 6總體積(ml 10 15濃縮膠試劑濃度(5%H2O(ml 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8 (ml 1 0.510%SDS(l 80 4010%AP(l 60 30TEMED(l 8 4總體積(ml 6 3蛋白質(zhì)的樣品制備:蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步,樣品制備是關(guān)鍵步驟,要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì),應(yīng)注意以下問(wèn)題:1:在合適的鹽濃度下,應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解

7、性和可重復(fù)性。2:選擇合適的表面活性劑和還原劑,破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵,使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。3:盡量去除核酸,多糖,脂類等干擾分子。4:防止蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的人為的修飾,制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行,以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑5:樣品建議分裝成合適的量,然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存,但要注意不要反復(fù)凍融。一:準(zhǔn)備工作:一個(gè)水浴箱,一臺(tái)超聲裝置,組織勻漿器二:需要的溶液:裂解液 Laemmli樣品緩沖液三:操作步驟:1培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備:1:胰酶酶解后裂解:細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí),以含0.05%胰蛋白酶

8、消化,細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次,離心收集在離心管中,加入450l裂解液反復(fù)吹打。2:皿上直接裂解:細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí),細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次,加入450l裂解液,細(xì)胞刮刀收集,用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中,反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理,超聲時(shí)為5S,間歇時(shí)間為10S,功率為100-120W至溶液清澈無(wú)粘稠為止,處理過(guò)程在水浴中進(jìn)行,后425000g離心1小時(shí)取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次,每次15-30S,在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S,加入Laemmli 樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合,強(qiáng)力混勻,樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5

9、分鐘,10000g離心10分鐘,取出清液,將其移入另一潔凈試管中,至此,電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。(樣品可立即使用也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月2組織樣品的制備:手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中,漂洗數(shù)次,以清潔表面的血跡,將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中,按組織凈重,裂解液=1:10的比例,加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿,離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理,具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備,也可以冷凍干燥降解核酸后,將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘觔uffer中,混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解,有5分鐘即可,4度離心收集。加入Laemml

10、i樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合強(qiáng)力混勻,樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘,10000g離心10分鐘,取上清液,將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中,至此,電泳樣品已準(zhǔn)備就緒(樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。蛋白質(zhì)的樣品制備:蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的第一步,樣品制備是關(guān)鍵步驟,要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì),應(yīng)注意以下問(wèn)題:1:在合適的鹽濃度下,應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。2:選擇合適的表面活性劑和還原劑,破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵,使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。3:盡量去除核酸,多糖,脂

11、類等干擾分子。4:防止蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的人為的修飾,制備過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行,以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾(建議加入合適的蛋白酶抑制劑5:樣品建議分裝成合適的量,然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80中保存,但要注意不要反復(fù)凍融。一:準(zhǔn)備工作:一個(gè)水浴箱,一臺(tái)超聲裝置,組織勻漿器二:需要的溶液:裂解液 Laemmli樣品緩沖液三:操作步驟:1培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備:1:胰酶酶解后裂解:細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí),以含0.05%胰蛋白酶消化,細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次,離心收集在離心管中,加入450l裂解液反復(fù)吹打。2:皿上直接裂解:細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí),細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗

12、3次,加入450l裂解液,細(xì)胞刮刀收集,用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中,反復(fù)吹打。以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理,超聲時(shí)為5S,間歇時(shí)間為10S,功率為100-120W至溶液清澈無(wú)粘稠為止,處理過(guò)程在水浴中進(jìn)行,后425000g離心1小時(shí)取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次,每次15-30S,在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S,加入Laemmli 樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合,強(qiáng)力混勻,樣品置100水浴箱里水浴加熱3-5分鐘,10000g離心10分鐘,取出清液,將其移入另一潔凈試管中,至此,電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。(樣品可立即使用也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持

13、數(shù)月2組織樣品的制備:手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中,漂洗數(shù)次,以清潔表面的血跡,將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中,按組織凈重,裂解液=1:10的比例,加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿,離心收集上清(如有粘稠物可超聲處理,具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備,也可以冷凍干燥降解核酸后,將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘觔uffer中,混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解,有5分鐘即可,4度離心收集。加入Laemmli樣品緩沖液(視蛋白樣品濃度,以1:1或1:2的比例混合強(qiáng)力混勻,樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘,10000g離心10分鐘,取上清液,將其轉(zhuǎn)

14、入另一潔凈的試管中,至此,電泳樣品已準(zhǔn)備就緒(樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存,-20存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。附:一:裂解液的制備:組織裂解液(全細(xì)胞蛋提取:1:Tris-HCL 50mmoL/L PH 7.42: Nacl 150 mmoL/L3: 去氧膽酸鈉 0.25%4:NP-40或Triton-x-100 1%5: EDTA 1 mmoL/L6: PMSF 1 mmoL/L7: Aprotinin 1g/ml8: leupeptin 1g/ml9: pepstain 1g/ml其中:7,8,9作用不持久,要使用前加入。細(xì)胞裂解液:1:NP-40裂解體系:150 mmoL/L Nac

15、l1.0%NP-40或Triton-x-10050 mmoL/L Tris(PH8.02:RIPA裂解體系:150 mmoL/L Nacl1.0%NP-40或Triton-x-1000.5%脫氧膽酸鈉0.1%SDS50 mmoL/L Tris( ph8.0二:Laemmli 樣品緩沖液配置(1*SDS樣品緩沖液50 mmoL/L Tris-HCL (PH8.0100 mmoL/L DTT2% SDS0.1% 溴酚藍(lán)10% 甘油此液可以配置成不同的儲(chǔ)存液,根據(jù)蛋白濃度而定,40C長(zhǎng)期保存,用時(shí)臨時(shí)與蛋白液按比例混合,其中DTT應(yīng)臨時(shí)加入,以防降解。蛋白質(zhì)定量1Bradford法:檢測(cè)原理: Br

16、adford與蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu),特殊氨基酸結(jié)合,由棕色變成藍(lán)色,595nm檢測(cè).該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的,但不使用于小分子堿性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污劑的濃度超過(guò)0.2%影響測(cè)定結(jié)果,如TritonX-100,SDS,NP-40等.Bradford法濃染液的配制:將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml濃磷酸;然后,用蒸餾水補(bǔ)充至200ml;此染液放4至少6個(gè)月保持穩(wěn)定.標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的制備:盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品,例如測(cè)定抗體,可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn),如果待測(cè)樣品是未知的,也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,通常在20

17、g -150g/100l之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將待測(cè)樣本溶于100l緩沖溶液中,該緩沖溶液相同(最好用PBS按照1:5用水稀釋濃燃料結(jié)合溶液,如果出現(xiàn)沉淀,過(guò)濾除去.每個(gè)樣品家5ml稀釋的燃料結(jié)合溶液,作用5-30分鐘,燃料與蛋白結(jié)合,將由紅色變?yōu)樘m色,在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度,注意顯色反應(yīng)不超過(guò)30分鐘.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的濃度.2Lowry法:檢測(cè)原理: 是Cu2+與蛋白作用生成的Cu+與雙縮脲試劑形成蘭色絡(luò)合物,菲林試劑增強(qiáng)蘭色形成,750nm檢測(cè).首先,將20g碳酸鈉溶于500ml水中;再將1g CuSO4.5H2O和2g酒石酸鈉溶于500ml蒸餾水中;將銅/酒石酸鈉溶液放在磁

18、力攪拌器上攪拌緩緩加碳酸鈉溶液,儲(chǔ)存于冰箱中,可穩(wěn)定保存1年以上.Folin-ciocalteu酚試劑按體積比1:2:1將銅/酒石酸/碳酸鈉,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室溫下儲(chǔ)藏,可穩(wěn)定保存2周,標(biāo)明為試劑A按體積比1:5將Folin-ciocalteu酚試劑和H2O混合,室溫下儲(chǔ)存于琥珀色試劑瓶中,可穩(wěn)定保存1個(gè)月,表明為時(shí)機(jī)B用蒸餾水將樣本(5-100g稀釋為1ml,并準(zhǔn)備100,50,25,12.5g /ml,4個(gè)濃度的BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.每個(gè)蛋白樣品家1.0ml試劑A,混合均勻,在室溫下孵育10分鐘.加入0.5 ml試劑B并立即混合, 在室溫下孵育30分鐘.在7

19、50nm光波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本蛋白質(zhì)的濃度.3紫外分光光度法:檢測(cè)原理:是因蛋白質(zhì)樣品在280nm波長(zhǎng)下有最大吸光率,最大吸光率主要取決于酪氨酸和色氨酸的存在.純化蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定:在280nm波長(zhǎng)下讀取與適當(dāng)對(duì)照相比較的吸光值.對(duì)于抗體和BSA,可按照下述標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其濃度,對(duì)其他蛋白質(zhì)粗略地估計(jì):1單位吸光值相當(dāng)于1mg/ml蛋白質(zhì) A280(1mg/mlIgG 1.35IgM 1.2BSA 0.7含有核苷酸的蛋白質(zhì)溶液濃度的測(cè)定:蛋白質(zhì)濃度(mg/ml=(1.55*A280-(0.76*A260蛋白質(zhì)濃度(mg/ml=A205(27+120A280/A2051SDS-PAG

20、E設(shè)備和材料電泳裝置(垂直板電泳槽為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYCZ-24D型電泳裝置。電泳儀(電源為北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-8B型。振蕩器2試劑丙烯酰胺(電泳級(jí)N,N-甲叉雙丙烯酰胺(bisSDSTEMEDTris過(guò)硫酸銨-巰基乙醇或DTT甘油甘氨酸溴酚藍(lán)(11鹽酸3聚膠前準(zhǔn)備:配制凝膠儲(chǔ)液: T%=30% C%=1% arc:bis=29:1 過(guò)濾后4避光保存。配制濃縮膠緩沖液: 1.0mol/L TrisHCl Ph6.8, 過(guò)濾后4避光保存。配制分離膠緩沖液: 1.5mol/L TrisHCl Ph8.8, 過(guò)濾后4避光保存。配制10%SDS配制10%過(guò)硫酸銨(APTEMED原溶液電泳

21、緩沖液(5×:Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,臨用時(shí)稀釋5倍至1×SDS 電泳緩沖液加入電泳槽中。4制膠: 制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間,最好是分離膠聚合控制在分離膠從加入10%AP和TEMED起至開始出現(xiàn)凝膠的時(shí)間為15-20分鐘(并不是此時(shí)已凝聚完全。對(duì)濃縮膠最佳聚合速度為8-10min開始可見聚合,可以通過(guò)調(diào)節(jié)AP和TEMED的加入量來(lái)控制,因液體中含有分子氧可抑制凝膠的聚合,故用時(shí)可在真空中抽氣以排除液體中的分子氧,灌完分離膠后加水以封閉分離膠與外界氧氣的結(jié)合,總之,要掌握一個(gè)原則:即用盡量少的催化劑在最佳時(shí)間聚合。按比例配制分離膠,輕緩地?fù)u動(dòng)溶液

22、(8-10下,使激活劑混合均勻,將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,再在液面上小心注入一層水或正丁醇,以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中,然后靜置90min。同前按比例配制濃縮膠,但搖動(dòng)溶液時(shí)不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分,以連續(xù)平穩(wěn)的液流注入凝膠溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,靜制90min以上以保證完全聚合。5預(yù)電泳:將聚合好的凝膠安置于電泳槽中,小心拔去梳子,加入上下槽電泳緩沖液后低電壓短時(shí)間的預(yù)電泳(恒壓10-20V,20-30min,清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì),疏通凝膠孔徑以保證電泳過(guò)程中電泳的暢通。6加樣:預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品和待分析樣品,注意加樣時(shí)

23、間要盡量短,以免樣品擴(kuò)散,為避免邊緣效應(yīng),可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液。7電泳:加樣完畢,蓋好電泳槽的蓋子并選擇適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳,通常在連續(xù)系統(tǒng)中,上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓,使樣品更好的進(jìn)入凝膠,電泳時(shí),應(yīng)采用恒壓的模式,這樣蛋白質(zhì)才可以保證恒定的電泳遷移率。一般采用恒壓濃縮膠80V,分離膠120V,電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳。8染色和脫色考馬斯亮藍(lán)染色:將凝膠取出放入培養(yǎng)皿中到如少量的染色液,以浸沒(méi)凝膠為宜,在搖床上震蕩,直到凝膠上出現(xiàn)明顯的條帶為止,一般5-6小時(shí)或者4過(guò)夜;然后傾去染色液,用脫色液洗滌震蕩,其間要不斷換脫色液,直至脫色液顏色

24、稍清亮.,凝膠背景清楚為止.染色液配制:90ml甲醇和H20混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍(lán)R250用濾紙過(guò)濾染液以除去顆粒不溶性物質(zhì).脫色液的配制:90mL(甲醇:H20(1:1 V/V和10ml冰乙酸溶液.附:一、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的選擇凝膠電泳中一個(gè)關(guān)鍵的指示系統(tǒng),即蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Molecular Weight Marker,電泳的分離效率,轉(zhuǎn)膜效率以及電泳泳動(dòng)情況等,皆需通過(guò)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)顯示,目前普遍采用的幾種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品有: Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker M

25、ix Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight MarkerMix以上兩種Marker均為PIERCE公司的產(chǎn)品,貨號(hào)為:prod# 26681; prod# 26691;該標(biāo)準(zhǔn)蛋白不需染色,在電泳凝膠中隨著蛋白質(zhì)的遷移,各種分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白逐漸分開,而顯示出非常漂亮的多色條帶,可通過(guò)電泳槽直接肉眼觀察各電泳帶的凝膠中的泳動(dòng)情況,當(dāng)相對(duì)于目的蛋白大小的標(biāo)準(zhǔn)蛋白與相鄰兩條標(biāo)準(zhǔn)蛋白達(dá)到所需分辨距離時(shí),即可停止電泳,取出凝膠做進(jìn)一步的轉(zhuǎn)膜工作。 Chemiluminescent BlueRangerR peroxidase-Labl

26、ed proteinMolecular Weight Marker Mix以上也為PIERCE產(chǎn)品,貨號(hào)為:prod# 26651,該標(biāo)準(zhǔn)蛋白同上也具有以上作用外,同時(shí)在使用化學(xué)發(fā)光時(shí),和樣品一起顯色經(jīng)膠片曝光后,在膠片上可出現(xiàn)漂亮的條帶。 Blotinylated SDS Molecular Weight Marker Mix以上為Sigma公司產(chǎn)品,貨號(hào)為B2787,作用效果同二、對(duì)照的設(shè)置一般需要設(shè)立:內(nèi)參照, 提示系統(tǒng)的穩(wěn)定性,一般是一些管家蛋白陽(yáng)性對(duì)照, 即肯定可以表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞,同時(shí)可以提示你一抗的質(zhì)量陰性對(duì)照: 即肯定不會(huì)表達(dá)你的目的蛋白的組織或者細(xì)胞.在實(shí)驗(yàn)中根

27、據(jù)你的需要選擇免疫印跡蛋白質(zhì)印跡法是將蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)SDS-PAGE后,分離為不同條帶,其中含有能與特異性抗體(或McAb相應(yīng)的待檢測(cè)的蛋白質(zhì)(抗原蛋白,將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到NC膜上此過(guò)程稱為blotting,以利于隨后的檢測(cè)能夠的進(jìn)行,隨后,將NC膜與抗血清一起孵育,使第一抗體與待檢的抗原決定簇結(jié)合(特異大蛋白條帶,再與酶標(biāo)的第二抗體反應(yīng),即檢測(cè)樣品的待測(cè)抗原并可對(duì)其定量.一、設(shè)備和材料轉(zhuǎn)移電泳槽和轉(zhuǎn)移電泳儀(電源震蕩器冰箱濾紙NC膜膠片暗室二、試劑封閉液:5%的脫脂牛奶粉TBS-T第一抗體(Ab1第二抗體(標(biāo)記的Ab2底物以及顯色指示劑漂洗液(TBS-T轉(zhuǎn)印緩沖液抗體稀釋液麗春

28、紅S顯影液定影液三、試劑的配制封閉液: 5g的脫脂牛奶+100ml的TBS-T漂洗液(TBS-T: 0.01M TBS-T為Tris 1.21g+ NaCl5.84g+800ml H2O用HCl調(diào)節(jié)PH到7.5,假如0.05%或者0.1%Tween-20用H2O定溶至1000ml轉(zhuǎn)印緩沖液: 同5×SDS電泳緩沖液,不含SDS,如果采用PVD干膜或NC膜加20%甲醇,不加甲醇也可以Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1000ml,一般不需調(diào)節(jié)PH值 ,用時(shí)稀釋5倍到1×轉(zhuǎn)印緩沖液.顯影液:H2O-750ml米土爾-3g無(wú)水亞硫酸鈉-100g對(duì)苯二酚-3g溴化鉀-3g無(wú)水

29、碳酸鈉:先加5gPH10.0不夠時(shí)再加5g注:以上配定加H2o定容至1000ml定影液:起始水溫:60 H2o 700ml硫代硫酸鈉:240g無(wú)水亞硫酸鈉:25g冰醋酸:48ml注:加H2o至1000ml四、電印跡蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE分離后,必須從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上,固相支持物具有牢固結(jié)合蛋白又不影響蛋白質(zhì)Ag活性,而且支持物本身還有免疫反應(yīng)惰性等特點(diǎn),常用的支持物有:硝酸纖維膜(NC膜或PVDF膜。蛋白質(zhì)從凝膠向膜轉(zhuǎn)移的過(guò)程普遍采用電轉(zhuǎn)印法,分為半干式和濕式轉(zhuǎn)印兩種模式。一.半干式電轉(zhuǎn)印1. Tris/甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后,取出凝膠,在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取

30、凝膠方法:用刀片將兩玻璃板分開,將多余的凝膠劃去,上部以濃縮膠為準(zhǔn)全部棄去,下部以分子量標(biāo)準(zhǔn)最小分子帶下一點(diǎn)全部劃去,取一10ml注射器注滿轉(zhuǎn)印緩沖液,插入玻璃板與凝膠之間注水,使水的壓力將兩者自然分開,邊推邊進(jìn),反復(fù)多次注水,直至凝膠從玻璃板上滑落下來(lái)。2. 將NC膜和濾紙切出與凝膠一樣大小,置轉(zhuǎn)移緩沖液中濕潤(rùn)5-10min.3. 按照以下順序放置濾紙,凝膠和NC膜到半干槽中。4. 每層之間的氣泡要全部去除?？梢杂?0ml吸管輕輕在上一層滾動(dòng)去除氣泡,然后用一絕緣的塑料片中間挖空與凝膠一樣大小或略小一點(diǎn),以防電流直接從沒(méi)有凝膠處通過(guò)造成短路,蓋好加上陽(yáng)極電極板。二.濕式電轉(zhuǎn)印1. Tris/

31、甘氨酸-SDS-PAGE結(jié)束后,取出凝膠,在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒。取出凝膠方法同半干式電轉(zhuǎn)印。2. 打開電轉(zhuǎn)印夾,每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印液浸泡透的海面墊,再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙,濾紙與海面墊大小相同或與NC膜,凝膠大小相同均可,將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上,最后將NC膜平放在凝膠上,去除氣泡,夾好電轉(zhuǎn)印夾。3. 電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液,插入電轉(zhuǎn)印夾,將電泳槽放入冰箱內(nèi)(電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷,連接好電極,接通電流,轉(zhuǎn)印夾的NC膜應(yīng)對(duì)電泳槽的正極。五、印跡膜上總蛋白的染色在確定印跡中是否存在總蛋白之前,通過(guò)對(duì)硝酸纖維素膜染色可以了解轉(zhuǎn)印至膜上的總蛋白質(zhì)的組成情況,并可確定蛋白質(zhì)分

32、子質(zhì)量標(biāo)記物的位置和確定轉(zhuǎn)印成功,同時(shí),該方法也清楚地顯示出轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)的復(fù)雜性.麗春紅S印跡膜染色法:麗春紅S適用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后續(xù)的處理中紅色染料易被洗去,由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合是可逆性的,該染色方法適用于所有顯示抗原的餓技術(shù), 麗春紅S帶負(fù)電荷,可以與帶正電賀的氨基酸殘基結(jié)合,同時(shí)麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結(jié)合,從而形成紅色條帶.1麗春紅溶液的配制:儲(chǔ)存液(10×: 0.1g麗春紅溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,臨用前稀釋10倍為應(yīng)用液.2操作步驟轉(zhuǎn)印結(jié)束后取出印跡膜至于麗春紅S應(yīng)用液中,并在室溫下攪動(dòng)5-10分鐘將膜放入 PBS 洗數(shù)次,每次 1

33、-2 分鐘,并且更換 PBS 根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位置進(jìn)行標(biāo)記 至此膜可以用于封閉和加入抗體 x ?5>? / fa r y1 eZl 3kfg #jF=Yj 六、膜的封閉 k cog(Sd 5M 在進(jìn)行抗體雜交之前，需要先對(duì)轉(zhuǎn)印膜進(jìn)行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。封閉一 般采用異源性蛋白質(zhì)或去污劑，常用的有 0.2%Tween-20，20%BSA，10%馬血清以及 5% No-fat milk 等，至于選擇哪一類封閉液，首先應(yīng)考慮與檢測(cè)試劑相適應(yīng)，如采用葡萄球蛋白 A（SPA） 作用檢測(cè)試劑，就不能用全血清封閉，其次是盡可能使非特異著色背靜淺，封閉液以 20%BSA 效

34、果較好，其次是 5%N-fat milk. 封閉過(guò)程： xtUTOV =yW8NQ ca 1 洗轉(zhuǎn)印膜：室溫漂洗 3 次 x10min,以盡量洗去轉(zhuǎn)印膜上的 SDS，防止影響后面的抗體結(jié)合。 PjKSX0+k 2 取漂洗的轉(zhuǎn)印膜，放入 5% No-fat milk 的封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，室溫封閉 2h，也可在 4 度過(guò)夜。 AG jRc 3 用 1xTBS-T ，PH7.6 洗液，室溫漂洗 3 次 x10min. tBu tAxd f#q2Bv : 七、抗體雜交 8 OJ_E i 抗體表面主要采用間接法。即先加入未標(biāo)記特異性抗體（Ab1）與膜上抗原結(jié)合，再加入標(biāo)記 的抗抗體（Ab2）進(jìn)行雜交檢

35、測(cè)，標(biāo)記 Ab2 物質(zhì)有放射性核素，酶，以及生物素等。 雜交過(guò)程： d,z I? 3/ ;gq5 M,=$ ）封閉后的雜交膜放入雜交袋中，加入抗體稀釋液稀釋的 Ab1 濃度為 1ug/ml，封口，4孵 育過(guò)夜或室溫（22-25）搖動(dòng)孵育 2h. ） 液洗膜 3 次 x10min (Bv15 H0$> q0h ）標(biāo)記的 Ab2（羊抗兔-HRP）室溫 1h，洗膜 3x10min -8 6+2 / >GYD '&xJ 八、檢測(cè) |#Y 2sM 根據(jù)標(biāo)記 Ab2 的標(biāo)記物不同,其雜交的結(jié)果檢測(cè)方法也不同,較常用的檢測(cè)系統(tǒng)有 HRP 標(biāo)記 Ab2 的的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL和

36、DAB 檢測(cè)系統(tǒng). 1 辣根過(guò)氧化物酶-DAB 法: >?KIX " ?NSZiM DAB 顯色液的配制:按照 1mlH2O 加顯色劑 A,B,C 各 1 滴,混勻. b5ir tE=Y 顯色:將適量 DAB 顯色液平鋪在 Ab2 雜交后的印跡膜上,室溫放置觀察,可出現(xiàn)明顯的棕褐色 蛋白顯色帶 kzU MyY9R K 終止:用 Tris-HCl 緩沖液或水漂洗雜交膜即可終止反應(yīng). 2 辣根過(guò)氧化物酶-ECL 法: jB BZ R# H"An < 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL檢測(cè)是利用辣根過(guò)氧化物酶催化化學(xué)發(fā)光物質(zhì),生成一種不穩(wěn)定的中間物 質(zhì),其衰變時(shí)在暗室內(nèi)形成明顯的肉眼可見的化學(xué)發(fā)光帶,利用 X 線膠片感光原理,將結(jié)果記錄 下來(lái): hx- n24=+ ECM 顯色劑配制:按 mlH2O 加顯色劑 A、B 各 1 滴,混勻. Rp&To =Yy6D