張忠亮魚腥草莖在不同時期多糖含量比較

1、 本科畢業(yè)論文 （設(shè)計）( 2013屆 ) 題 目： 魚腥草莖在不同時期多糖含量比較 學 院： 生命與環(huán)境科學學院 專 業(yè)： 生物科學 學生姓名： 張忠亮 學號： 20909041084 指導教師： 余利華 職稱（學位）： 工程師（碩士） 合作導師： 陳向陽 職稱（學位）： 講 師（碩士） 完成時間： 2013 年 5 月 25 日 成 績： 綜合成績： 等級： 黃山學院教務(wù)處制學位論文原創(chuàng)性聲明茲呈交的學位論文，是本人在指導老師指導下獨立完成的研究成果。本人在論文寫作中參考的其他個人或集體的研究成果，均在文中以明確方式標明。本人依法享有和承擔由此論文而產(chǎn)生的權(quán)利和責任。聲明人（簽名）：201

2、3年 6 月 1 日目 錄中文摘要英文摘要1引言51.1魚腥草簡介51.2魚腥草的研究價值51.3超聲波的作用原理52材料儀器和實驗方法62.1材料儀器準備62.1.1材料的準備和處理62.1.2實驗試劑62.1.3實驗器材62.2試驗方法62.2.1多糖含量測定原理6標準曲線的繪制6魚腥草的脫脂脫色7單因子實驗7正交試驗9不同時期多糖的測量93實驗結(jié)果與分析104.1標準的繪制104.2單因素實驗114.3正交實驗114.4不同時期多糖的測量124討論13參考文獻14致謝14魚腥草莖在不同時期多糖含量比較張忠亮（20909041084）導師：余利華（工程師）合作導師：陳向陽（講師）（黃山學院

3、生命與環(huán)境科學學院，黃山學院）摘要：先分別通過單因素實驗和正交實驗對魚腥草莖中的多糖進行超聲波提取，以魚腥草提取率作為指標，分別對超聲波浸提時間，水浴時間，水浴溫度以及乙醇濃度這些因素進行考察，從而得出超聲波提取魚腥草莖中多糖的最好條件：超聲波浸提時間30min，水浴時間90min，水浴溫度80，乙醇濃度80%。然后在最佳條件下分別測四個不同時期下魚腥草莖中多糖的提取率，從而得出魚腥草莖中多糖在6月份含量比較豐富。關(guān)鍵詞：魚腥草；多糖；單因素；正交；超聲波；不同時期Houttuynia cordata stems in the polysaccharide content in differe

4、nt periods Zhong-Liang ZHANG（20909041084）Supervisor: Li-Hua YU(Engineer)Co-supervisor:Xiang-Yang CHEN(Lecturer)(College of Life and Environment sciences, Huangshan University, Huangshan, 245041 China)Abstract:first by single factor experiment and orthogonal experiment for ultrasonic extraction of po

5、lysaccharide of Houttuynia cordata stems, rate as the index in Houttuynia cordata extraction, ultrasonic extraction time of time, water bath, water bath temperature and ethanol concentration on these factors, then the best extraction conditions of polysaccharide in Houttuynia cordata stems: ultrason

6、ic ultrasonic the extraction time, water bath time, water bath temperature, ethanol concentration. The extraction rate and then under the optimal conditions were measured at four different times of H. cordata stems polysaccharide, thus draws cordata stems polysaccharides rich in content.Key Words: H

7、outtuynia cordata; polysaccharide; single factor; orthogonal; ultrasonic; different periods 1 引言 1.1 魚腥草特點 魚腥草（Houttuynia cordata） 又名側(cè)耳根，魚鱗草等，是三白草科（Saururacere）蕺菜屬(Houttuynia),是很常用中草藥。為多年生草本植物，高3050厘米，常呈紫紅色，下部伏地蔓生、生根，節(jié)上輪生小根。因其含有魚腥氣味，故而得名魚腥草。魚腥草生長于陰濕處或山澗邊，?？稍谝暗?、路旁、庭園樹下等較陰濕的地方發(fā)現(xiàn)，大片蔓生。該植物我國南方各地較常見。魚腥草內(nèi)

8、含有黃酮，蛋白質(zhì)，多糖等等。由于多糖有多種生物活性，與生物機能的維持密切相關(guān)，各種植物多糖有很多的藥理作用藥理研究表明魚腥草具有：抗菌作用，抗病毒作用，增強機體免疫功能，利尿作用抗炎抗過敏作用。還有學者發(fā)現(xiàn)，魚腥草水溶性多糖多葡萄球菌，變形桿菌，大腸桿菌，沙門氏菌有不同的抑菌效果，七對雙歧桿菌有促增效果2。其獨特的功能和低毒性有很廣的前景。 1.2 魚腥草的研究價值 魚腥草含有比較豐富的藥用成分和營養(yǎng)成分，是一種藥食兼用的野生植物，具有清熱解毒，利尿消腫。治肺炎，肺膿瘍，熱痢，白帶，癰腫，禿瘡，疥癬等功效12。其富含人體所需的蛋白質(zhì)，脂肪，鈣，維生素C和維生素E等營養(yǎng)成分。其主要含有的是揮發(fā)油

9、和黃酮類。這些方面已有很多人做過相關(guān)的研究。而多糖是對人類很重要的化合物，人們從內(nèi)到外都離不開它，而其多糖低毒性的性質(zhì)也很值得去了解。本實驗主要是借助超聲波對不同魚腥草莖內(nèi)的多糖進行提取分析。進而分析出不同時期魚腥草莖中多糖含量最為豐富的時期。為更高效的利用魚腥草提供一定理論依據(jù)。1.3 超聲波的作用原理超聲波提取是很高效的一種強化提取效果的方法1,2,5,8。主要是利用超聲波所產(chǎn)生的超聲能，強烈的機械振動和空化效應。當超聲波振動時，產(chǎn)生很大的能量，從而引起媒質(zhì)以很大的速度進入加速的振動狀態(tài)。使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使有效成分進入溶劑中。除此之外，超聲波還在液體中國產(chǎn)生空化作用，而且伴隨強大的沖擊

10、波和微聲波，以致細胞壁被破壞，植物內(nèi)的物質(zhì)成分會釋放出來從而會提高相應物質(zhì)的提取率。除此之外，超聲波還有些像熱效應，乳化等等，也會相應的提高物質(zhì)的提取率5,15。2 材料儀器和實驗方法 2.1. 1 材料的準備和處理魚腥草是分不同時期（2012年4月20日,5月3日，5月28日，6月10日）在黃山學院南區(qū)內(nèi)挖得，洗凈后將根莖葉分開取莖，放入干燥相中恒溫70干燥24小時，直至恒重，然后在粉碎機中粉碎放置在干燥的地方備用。2.1.2 實驗試劑95%乙醇（上海振企化學試劑有限公司），濃硫酸（上海振企化學試劑有限公司），葡萄糖（天津博迪化工股份有限公司），石油醚（新隴化工股份有限公司），乙醚（揚州滬寶

11、化學試劑有限公司），蒸餾水，蒽酮（上?？曝S化學試劑有限公司）。2.1.3 實驗器材微型植物試樣粉碎機 (金壇市杰瑞爾電器有限公司 ) ；電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（上海奧普勒儀器有限公司）；超聲波清洗機（曙峰企業(yè)制造）；索氏提取器（上海新嘉電子有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮有限公司產(chǎn)品)；粉碎機；試管；量筒；燒杯；容量瓶等。2.2 實驗方法2.2. 1 多糖含量測定原理利用苯酚-濃硫酸法測定多糖的含量3，因多糖在濃硫酸作用下，分子內(nèi)脫水生成羥甲基糠醛或者

12、羥甲基糠醛，其與苯酚縮合生成一種橙紅色化合物，在490nm波長下有最大的吸收峰，所以可以用比色法在此波長下測定吸光度2，進而算出多糖的含量。此法靈敏度高，基本不受蛋白質(zhì)的存在干擾。而本次試驗的基本流程是：材料的脫脂脫色，干燥，精確稱量，加酒精，超聲波浸提，水浴加熱，靜置，過濾取上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮，靜置，離心，取沉淀物加蒸餾溶解水并加熱，過濾去除雜質(zhì)，然后醇析離心，得到粗多糖，再定溶，最后按照苯酚-濃硫酸法測相應多糖的吸光度A值2,15，進而得出結(jié)論。2.2.2 標準曲線的繪制3,9利用電子天平精密稱取干燥張致恒重的葡萄糖0.0966g加水溶解至100ml,然后再取1ml定容至10m

13、l容量瓶中，制的0.0966mg/ml的葡萄糖對照品儲備液。取11支試管按0到11編號，0號作對照；1,2號加0.20ml葡萄糖儲備液；3,4號加0.40ml葡萄糖儲備液；5,6號加0.60ml葡萄糖儲備液；7,8號加0.80ml葡萄糖儲備液；9,10號加1.00ml葡萄糖儲備液；然后將0到10號全部加蒸餾水定容至2.00ml；然后按照順序向試管中加入1.00ml的9%的苯酚溶液和5.00ml的濃硫酸（濃硫酸加入一定要緩慢），搖勻，靜置30分鐘。最后以0號試管為參照，在490nm波長下測吸光度A值3,9。做好登記，以橫坐標為糖含量，吸光度A值為縱坐標，繪制標準曲線并進行線性回歸的的求解見圖3-

14、1。 2.2.3 魚腥草粉末的脫脂脫色將不同時期的魚腥草莖用電子天平精確稱各取6包，每包1g，再稱任一時期的材料9包，均用濾紙包好并做好標記。然后在索氏提取器中用石油醚脫脂脫色4小時，提取溫度恒定在70。然后取出放入電熱恒溫鼓風干燥箱中在70下干燥12個小時以上，使之達到恒重。之后放入干燥箱中作為實驗材料。脫脂脫色對其多糖的提取是很重要的步驟，脂類和色素的存在是很影響多糖的測定的，所以脫脂脫色要充分。2.2.4 單因子實驗每次實驗均取同一時期的“”中的材料四包，即每次取同一時期的4克，分別放入4個試管中，按下圖表2-1，表2-2，表2-3和表2-4中依次編號，每支試管中均加20ml的乙醇，并且

15、按下面表格添加試劑和進行實驗13,15。表2-1 乙醇濃度的選擇實驗table 2-1 Choice experiment ethanol concentration實驗條件試管編號1.11.21.31.4乙醇濃度60%70%80%90%水浴溫度70707070水浴時間30min30min30min30min超聲波浸提時間30min30min30min30min表2-2 水浴溫度選擇的實驗Table 2-2 bath temperature selection experiment實驗條件試管編號2.12.22.32.4乙醇濃度70%70%70%70%水浴溫度60708090水浴時間30min

16、30min30min30min超聲波浸提時間30min30min30min30min表2-3 水浴時間選擇的實驗Table 2-3 bath time selection experiment實驗條件試管編號3.13.23.33.4乙醇濃度70%70%70%70%水浴溫度60708090水浴時間30min60min90min120min超聲波浸提時間30min30min30min30min表2-4 超聲波浸提時間的選擇實驗table 2-4 Choice experiment ultrasonic extraction time實驗條件試管編號4.14.24.34.4乙醇濃度70%70%70%

17、70%水浴溫度60708090水浴時間30min30min30min30min超聲波浸提時間30min45min60min75min 然后靜置過濾取上清液，濾液在RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，在靜置12小時，在離心機中以3000r/min離心30min,然后沉淀物溶于蒸餾水中，加熱去除不溶物，醇析離心，得到魚腥草粗多糖，最后按照“”中的苯酚-濃硫酸法2在紫外可見分光光度計（490nm）中分別測其吸光度A值，作好記錄。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)制作表格見圖3-2。2.2.5 正交實驗1,3,7,12在單因素的基礎(chǔ)之上選擇不同的乙醇濃度，水浴時間，水浴溫度和超聲波浸提時間為條件進行正交實驗，取“”中單獨處理的

18、16包材料為實驗材料，分別放入16支試管中依次編號1到9號，加入的各梯度的酒精均為20ml。以確定魚腥草的最佳提取工藝其各條件的試驗情況見表2-5。表2-5 正交實驗各因素的條件Table 2-5 factors orthogonal experiment conditions 條件 編號 超聲波浸提時間（min）水浴時間（min）水浴溫度（）乙醇濃度（%）5.1306070705.2309080805.33012090905.4456080905.5459090705.64512070805.7606090805.8609070905.9601208070然后靜置過濾取上清液，濾液在RE-5

19、2AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，在靜止12小時，在離心機中以3000r/min離心30min,然后沉淀物溶于蒸餾水中，加熱去除不溶物，醇析離心，得到魚腥草粗多糖，最后按照“”中的苯酚-濃硫酸法2在紫外可見分光光度計中分別測其吸光度A值，作好記錄。制作表格見圖3-3。2.2.6 不同時期多糖含量的測定 在單因素實驗和正交實驗的基礎(chǔ)上選擇最佳的實驗條件，即乙醇濃度80%，水浴溫度80%，水浴時間90min和超聲波浸提時間30min。分別取各個時期的“”中的材料各一包，分別放入4支試管中，依次編號6.1，6.2，6.3，6.4對應的魚腥草莖的日期為4月20日，5月3日，5月28日，6月10日。和上面一樣加入

20、酒精的體積也為20ml然后按照表2-6進行操作。表2-6 不同時期多糖含量測定的實驗Table 2-6 determination of polysaccharide content in different periods of experimenttable 條件 編號 乙醇濃度（%）水浴溫度（）水浴時間（min）超聲波浸提時間(min)6.1808090306.2808090306.3808090306.48080903然后靜置過濾取上清液，濾液在RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，在靜止12小時，在離心機中以3000r/min離心30min,然后沉淀物溶于蒸餾水中，加熱去除不溶物，醇析離心

21、，得到魚腥草粗多糖，最后按照“”中的苯酚-濃硫酸法2在紫外可見分光光度計中分別測其吸光度A值，作好記錄，根據(jù)數(shù)據(jù)制作表格見圖3-3。3 實驗結(jié)果 3.1 標準曲線的繪制表3-1 葡萄的糖標準曲線 Grape 3-1 Glucose standard 圖3-1所示標準曲線回歸方程:Y=1.5312X+o.0006,R²=0.9906其吸光度與濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。 3.2 單因素實驗 圖3-2 魚腥草莖部多糖提取單因子實驗結(jié)果圖 Grape 3-2 Extraction of single factor experiment results polysaccharidecordat

22、a stems. 由單因素的實驗結(jié)果圖可以看出在固定三個變量恒定的情況下，吸光度最大，即魚腥草莖部多糖的提取率最大的條件為乙醇溶液的濃度為80%，水浴溫度為80，水浴時間為120min，超聲波浸提時間為45min。3.3 正交實驗 表3-1 魚腥草莖部多糖提取的正交實驗結(jié)果3,16，7table 3-1 Results of orthogonal test Houttuynia cordata stems polysaccharide extraction 條件 編號 超聲波浸提時間（min）水浴時間（min）水浴溫度（）乙醇濃度（%）提取率mg/g5.1306070703.8615.2309

23、080806.0235.33012090904.7265.4456080903.7545.5459090705.4565.64512070804.3785.7606090802.7655.8609070905.3975.96012080704.345K14.7803.4604.5454.554K24.5315.6274.7074.389K34.1694.4834.3164.631R0.6112.1670.3910.242由表3-1 魚腥草莖部多糖提取的正交實驗結(jié)果可知對魚腥草莖部多糖提取率影響的主要因素依次為：水浴時間>超聲波浸提時間>水浴溫度>乙醇濃度；而提取率最佳的組合為

24、:超聲波浸提時間為30min，水浴時間為90min，水浴溫度為80，乙醇濃度為80%；在這個組合的條件下其魚腥草莖部的提取率為6.023mg/g。 3.4 不同時期多糖的測定 圖3-3 不同時期魚腥草莖部多糖提取測定圖Grape 3-3 Determination of Fig.in different periods of Houttuynia cordata stems to extract polysaccharide 由圖3-2可以看出6月10日的魚腥草吸光度最大，所以相對其他時期而言其莖部多糖的含量比較豐富。4 討論本次試驗通過單因子實驗，正交試驗對魚腥草莖部多糖的提取率的四個影響因

25、子進行比較分析，選擇出組合搭配最佳的一組，即為乙醇濃度80%，水浴溫度80，水浴時間80min和超聲波浸提時間30min。在這個組合下經(jīng)過對不同時期魚腥草莖部的多糖含量進行比較可知，6月份的多糖含量比較高。這次的實驗只考慮了四個剛面的單因子，其實影響多糖的提取率的因素還有許多，比如料液比，超聲波的頻率等等，要想更佳全面準確的分析魚腥草多糖的提取率，這些因素都是不可以忽略的。就本實驗而言是比較不同時期的含量的大小，所以不是那么重要。從整個實驗過程核試驗數(shù)據(jù)的結(jié)論來看，整個四個時期多糖含量并未表現(xiàn)出怎樣的規(guī)律，而且多糖含量之間的差異也很小，這樣的結(jié)果可能有多方面的原因。首先，從材料的獲取上魚腥草四

26、個時期間隔的太短，在時間上并不能體現(xiàn)出差距，材料采集的時期上也沒有季度上的跨度，因而多糖含量的變化并不是表現(xiàn)得很明顯。另一方面，在材料的獲取上，是在黃山學院南區(qū)，但并不是同一個地方挖取得，各個地方的土地環(huán)境光等等照條件不一樣，所以魚腥草長勢的條件差異很大，這也是對其含量影響比較大的因子。從圖3-3來看，6月份以后魚腥草莖部多糖的含量可能還會上升。所以要更明顯有效測定魚腥草莖部多糖含量的情況，應將時間跨度拉大，并且側(cè)更多的時期而且魚腥草的來源應相同。從單因子實驗到正交實驗中，我們可以明顯的看到，在單因子試驗中各個提取率最高的的影響因子的組合，并不是正交試驗的最佳組合。各個影響因子對多糖提取率的影

27、響是有大小的從，本實驗表3-1看出對魚腥草莖部多糖的提取影響從大到小為水浴時間，超聲波浸提時間，水浴溫度和乙醇濃度。而只有在最佳的組合水浴時間90min，水浴溫度80，超聲波浸提時間30min，和乙醇濃度為80%條件下達到最大的提取率。而在多糖提取的過程中超聲波的作用是關(guān)鍵的，它破壞細胞，改變植物組織，發(fā)揮它像空化作用等特殊的作用加速以及提高物質(zhì)的釋放，同時在有效的保持有效成分活性的同時又減少像蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的析出，影響實驗的結(jié)果，所以超聲波法提取多糖是一種不錯的方法。參考文獻1 孟江，周毅生，廖華為.超聲波提取魚腥草多糖工藝研究.廣東藥學院中藥學院，2008，19（1）：17-182張倩，江萍，秦禮康，等.魚腥草水溶性多糖的提取及鑒定.食品科學，2000，21（3）：49-503羅馨，趙衛(wèi)星，溫普紅.正交超聲法提取魚腥草多糖工藝研究.化學工程師，2012,09:10-154楊立紅，林劍，黃清榮，等.阿魏菇深層發(fā)酵菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化研究.工業(yè)