transwell原理和技術(shù)

1、Tran swell實驗原理與操作步驟Trans-這個詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運、穿過等意思，well有小室的意思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置，根據(jù)Corni ng公司的Tran swell說明書中的介紹，可以認(rèn)為這是一種膜濾器(Membrane filters )，也可認(rèn)為是一種 有通透性的支架(permeable supports )。更準(zhǔn)確地說，Tran swell應(yīng)該是一種 實驗技術(shù)，這項技術(shù)的主要材料是 Tran swell小室(Tran swellchamber，Tran swellin sert )，其外形為一個可放置在孔板里的小杯子，不同廠家對Tran swell會有

2、不同的命名，而不同型號也可有不同形狀，不同大小，根據(jù)實驗 需要，可有不同選擇。但無論是何種外形，其關(guān)鍵部分都是一致的，那就是杯子 底層的一有通透性的膜，而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1 - 12.0卩m根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的 是聚碳酸酯膜(polycarb on atemembra ne。將Tran swell小室放入培養(yǎng)板中，小室稱上室，培養(yǎng)板稱下室，上室盛裝上層培 養(yǎng)液，下室盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。 我們將細(xì)胞種在 上室，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室的細(xì)胞， 從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成

3、分對細(xì)胞生長、運動等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、 細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。當(dāng)然不同細(xì)胞其體積不同，具體選擇時 要考慮到細(xì)胞大小。這里主要談幾種大家常用的實驗：(1。共培養(yǎng)體系：小于3.0um孔徑條件下，細(xì)胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細(xì)胞運動能力， 不需要細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇 3.0卩m以下孔徑。常用0.4、3.0卩m 我們實驗室用的是0.4卩m將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì) 胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細(xì)胞 A的影響。(2。趨化性實驗：可用5.0、8.0、12.0卩m膜，上室細(xì)胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數(shù)進

4、入下 室的細(xì)胞量可反映下室成分對上室細(xì)胞的趨化能力。細(xì)胞B對細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究 細(xì)胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細(xì)胞 A的趨化作用。趨化因子對細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研 究該趨化因子對細(xì)胞的趨化作用。(3) 腫瘤細(xì)胞遷移實驗：常用8.0、12.0卩m膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子， 腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷 移能力。(4) 腫瘤細(xì)胞侵襲實驗常用8.0、12.0卩m膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實驗類 似。tran swell侵襲實驗，其實原理簡單地說就是用一層膜將高

5、營養(yǎng)的培養(yǎng)液 和低營養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開，細(xì)胞放在低營養(yǎng)的培養(yǎng)液里，為了找吃的，細(xì)胞會往高 營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面跑，但是有膜擋著，所以要穿過膜才行。我們在膜上涂上一層 基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，于是細(xì)胞要把基質(zhì)消化了才可以從低營養(yǎng)的培養(yǎng)液跑 到高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里面，最后我們檢測高營養(yǎng)的培養(yǎng)液里細(xì)胞量就可以知道細(xì)胞 的侵襲能力了，大概原理就是這樣的。第一節(jié)概念這里想明確兩個概念，一個是 Tran swell，另一個是腫瘤細(xì)胞侵襲模型。I.Tra nswell關(guān)于Tran swell這個詞該如何解釋，查了很多資料也未見準(zhǔn)確的注解， 我覺得可 以這么理解吧，trans-這個詞根有轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)運、穿過等意思， well

6、有小室的意 思，可以從字面上理解，這是一類有通透性的杯狀的裝置， 根據(jù)Corning公司的 Tran swell說明書中的介紹，可以認(rèn)為這是一種膜濾器( Membra ne filters )， 也可認(rèn)為是一種有通透性的支架(permeable supports )。準(zhǔn)確地說，Tran swell應(yīng)該是一種實驗技術(shù)，這項技術(shù)的主要材料是 Tran swell 小室(Tran swell chamber，Tran swell in sert )，其外形為一個可放置在孔板 里的小杯子，不同廠家對Tran swell會有不同的命名，而不同型號也可有不同形 狀，不同大小，根據(jù)實驗需要，可有不 同選擇.

7、但無論是何種外形，其關(guān)鍵部分都是一致的，那就是杯子底層的一有通透性的膜， 而杯子其余部分的材料與普通的孔板是一樣。這層膜帶有微孔，孔徑大小有0.1-12.0卩m根據(jù)不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarb on atemembra ne .下圖是一個Transwell裝買的縱切面將Tran swell小室放入培養(yǎng)板中，小室稱上室，培養(yǎng)板稱下室，上室盛裝上層培 養(yǎng)液，下室盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細(xì)胞種在上室，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響 到上室的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運動等的影 響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)

8、過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨 化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。下面參考guxuefeng戰(zhàn)友和cosmosci戰(zhàn)友的帖子具體來談?wù)効讖降倪x擇，當(dāng)然 不同細(xì)胞其體積不同，具體選擇時要考慮到細(xì)胞大小。這里主要談幾種大家常用 的實驗： （1）共培養(yǎng)體系：小于3.0um孔徑條件下，細(xì)胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細(xì)胞運動能力,不需要細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇3.0卩m以下孔徑。常用0.4、3.0卩 我們實驗室用的是0.4卩m。次ifeA將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細(xì) 胞A的影響。(2) 趨化性實驗可用5.0、8.0、12.0卩m

9、膜，上室細(xì)胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數(shù)進入下 室的細(xì)胞量可反映下室成分對上室細(xì)胞的趨化能力。胞B對細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究 細(xì)胞B分泌或代產(chǎn)生的物質(zhì)對細(xì)胞 A的趨化作用。趨化因子對細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可 研究該趨化因子對細(xì)胞的趨化作用。(3) 腫瘤細(xì)胞遷移實驗常用8.0、12.0卩m膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入 FBS或某些特定的趨 化因子，腫瘤細(xì)胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑， 計數(shù)進入下室的細(xì)胞量可反 映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。(4) 腫瘤細(xì)胞侵襲實驗常用8.0、12.0卩m膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實驗類 似。上室種腫瘤細(xì)胞，下

10、室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會向營 養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細(xì)胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè) 鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞欲進入下室，先要分泌基 質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進入下 室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。2.腫瘤細(xì)胞侵襲模型用于研究腫瘤細(xì)胞侵襲能力的腫瘤細(xì)胞侵襲模型有如下幾種（引自司徒鎮(zhèn)強細(xì)胞培養(yǎng)）：2.1 體癌細(xì)胞侵襲模型2.1.1皮下移植侵襲模型2.1.2 肌肉移植侵襲模型2.1.3腹腔移植侵襲模型2.1.4 小鼠腎包膜下移植侵襲模型 2.1.5鼠睪丸包膜下移植侵襲模型2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵襲模型2.

11、1.7 鼠爪墊皮下移植侵襲模型 2.1.8 視網(wǎng)界膜侵襲模型 2.2 體外 癌細(xì)胞侵襲模型2.2.1 體外靜止器官培養(yǎng)法2.2.1.1 半固體培養(yǎng)基單細(xì)胞器官培養(yǎng)法2.2.1.2液體培養(yǎng)基單細(xì)胞器官培養(yǎng)法 2.2.2半體外半體器官培養(yǎng)法。2.2.3 單層細(xì)胞器官培養(yǎng)法 2.2.4 瘤細(xì)胞球體器官培養(yǎng)法 2.2.4.1 靜止 球體器官培養(yǎng)法2.2.4.2旋轉(zhuǎn)搖動球體器官培養(yǎng)法2.2.5單層細(xì)胞侵襲實驗?zāi)Ｐ?2.2.6Tran swell侵襲小室測定法可見，Tran swell與侵襲實驗之間并不能劃等號，Tran swell有多種應(yīng)用，侵襲 實驗也有多種方法。所謂Tran swell侵襲實驗，其實

12、是指將Tran swell這一技術(shù) 應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞侵襲研究的一種實驗。由于其簡單易行、重復(fù)性好，因而得到了 越來越廣泛的應(yīng)用，但不能認(rèn)為研究腫瘤侵襲只有Tran swell 一種方法。第二節(jié) Tran swell侵襲實驗我的課題涉及Tran swell侵襲實驗和Tran swell遷移實驗，其他方面的Tran swell應(yīng)用我不太清楚，因此這里主要談?wù)?Tran swell侵襲實驗。1.實驗用品：I f InJ Transwell 小室：多種廠家可提供，論壇里常用的是 Costar、Corning、BD生產(chǎn)的小室，我們實驗 室用的是 Chemicon公司的 ECM55系列，另有 Boyden

13、chamber、Millipore 公 司的 millicell 和雕弓滿月射天狼戰(zhàn)友介紹的 Thincert 。這些廠家提供的小室， 有的已鋪好基質(zhì)膠， 買來就可以用， 很方便，但也比較貴， 我們實驗室用的Chemicon公司的ECM55系列是已經(jīng)鋪好膠的，質(zhì)量很好，但是 非常貴，24孔板配套的小室，每個價格約130元，不推薦給大家。BD也有已包 被好的，價格不清楚。 Coster 和 Corning 公司生產(chǎn)的小室，是論壇里比較常用 的，好像是要自己鋪膠，但據(jù)說每個小室成本只有 40左右，應(yīng)該比較適合中國 國情。下面是一些戰(zhàn)友提供的價格，具體建議大家聯(lián)系代理商咨詢。 linanping19

14、79 戰(zhàn) 友提供的價格：coster的24孔板的transwell的價格是456元RMB& m用于 腫瘤的侵襲實驗。iceyxy戰(zhàn)友提供的價格：Millipore 的8卩m的50個 1760RMB,0.4卩m的2000多,是一次性的。梅林戰(zhàn)友提供的 BD價格：240RMB一塊(6.5um,24 孔,12instert )，好像是沒膠的。liguofan 說國產(chǎn)的 boyden30 塊一個。 jjyy 提供的價格是： corning cat No.3422.下層常用含5滄10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細(xì)胞侵襲力而定，侵襲力弱 的細(xì)胞可適當(dāng)提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將

15、纖維粘連蛋白加入 下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認(rèn)為，F(xiàn)BS仍是最合適的。 細(xì)胞培養(yǎng)板：常用于 Transwell 侵襲實驗的細(xì)胞培養(yǎng)板有 6孔板、 12孔板、 24孔板等，以 24 孔最常用。細(xì)胞培養(yǎng)板沒什么特殊要求，普通的細(xì)胞培養(yǎng)板就可以。但要注意， 細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的 Transwell 小室相配套。此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白（fibronectin, FN, Sigma有售）,這樣做的目的是使穿過膜的細(xì)胞更好地附著在膜上，也可用膠原 （collagen ）或明膠（gelatin ）。很多戰(zhàn)友認(rèn)為這不是必須的，而且我也是不涂的，細(xì)胞照樣貼 壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。

16、 linanping1979 戰(zhàn)友認(rèn)為，如果培養(yǎng)時 間很長（24h）,細(xì)胞還是會掉到下室里面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層涂上FN 另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。2步驟2.1 Transwell 小室制備2.1.1 無基質(zhì)膠 Transwell 小室制備 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀釋液包被Tran swell小室底部膜的上室面，4°C風(fēng)干。 如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉，吸取FN均勻涂抹在 小室的下面。用膠原（ collagen ）的話，一般配成 0.5mg/ml ，直接用槍吸了涂 在膜上。 水化基底

17、膜：吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入 50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37C, 30min。另有 tianjin_glioma 戰(zhàn)友提供的方法： 在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel （3.9ug/ul）60-80卩l(xiāng) （注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好），置37C 30min使Matrigel聚合成凝膠。2.1.2 有基質(zhì)膠的 Transwell 小室制備Chemicon公司的ECM55系列說明書要求，將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入300卩l(xiāng)預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置15-30min,使基質(zhì)膠再水化。再吸去 剩余培養(yǎng)液。 2.2 制備細(xì)胞懸液 制備細(xì)胞懸液

18、前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12-24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。 消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗 1-2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至 1 10X105,個人認(rèn)為不要超過5X 105。具體實驗時采用密度要自己摸索， 因為不同細(xì)胞， 其侵襲能力是不同的。 個人經(jīng) 驗，細(xì)胞量過多， 穿過膜的細(xì)胞會過多過快， 如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將 難以計數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細(xì)胞都已穿過，因此 最少也要保證在收樣的時候，上室還要有一定量的細(xì)胞存在。個人認(rèn)為， 對照組和處理盡量不要分開計數(shù)， 因為細(xì)胞數(shù)目的差異會嚴(yán)重影響實 驗結(jié)果。如

19、果需要對細(xì)胞預(yù)處理而不得不分開計數(shù)， 那么計數(shù)一定要多重復(fù)幾次， 力求準(zhǔn)確，盡量保證對照組和處理組細(xì)胞密度一致。 2.3 接種細(xì)胞 取細(xì)胞懸液100-200卩l(xiāng)加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的 Transwell 小室對細(xì)胞懸液量有不同要求，請參考說明書。 24 孔板小室一般 200 卩 I。 24孔板下室一般加入500卩l(xiāng)含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加 的量有不同要求， 具體請參考說明書。 這里要特別注意的是， 下層培養(yǎng)液和小室 間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了， 在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡

20、，再將小室 放進培養(yǎng)板。 培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12-48h （主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。時間點的選 擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外， 處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。 以我的課題為例， 我使用的藥物不僅會抑制腫瘤細(xì)胞侵襲力， 還對細(xì)胞增殖有明 顯抑制。我選擇的藥物濃度是用 MTT篩選出的72h的IC50。用這個濃度處理細(xì) 胞，24h對細(xì)胞增殖并無明顯抑制，但 24h后，抑制作用就開始出現(xiàn)了。所以， 用這個濃度來做Tran swell，處理時間也必須限定在24h，否則一旦藥物抑制了 細(xì)胞增殖或者誘導(dǎo)出凋亡， 使處理組細(xì)胞數(shù)目少于對照組， 那么就難以肯定穿過 膜的細(xì)胞比對照組少， 究竟是由于侵

21、襲被抑制引起， 還是處理后細(xì)胞數(shù)目本身就 比對照組少而引起的了。時間過長不可以，同樣，過短也不行，因為細(xì)胞會有一定量的 MMP儲存，短時 間可能侵襲能力不會有太大改變。 同時從藥物被吸收進去， 進而發(fā)揮作用， 影響 MMP表達，到最后釋放到培養(yǎng)基中，還需要一個過程。時間點的選擇可盡量長 點，也可選擇多個時間點研究時間依賴效應(yīng)， 但前提是這個時間圍細(xì)胞數(shù)目不能 有明顯變化。另外，我看到細(xì)胞在小室的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)， 而是圓形的， 仍是懸 浮時的形態(tài)，不過會聚集成團，所以看到細(xì)胞不正常貼壁也不要緊， 是正常現(xiàn)象 在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正常現(xiàn)象，可不予處理，但 我遇

22、到過培養(yǎng)一段時間后， 膜下出現(xiàn)了大氣泡， 幸虧及時發(fā)現(xiàn)， 否則后果將非常 嚴(yán)重。因此，個人建議，最好接種細(xì)胞后 12h 把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看， 確信沒有大氣泡產(chǎn)生。2.4 結(jié)果統(tǒng)計檢測穿過的細(xì)胞數(shù)有兩種方法：2.4.1 直接計數(shù)法2.4.1.1 “貼壁”細(xì)胞計數(shù)這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過膜后， 可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室 里面去。如下圖： 通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計數(shù)細(xì)胞 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室的細(xì)胞 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺靡藍染色、 Giemsa 染色、木精染 色、伊紅染色等。個人推薦采用 0.1%結(jié)晶紫染色，這種方法有如下優(yōu)勢： (1). 不需要固定細(xì)胞，

23、 直接染色即可。 (2). 配制簡單方便。 (3). 染色后可以用 33%醋酸脫色，將結(jié) 晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上 570nm測其0D值，間接反映細(xì)胞數(shù)。 個人認(rèn)為這是結(jié)晶紫染色最大的優(yōu)勢所在。 因為，雖然經(jīng)過準(zhǔn)確的細(xì)胞計數(shù)， 往 往穿過膜的細(xì)胞數(shù)仍難以準(zhǔn)確控制， 可能某一批實驗穿過的細(xì)胞會特別多， 以致 細(xì)胞成堆， 這種情況下就難以計數(shù)了， 這種情況下就可以用醋酸脫色后用酶標(biāo)儀 檢測。使用結(jié)晶紫染色要注意，染色前要將膜風(fēng)干，否則可能會染不上。 細(xì)胞計數(shù)：我們使用的是Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照，把 Transwell 小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下

24、室側(cè)附著的細(xì)胞。 也有 不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就 可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。取若干個視野計數(shù)細(xì)胞個數(shù)。論壇里一般采用3- 5個視野，也有人用10個，都 是隨機選取，個人認(rèn)為這樣選擇的視野帶有很大的偶然性，也會摻進人為影響， 特別是計數(shù)視野較少的時候。我選取 16個視野，不是隨機選擇，而是有固定的 位置。我們使用的顯微鏡所看到的視野的直徑剛好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直徑的1/4。如圖，藍色部分表示膜的大小，白色圓形表示視野的大小，綠色方形則表示拍照 時所能拍下的視野的中心部分。這樣，每個小

25、室都拍攝如下圖的 16個視野進行 計數(shù)，這樣得到結(jié)果是比較客觀和準(zhǔn)確的。241.2 “非貼壁”細(xì)胞計數(shù)由于某些細(xì)胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時細(xì)胞在穿過膜后不能附著在膜 上，而是掉進下室。如下圖：IB1242間接計數(shù)法間接計數(shù)法主要用于穿過細(xì)胞過多，而無法通過計數(shù)獲得準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)所采用的 方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。 2.4.2.1MTT法用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室的細(xì)胞 24孔板中加入500卩l(xiāng)含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中， 使膜浸沒在培 養(yǎng)基 中，37C 4h后取出。 24孔板中加入500卩1 DMSO將小室置于其中，使膜浸沒在DMS中，振蕩10min 使

26、甲湃充分溶解。取出小室,24孔板于酶標(biāo)儀上測OD值。242.2 熒光試劑檢測 這類方法一般是與Tran swell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染 料染細(xì)胞,再將細(xì)胞裂解，檢測熒光值。Chemicon勺ECM55即屬于這類。2.4.2.3 結(jié) 晶紫檢測上文已說過，這里不再贅述，原理與VITTt也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個優(yōu)點，就 是染色和脫色的過程并不影響膜上細(xì)胞，在脫色后還可重新染色。 這是用正置顯微 鏡拍攝的圖，結(jié)晶紫染色，進行細(xì)胞計數(shù)。第三節(jié)Tran swell的其他應(yīng)用的實驗步驟1. Tran swell腫瘤細(xì)胞遷移實驗過程與Tran swell侵襲實驗基本一致，

27、不同的只是不需要鋪Matrigel。個人認(rèn)為，由于 沒有基質(zhì)膠的阻擋，細(xì)胞穿過膜的速度較侵襲實驗明顯加快，所以細(xì)胞量要更大。我做 侵襲實驗的細(xì)胞密度是1X105,而遷移實驗的密度是1X106。另外，下層培養(yǎng)液的FBS 濃度也可適當(dāng)下調(diào)，我做侵襲實驗的濃度是5%遷移實驗的濃度是2.5% 2. cathywxy 戰(zhàn)友的Tran swell上皮細(xì)胞培養(yǎng)步驟做了一段時間的原代細(xì)胞培養(yǎng)，把經(jīng)驗?zāi)贸鰜砀蠹曳窒硪幌掳桑堄嘘P(guān)戰(zhàn)友共同探 討：(1)將雄性wistar大鼠麻醉，開胸，將氣管取出，置于4C含0.1 %胰蛋白酶XIV (Sigma), 100 U/ml 青霉素和 100ug/ml鏈霉素(Gibco-BRL、無 Ca 2+、Mg2H 無血清的MEM(2) 用無菌的細(xì)胞刮棒刮氣管壁，將所得溶液離心后得到游離細(xì)胞。 離心后立即用新鮮的上述MEI溶液(含10%胎牛血清)清洗3次,以中和胰蛋白酶, 再用含5%胎牛血清、 100U/ml 青霉素和100 ug/ml 鏈霉素的LHC-8 medium (Biofluids) 沖洗一次。(4) 沖洗過后，將得到的細(xì)胞懸液用臺盼蘭測定活力，若存活率大于90%，則將細(xì)胞以106/cm2密度接種于可通透的多聚碳濾