應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)survivin基因表達(dá)以增強(qiáng)SGC7901胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性

1、應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)survivin基因表達(dá)以增強(qiáng)SGC7901胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性【摘要】 目的 利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)survivin基因的表達(dá)，檢測SGC7901胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后對(duì)順鉑敏感性的變化。方法 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control組)、單用順鉑組(CDDP組)、脂質(zhì)體組(Lip組)、單用survivin siRNA組(siRNA組)、轉(zhuǎn)染survivin siRNA(轉(zhuǎn)染組)及轉(zhuǎn)染survivin siRNA聯(lián)合順鉑作用組(聯(lián)合作用組)。人工合成survivin siRNA，通過Lip包裹將siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

2、MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率，Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測survivin蛋白的表達(dá)，Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變。結(jié)果 Hoechst染色熒光顯微鏡下control組、Lip組及siRNA組細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色,而CDDP組、轉(zhuǎn)染組及聯(lián)合作用組細(xì)胞核染色增強(qiáng)、核質(zhì)濃縮、核碎裂,呈凋亡改變;聯(lián)合作用組細(xì)胞增殖抑制率(63.93±4.22)%明顯高于其余各組(P<0.05);轉(zhuǎn)染組及聯(lián)合作用組survivin蛋白表達(dá)明顯低于其他各組(P<0.05)。結(jié)論 應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)SGC7901胃癌細(xì)胞中survivin基因的表達(dá)，

3、能夠增加其對(duì)順鉑的藥物敏感性。 【關(guān)鍵詞】 survivin;siRNA;胃癌;順鉑Abstract:Objective To detect the variations in cisplatin sensitivity of human gastric carcinoma cell line SGC7901 before and after transfection to specifically downregulate the expression of surviving gene with small interfering RNA (siRNA) technology.Method

4、s This experiment is divided into the control group, cisplatin group (CDDP group), lipsome group (lip group), siRNA group, transfection group and siRNA combined CDDP group (combined group). Survivin siRNA was artificially synthesized and then transfected into gastric cancer cells with liposome. The

5、transfection effects were determined by fluorescence microscopy. The inhibitory rate of cell proliferation was assayed by MTT, and the expression of survivin protein was determined by Western blot and immunocytochemical staining. The morphological changes of the apoptotic cells were observed by Hoec

6、hst staining.Results As observed under the fluorescence microscope after Hoechst staining, the nuclei presented as normal blue in the control group, lip group and siRNA group, while CDDP group, siRNA transfection group and siRNA combined cisplatin group had such changes as reinforced nuclear stainin

7、g, karyopyknosis and karyorrhexis with apoptotic changes. The inhibition rate of cell proliferation in siRNA combined cisplatin group (63.93±4.22)% was markedly higher than the other groups (P<0.05). Compared with other groups, the expression of survivin protein in the transfection group

8、 and siRNA combined cisplatin group was significantly reduced, and the differences had statistical significance (P<0.05).Conclusion The application of siRNA technology to downregulate the survivin gene expression of human gastric carcinoma cell line SGC7901 is able to enhance its drug sensiti

9、vity to cisplatin.Key words： survivin; siRNA; gastric carcinoma; cisplatin順鉑是目前臨床上最常用的化療藥物之一,其抗腫瘤作用明顯、價(jià)格低廉，并且可應(yīng)用于多種腫瘤的化療,但是長期應(yīng)用后極易出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，降低其療效,并且隨著劑量的增加，出現(xiàn)的副作用越來越多。有研究表明,長期應(yīng)用順鉑后，某些腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象并且可檢測到存活素(survivin)的高表達(dá)1。survivin是近年新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，具有強(qiáng)大的抗凋亡功能，屬于凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins， IAP)家族成

10、員之一。survivin與胃癌的定量研究表明，其表達(dá)量與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。分化程度越低的胃癌組織中survivin表達(dá)率越高，患者預(yù)后越差2。因此，本實(shí)驗(yàn)通過將人工合成的survivin 小干擾RNA(siRNA)經(jīng)脂質(zhì)體(liposome,Lip)包裹后轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901，探討特異性地降低胃癌細(xì)胞SGC7901中survivin的表達(dá)能否增強(qiáng)該細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性，從而為胃癌的化療開辟一條新途徑。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 主要試劑 RPMI 1640購自美國GIBCO公司;胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品;LipfectamineTM 2000試劑盒及OPTIM

11、EN轉(zhuǎn)染液為Invitrogen公司產(chǎn)品，兔抗人survivin多克隆抗體購于Santa Cruz公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自Sigma公司，順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)公司，稀釋于RPMI 1640培養(yǎng)液中，終濃度為1 mg/L。1.1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC7901，由徐州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室保存。1.2 方法1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control組)、單用順鉑組(CDDP組)、Lip組、單用survivin siRNA組(siRNA組)、轉(zhuǎn)染survivin siRNA(轉(zhuǎn)染組)及轉(zhuǎn)染survivin siRNA聯(lián)合順鉑作用組(聯(lián)合作用組)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔

12、。各組作用SGC7901細(xì)胞72 h后進(jìn)行相應(yīng)后續(xù)試驗(yàn)。人胃癌細(xì)胞SGC7901常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合約40%70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Optimem分別稀釋脂質(zhì)體和survivin siRNA至試驗(yàn)所需濃度并輕輕混勻，5 min后將survivin siRNA稀釋液與Lip稀釋液混勻，并在室溫下放置30 min使之充分結(jié)合，加入細(xì)胞中，輕輕搖晃。37 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，46 h后吸出，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后即可用于后續(xù)試驗(yàn)。1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率 實(shí)驗(yàn)分組同前，各組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接

13、種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后，根據(jù)分組加入所需試劑及藥物。72 h后，每孔加入20 l的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加150 l的二甲基亞砜(DMSO)室溫振蕩10 min后570 nm波長處測定光密度值(D570)。細(xì)胞抑制率(%)=(1-D570處理組/D570對(duì)照組)×100%。1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測survivin蛋白的表達(dá) 棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)SP9001試劑盒說明書進(jìn)行操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。survivin以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。1.2.4 Western blot法檢測survivin蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)

14、胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2遍，加入細(xì)胞裂解液，冰浴30 min進(jìn)行充分裂解。4低溫離心機(jī)13 000 r/min離心5 min，取上清，F(xiàn)orlin酚法測蛋白濃度。100 g/孔上樣，進(jìn)行12.5% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠和5%的積層膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入一抗兔抗人survivin及-actin多克隆抗體，4孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG孵育2 h，四唑硝基藍(lán)(NBT)/ 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)顯色。一抗及二抗?jié)舛染鶠?1 000，用圖像分析系統(tǒng)測定各條帶的灰度值，并用Image J圖像分析軟件分析。以-actin為內(nèi)參，表示survivin蛋白

15、的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。1.2.5 Hoechst33258檢測細(xì)胞凋亡形態(tài) Hoechst33258染色：棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)說明書進(jìn)行染色。熒光顯微鏡下觀察拍照。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)用Pearson相關(guān)分析。P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。2 結(jié) 果2.1 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 轉(zhuǎn)染6 h后，出現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞碎片增多。見圖1。2.2 轉(zhuǎn)染survivin siRNA后胃癌細(xì)胞SGC7901對(duì)順鉑敏感性的影響 MT

16、T法檢測發(fā)現(xiàn)CDDP組、轉(zhuǎn)染組及聯(lián)合作用組對(duì)SGC7901細(xì)胞的增殖有較明顯的抑制作用。其中聯(lián)合作用組的細(xì)胞增殖抑制率最高，與其余各組相比差異有顯著性(P<0.05)。見表1。圖1 綠色熒光蛋白FITC標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞(×400)2.3 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)水平的改變2.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果 與control組、lip組、siRNA組和CDDP組相比,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。表1 Survivin siRNA對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用表2 各組SGC7

17、901細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)與其余各組比較：#、*P<0.05;與CDDP組比較：P<0.052.3.2 Western blot法檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染組survivin蛋白的表達(dá)明顯低于其余各組(P<0.05);CDDP組作用細(xì)胞72 h后，survivin蛋白的表達(dá)明顯高于其余各組(P<0.05)。見表3。2.4 轉(zhuǎn)染前后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Honchest33258染色顯示control組、Lip組和siRNA組細(xì)胞的細(xì)胞核完整，呈正常的藍(lán)色;CDDP組、轉(zhuǎn)染組及聯(lián)合作用組細(xì)胞的細(xì)胞核染色增強(qiáng)、核質(zhì)濃縮、核碎裂，呈凋亡改變。表3 各

18、組SGC7901細(xì)胞中survivin蛋白的D值與其余各組比較：#P<0.05;與CDDP組比較：*P<0.053 討 論胃癌是常見的消化道惡性腫瘤,世界胃癌發(fā)病率為13.86/10萬,僅次于肺癌居惡性腫瘤的第2位。在我國胃癌的發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤之首,每年死于胃癌者達(dá)16萬人,占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的23%。由于胃癌早期診斷率較低，而進(jìn)展期胃癌單純根治手術(shù)年生存率僅40%，即使擴(kuò)大切除范圍的超根治術(shù)也未明顯提高生存率，因此，目前臨床上化療對(duì)于胃癌的治療具有重要意義。順鉑由于其抗腫瘤作用明顯、價(jià)格低廉，并且可應(yīng)用于多種腫瘤的化療，是目前臨床最常用的化療藥物之一

19、，在腫瘤的治療中占有重要地位。但是長期運(yùn)用順鉑會(huì)造成機(jī)體對(duì)其敏感性降低，從而嚴(yán)重影響了化療效果，并且降低了患者的生存率。survivin直接作用于caspase，主要通過抑制凋亡終末效應(yīng)器caspase-3和caspase-7或干擾caspase-9的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的共同通路。而順鉑也是通過caspase-3依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而達(dá)到抗腫瘤的效果3。并且有研究顯示，在耐順鉑的人胃癌細(xì)胞中，survivin表達(dá)明顯高于普通人的胃癌細(xì)胞4。因此，我們認(rèn)為降低腫瘤細(xì)胞中survivin的表達(dá)可能能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的藥物敏感性。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾(R

20、NA interference， RNAi)技術(shù)特異性的降低survivin在SGC7901中的表達(dá)。RNAi技術(shù)是利用雙鏈RNA(dsRNA)能夠特異性地降解具有同源序列的mRNA，特異性地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，從而成為近年來較為熱門的一種研究基因功能和進(jìn)行基因治療的新方法5。RNAi在胞質(zhì)dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(Dicer)的作用下裂解成為具有2123nt堿基的短片段dsRNA分子，稱之為siRNA，siRNA與核酶復(fù)合體結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC),RISC通過堿基配對(duì)方式與同源靶向mRNA結(jié)合后，從siRNA的3端將靶mRNA切割成小于12nt的片段并使其降解，從而阻斷

21、相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制6。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，RNAi技術(shù)具有特異、高效和毒性小的特點(diǎn)，有著明顯的優(yōu)勢。本研究采用脂質(zhì)體包裹survivin siRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞6 h后，熒光顯微鏡下可以看見綠色熒光，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，并且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)明顯降低。聯(lián)合作用組Honchest染色可見SGC7901細(xì)胞核染色增強(qiáng)、核質(zhì)濃縮、核碎裂，呈凋亡改變的細(xì)胞明顯多于CDDP組。而轉(zhuǎn)染后順鉑對(duì)SGC7901的細(xì)胞增殖抑制率從轉(zhuǎn)染前的(42.97±2.73)%提高到(63.93±4.22)%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過RNAi技術(shù)特異性地下調(diào)胃癌SGC7901細(xì)胞中survivin的表達(dá)，能夠明顯增加SGC7901對(duì)順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，從而為臨床治療胃癌提供了一個(gè)新的思路。【參考文獻(xiàn)】 1 Zaffaroni N, Daidone MG. Survivin expression and resistance to anticancer treatment: perspectives for new therapeutic interventions J. Drug Resist Updat, 2002, 5(2):65-72.2 張宏,韓大正,徐麗. Survivin蛋白在胃癌中的表達(dá)及臨床意義 J.