實驗12小麥成熟胚愈傷組織誘導

1、 實驗目的實驗目的 實驗原理實驗原理 實驗材料與藥品實驗材料與藥品 實驗方法實驗方法 注意事項注意事項 實驗作業(yè)實驗作業(yè) 掌握無菌操作技術(shù)，了解組織培養(yǎng)的一般掌握無菌操作技術(shù)，了解組織培養(yǎng)的一般程序，將小麥成熟胚培養(yǎng)成愈傷組織。程序，將小麥成熟胚培養(yǎng)成愈傷組織。 指通過無菌操作分離植物體的一部分（外植體explant），接種到培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下（包括營養(yǎng)、激素、溫度、光照、濕度）進行培養(yǎng)，使其產(chǎn)生完整植株的過程。實驗原理實驗原理植物細胞全能性：植物細胞全能性： 任何具有完整細胞核的植物細任何具有完整細胞核的植物細胞，都擁有形成一個完整植株所必須胞，都擁有形成一個完整植株所必須的全部遺

2、傳信息和發(fā)育成完整植株的的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。能力。 外植體外植體：從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的從植物體上分離下來的用于離體培養(yǎng)的那部分材料。那部分材料。 愈傷組織愈傷組織：原指植物在受傷之后于傷口表面形成：原指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團薄壁細胞，在組培中則指在離體培養(yǎng)過程的一團薄壁細胞，在組培中則指在離體培養(yǎng)過程中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則薄壁細胞，中形成的具有分生能力的一團不規(guī)則薄壁細胞，多在植物體切面上產(chǎn)生。多在植物體切面上產(chǎn)生。 脫分化脫分化：已分化好的組織細胞在人工誘導條件下，：已分化好的組織細胞在人工誘導條件下，恢復分生能力，回復到分生組織狀態(tài)的過

3、程?；蚧謴头稚芰?，回復到分生組織狀態(tài)的過程?；蛘哒f是由高度分化的植物組織或器官產(chǎn)生愈傷組者說是由高度分化的植物組織或器官產(chǎn)生愈傷組織的過程?？椀倪^程。 再分化再分化：脫分化后具有分生能力的細胞再經(jīng)過與：脫分化后具有分生能力的細胞再經(jīng)過與原來相同的分化過程，重新形成各類組織和器官原來相同的分化過程，重新形成各類組織和器官的過程。或者說是由愈傷組織再生出小植株的過的過程?；蛘哒f是由愈傷組織再生出小植株的過程。程。 植物體的任何一個細胞都具有全能性植物體的任何一個細胞都具有全能性。分。分化了的植物根、莖、葉等組織器官化了的植物根、莖、葉等組織器官在一定在一定的條件下進行離體培養(yǎng)，給于一定的營養(yǎng)的條

4、件下進行離體培養(yǎng)，給于一定的營養(yǎng)和激素，可以和激素，可以脫分化脫分化為為愈傷組織愈傷組織。愈傷組。愈傷組織在不同的營養(yǎng)和激素的作用下，又可以織在不同的營養(yǎng)和激素的作用下，又可以再生再生出完整的小植株出完整的小植株。植物的。植物的脫分化脫分化和和再再分化分化培養(yǎng)，證明分化了的植物細胞仍具有培養(yǎng)，證明分化了的植物細胞仍具有形成完整植株所需要的形成完整植株所需要的全套基因全套基因。 快速繁殖快速繁殖 一株葡萄一年繁殖到一株葡萄一年繁殖到3萬多株，一株蘭花一年繁殖到萬多株，一株蘭花一年繁殖到500萬株左右。萬株左右。 種苗脫毒種苗脫毒 通過組織培養(yǎng)可以培育出大量的無毒種苗。已取得成通過組織培養(yǎng)可以培育

5、出大量的無毒種苗。已取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等等。功的有馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 遠緣雜交遠緣雜交 利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠緣雜交取得成功，利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。比如遼寧果樹研究所利用這種方從而育成一些罕見的新物種。比如遼寧果樹研究所利用這種方法獲得蘋果與梨的雜交種。法獲得蘋果與梨的雜交種。 突變育種突變育種 組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴組織培養(yǎng)可以直接誘變和篩選出具抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。中國林科院獲得了耐鹽的楊氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。中國林科院獲得了耐鹽的楊樹株系。樹株系

6、。 基因工程基因工程 基因工程主要研究基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導，而基因轉(zhuǎn)導后必須通的轉(zhuǎn)導，而基因轉(zhuǎn)導后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株再生。過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株再生。 生物制品生物制品 如抗癌首選藥物如抗癌首選藥物-紫杉醇等。近年國內(nèi)在紅豆杉組織紫杉醇等。近年國內(nèi)在紅豆杉組織培養(yǎng)中獲得生長量很高的細胞系，每升細胞培養(yǎng)物中紫杉醇的培養(yǎng)中獲得生長量很高的細胞系，每升細胞培養(yǎng)物中紫杉醇的產(chǎn)量可達產(chǎn)量可達0.25mg。 愈傷組織愈傷組織利用外植體能培養(yǎng)出完整植株 從高等植物的幼胚、根、莖、葉、花和果實等不同器官的組織中分離的單個細胞，經(jīng)過特殊培養(yǎng)形成愈傷組織，并可進一步誘導生成完整的植株。完

7、全在于高等植物細胞具有全能性蝴蝶蘭蝴蝶蘭紅豆杉紅豆杉培養(yǎng)條件可以人為控制培養(yǎng)條件可以人為控制 擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進行周響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。年培養(yǎng)生產(chǎn)。 生長周期短，繁殖率高生長周期短，繁殖率高 往往往往20-30d為一個周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一為一個周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，定設(shè)備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且

8、能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或故總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。脫病毒種苗。 管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動化控制 植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件，既利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。 培養(yǎng)基：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。培養(yǎng)基：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。 沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組沒有一種培養(yǎng)基能夠適

9、合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。成功。 培養(yǎng)基的種類：培養(yǎng)基的種類：MS, B5, N6, White, KM-8P等。等。 無機營養(yǎng)無機營養(yǎng)： 大量元素大量元素：N、P、K、S、Ca、Mg 微量元素微量元素：Fe、Mn、Cu、Co、Mu、B等等 有機營養(yǎng)有機營養(yǎng)： 碳源碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖：蔗糖、葡萄糖、果糖 氮源氮源：氨基酸類：氨基酸類 活性物質(zhì)活性物質(zhì)：維生素、肌醇等：維生素、肌醇等 植物激素植物激素： 生長素類生長素類：2,4-D 、IAA

10、、NAA、IBA等等 細胞分裂素類細胞分裂素類：6-BA 、激動素、玉米素等、激動素、玉米素等 其它類其它類：赤霉素、脫落酸、乙烯：赤霉素、脫落酸、乙烯 支持物支持物： 瓊脂等瓊脂等 生長素與細胞分裂素的比例生長素與細胞分裂素的比例決定著外植體的發(fā)育方?jīng)Q定著外植體的發(fā)育方向，是形成愈傷組織、長根還是長芽。向，是形成愈傷組織、長根還是長芽。大量實驗結(jié)果表明，大多數(shù)植物組織或器官的大量實驗結(jié)果表明，大多數(shù)植物組織或器官的再生作用符合器官分化的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論植物激素控制理論，即當生長素與細胞分裂素的比例高時，即當生長素與細胞分裂素的比例高時，愈傷組織僅形成根；生長素與細胞分裂

11、愈傷組織僅形成根；生長素與細胞分裂素的比例小時則產(chǎn)生苗；而兩種激素的素的比例小時則產(chǎn)生苗；而兩種激素的比例適中時，則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。比例適中時，則產(chǎn)生無結(jié)構(gòu)的愈傷組織。 為了使用方便和用量準確，常將為了使用方便和用量準確，常將大量元素大量元素、微量元微量元素、鐵鹽、有機物類和激素類素、鐵鹽、有機物類和激素類分別配制成比培養(yǎng)基分別配制成比培養(yǎng)基濃度大若干倍的母液。當配制培養(yǎng)基時，只需按預濃度大若干倍的母液。當配制培養(yǎng)基時，只需按預先計算好的量吸取母液稀釋即可。先計算好的量吸取母液稀釋即可。 母液應(yīng)保存在冰箱中備用，保存時間不可過長，當母液應(yīng)保存在冰箱中備用，保存時間不可過長，當母液出現(xiàn)沉淀

12、或霉菌團時，則不能使用。母液出現(xiàn)沉淀或霉菌團時，則不能使用。(1)(1)大量元素母液大量元素母液 可配成濃度可配成濃度10倍母液。倍母液。 (2)(2)微量元素母液微量元素母液 可配成濃度可配成濃度100倍的母液。倍的母液。(3)(3)鐵鹽母液鐵鹽母液 可配成可配成100倍的母液，倍的母液，(4)(4)有機物母液有機物母液 可配成可配成1 100倍的母液。倍的母液。(5)(5)激素母液的配制激素母液的配制 每種激素必須單獨配成母液，每種激素必須單獨配成母液，濃度一般配成濃度一般配成0.20.2mgml。用時根據(jù)需要取用。因。用時根據(jù)需要取用。因為激素用量較少，一次可配成為激素用量較少，一次可配

13、成50ml50ml或或100ml100ml。 1).各化合物必須充分溶解后才能混合。各化合物必須充分溶解后才能混合。 2).混合時注意先后順序，特別要將鈣離子與混合時注意先后順序，特別要將鈣離子與硫酸根離子，磷酸根離子錯開，以免產(chǎn)生硫硫酸根離子，磷酸根離子錯開，以免產(chǎn)生硫酸鈣、磷酸鈣等不溶性化合物沉淀。酸鈣、磷酸鈣等不溶性化合物沉淀。 3).混合時要慢，邊攪拌邊混合?；旌蠒r要慢，邊攪拌邊混合。培養(yǎng)基的配制、消毒與分裝培養(yǎng)基的配制、消毒與分裝100倍微量元素母液倍微量元素母液(10ml)10倍大量元素母液倍大量元素母液(100ml)調(diào)調(diào)pH到到5.8100倍鐵鹽母液倍鐵鹽母液(10ml)培養(yǎng)基培

14、養(yǎng)基100倍有機物質(zhì)母液倍有機物質(zhì)母液(10ml)定容到定容到1000ml2,4-D 2mg/L 6-BA 0.5mg/L瓊脂粉瓊脂粉g溶解溶解 分裝（每瓶分裝（每瓶30ml)高壓滅菌高壓滅菌 蔗糖蔗糖g 小麥籽粒小麥籽粒 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA 70%酒精酒精 2.5%NaCLO 無菌水無菌水 培養(yǎng)基的配制。培養(yǎng)基的配制。 小麥籽粒用無菌水浸泡小麥籽粒用無菌水浸泡10小時。小時。 取材、消毒和接種。取材、消毒和接種。正式接種前正式接種前30min30min，打開超凈工作臺上的紫外燈和風，打開超凈工作臺上的紫外燈和風機，機，30min30min后接種

15、；后接種；上超凈臺的第一件事是關(guān)閉紫外燈并打開照明燈；上超凈臺的第一件事是關(guān)閉紫外燈并打開照明燈；把解剖刀、鑷子、解剖針等器械浸泡在把解剖刀、鑷子、解剖針等器械浸泡在7575酒精中；酒精中；點燃酒精燈；點燃酒精燈；用用7575的酒精棉球擦拭雙手；的酒精棉球擦拭雙手；外植體的消毒外植體的消毒：把麥粒置于：把麥粒置于70 %70 %乙醇中浸泡乙醇中浸泡5min5min，之，之后在后在2.5%NaClO2.5%NaClO中消毒中消毒15min15min，然后用無菌水沖洗，然后用無菌水沖洗3 3次。次。 超凈臺上操作超凈臺上操作（）用酒精棉球擦手，然后點燃廢酒精棉球擦拭超凈（）用酒精棉球擦手，然后點燃

16、廢酒精棉球擦拭超凈臺工作臺面。取出一張無菌濾紙，放在面前。臺工作臺面。取出一張無菌濾紙，放在面前。（）用酒精燈火焰燒灼刀柄、刀片、鑷子等，自然冷（）用酒精燈火焰燒灼刀柄、刀片、鑷子等，自然冷卻后置于無菌濾紙上。卻后置于無菌濾紙上。（）取一瓶培養(yǎng)基，除去橡皮筋，揭開封口膜，把培（）取一瓶培養(yǎng)基，除去橡皮筋，揭開封口膜，把培養(yǎng)基放在緊靠酒精燈火焰無菌區(qū)的后方。養(yǎng)基放在緊靠酒精燈火焰無菌區(qū)的后方。（）用酒精棉球擦手，尤其是左手拿麥粒的二個手指（）用酒精棉球擦手，尤其是左手拿麥粒的二個手指和指甲邊緣。和指甲邊緣。（）剝離成熟胚并接種，盾片一面向上。注意無菌操（）剝離成熟胚并接種，盾片一面向上。注意無菌操作，均勻接種作，均勻接種10個即可。個即可。（）蓋好封口膜，纏好皮筋，用記號筆在培養(yǎng)瓶封口（）蓋好封口膜，纏好皮筋，用記號筆在培養(yǎng)瓶封口膜上寫好班級姓名。膜上寫好班級姓名。 放入培養(yǎng)箱，放入培養(yǎng)箱，25培養(yǎng)培養(yǎng)7-10天后觀察記錄。天后觀察記錄。培養(yǎng)基消毒、外植體消毒、超凈臺消毒和操作者無菌操作是培養(yǎng)基消毒、外植體消毒、超凈臺消毒和操作者無菌操作是否符合規(guī)范，是防止菌類污染的關(guān)鍵；否符合規(guī)范，是防止菌類污染