小鼠cd40ig基因真核表達質粒的構建及鑒定

1、【摘要】  目的:構建含小鼠cd40ig基因的真核表達載體，為誘導供體特異性移植物的免疫耐受的基因治療作準備。方法:以小鼠脾臟總rna為模板，以rt-pcr法克隆小鼠cd40胞外段cdna及igg2a fc段cdna；另以pegfp-n1質粒為模板獲得綠色熒光蛋白（gfp）基因。將所得基因片段插入真核表達載體pdc516中得到重組質粒pdc516-cd40-igg-gfp，測序鑒定正確后，用脂質體2000將其轉染人胚腎上皮細胞（hek293細胞），熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的表達。結果:成功構建了小鼠cd40ig基因真核表達質粒pdc516-cd40-igg-gfp，并在hek293細

2、胞中實現(xiàn)表達。結論:小鼠cd40ig基因真核表達質粒pdc516-cd40-igg-gfp構建成功，為誘導供體特異性移植物免疫耐受的研究奠定了基礎。 【關鍵詞】  cd40ig 質粒 真核表達載體     abstract:  objective: to construct a eukaryotic expression vector encoding murine cd40ig gene and make preparation for the gene therapy of induction of donor-specific immun

3、ologic tolerance. methods: the cdna of the extracellular domain of murine cd40 gene and igg2a fc gene were amplified by rt-pcr from the total rna isolated from the mouse spleen, and the green fluorescent protein(gfp) gene was amplified by pcr with the plasmid pegfp-n1 as the template. then the genes

4、 were inserted into the eukaryotic expression vector pdc516, the resultant recombinant plasmid was confirmed by seqencing. then the recombinant plasmid was transfected into human embryonic kidney cell 293(hek293) using lipofectamine 2000,the expressed fusion protein was observed by fluorescence micr

5、oscopy. results: the eukaryotic expression plasmid pdc516-cd40-igg-gfp was successfully constructed, and it could be correctly expressed in hek293 cells. conclusion: the successfully construction of the eukaryotic expression plasmid pdc516-cd40-igg-gfp has laid the foundation for the study of induct

6、ion of donor-specific immunologic tolerance.     key words:   cd40ig; plasmid; eukaryotic expression vector     器官移植是當今治療終末期臟器衰竭的有效方法，但免疫排斥是器官移植后長期生存的一大難題。t細胞是介導排異反應的主要細胞，cd40/cd40l通路在t細胞的激活過程中發(fā)揮著重要作用，因此阻斷cd40/cd40l間的相互作用，可以誘導宿主對移植物的低排斥反應性。由此我們克隆了小鼠cd40分子胞外區(qū)和i

7、gg2a分子fc段的cdna，并以pegfp-n1質粒為模板進行pcr，獲得gfp基因，經酶切連接插入真核表達載體pdc516，制備出重組質粒pdc516-cd40-igg-gfp，轉染293細胞后見gfp表達，證實質粒pdc516-cd40-igg-gfp構建成功，從而為下一步構建含cd40ig基因的腺病毒載體作好了準備，為研究阻斷cd40/cd40l通路誘導宿主對移植物的低排斥反應性奠定了基礎。     1  材料和方法     1.1  實驗動物  balb-c小鼠，6周齡, 雌性, 購自北京大學醫(yī)

8、學院實驗動物部。     1.2  質粒、菌株、細胞株和主要試劑  質粒pegfp-n1、pgem-t載體質粒、e coli.dh5a（天根公司）。低代次hek293細胞株（本元正陽）。admaxtm kit e試劑盒（microbix biosystems，inc.）。taq酶、t4 dna連接酶（takara公司）。限制性核酸內切酶xma?、bgl ii、hind iii（biolabs）。trizol 試劑、lipofectamine 2000（invitrogen）。逆轉錄試劑盒、pcr master mix（mbi）。質粒提取、膠純化

9、試劑盒（qiagen）。dmem高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（gibco）。引物合成由上海生工公司完成，基因測序由北京諾塞基因研究中心有限公司完成。     1.3  構建小鼠cd40ig基因真核表達質粒     1.3.1  小鼠脾臟總rna的提?。簩⑿∈笠灶i椎脫臼法處死，取出脾臟，加入液氮研磨后，用trizol試劑提取總rna，方法按產品說明進行。     1.3.2  cd40、igg2a fc、gfp基因的制備：以小鼠脾臟總rna為模板，oligo-dt為引物，rt-p

10、cr合成cdna，再以此cdna為模板，用cd40和migg fc特異引物進行pcr擴增，另以pegfp-n1質粒為模板進行pcr擴增，引物及pcr反應條件見表1，分別獲得cd40、migg2a fc和gfp基因。     1.3.3  質粒pgem-igg的構建：將igg fc的pcr產物與pgem-t質粒進行ta連接反應，即10l pcr產物加2l的pgem-t載體加10 u的t4連接酶，16 過夜。取2l的連接產物以氯化鈣法轉化大腸桿菌dh5，用藍白斑方法挑選含氨芐青霉素抗性的白斑克隆，在3 ml lb培養(yǎng)基（含氨芐青霉素100 g/ml）中37

11、、80 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取質粒pgem-igg并測序。     1.3.4  質粒p516-igg的構建：用bgl ii分別消化pgem-igg和pdc516，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進行膠純化。將igg片段和pdc516線性載體按7:1的摩爾濃度比例加t4連接酶16 過夜進行連接反應。取5l連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌dh5，用pdc516-f和migg-r引物組合進行菌落pcr篩選正向插入的重組子（見表2），將pcr陽性的重組子進行細菌培養(yǎng)，提取質粒并測序。     1.3.5  質粒p516-c

12、d40-igg融合基因的構建：用xma i分別消化cd40的pcr產物和p516-igg，將cd40片段和pdc516-igg 線性載體進行連接（方法同上）。轉化大腸桿菌dh5后，用pdc516-f和cd40-r引物組合進行菌落pcr篩選（見表2），將陽性結果的重組子進行細菌培養(yǎng)，提取質粒并測序。                         

13、    1.3.6  pdc516-cd40-igg-gfp質粒的構建：用hind ?分別消化gfp的pcr產物和pdc516-cd40-igg，將gfp片段和pdc516-cd-igg 線性載體進行連接反應（方法同上），用gfp-f和pdc516-r引物組合進行菌落pcr篩選正向插入的重組子（見表2），提取質粒并測序。     1.3.7  pdc516-cd40-igg-gfp質粒的大量制備：按qiagen endofree plasmid purification試劑盒說明進行制備，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳證

14、實（見圖2），紫外分光光度儀測od值，過濾除菌后-20 保存?zhèn)溆谩?    1.3.8  重組質粒轉染293細胞：在6孔板中將2.0×105個細胞接種于2 ml含血清不含抗生素的dmem中，在5% co2、37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細胞在轉染時鋪滿平板的60%70%。用lipofectamine 2000轉染試劑介導重組質粒轉染，在無菌ep管中準備a、b兩種溶液。a液：將4.0g dna溶于250l無血清dmem中，輕輕混勻；b液：將10l lipofectamine 2 000溶于250l無血清培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5 min。將a

15、液和b液混合并混勻，室溫孵育20 min，以形成脂質體/dna復合物。換去6孔板中舊的培養(yǎng)液，重新加入2 ml含血清不含抗生素的dmem，逐滴加入500l脂質體/dna復合物。在5% co2、37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。     2  結果     2.1  獲得小鼠cd40胞外區(qū)、igg2a fc段及gfp基因  引物cd40-f和cd40-r經pcr擴增的小鼠cd40胞外區(qū)基因片段為572 bp；引物migg-f和migg-r經pcr擴增的小鼠igg2a fc段為700 bp；引物gfp-f和g

16、fp-r經pcr擴增的gfp基因片段為765 bp。瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1。     2.2  pdc516-cd40-igg-gfp真核表達質粒的成功構建     2.2.1  pdc516-igg的構建：pgem-t載體為3 000 bp的質粒，構建的pgem-igg質粒為3 700 bp。pgem-t質粒的多克隆位點上游110 bp處含有t7 primer序列，用t7+migg-r引物組合可擴增出約810 bp的片段，用t7 primer測序證實igg序列的正確性。將igg片段和pdc516線性載體進行連接

17、反應，用pdc516-f測序證實igg插入序列的正確性（見圖3）。     2.2.2  pdc516-cd40-igg的構建：將cd40片段和pdc516-igg線性載體進行連接反應，用引物pdc516-f測序證實cd40插入序列的正確性。    2.2.3  pdc516-cd40-igg-gfp質粒的構建：將gfp片段和pdc516-cd40-igg 線性載體進行連接反應，用pdc516-r測序證實gfp插入序列的正確性。cd40-igg-gfp含酶切位點的融合產物為2001bp，編碼667aa（見圖4）。

18、    2.3  重組質粒在真核細胞內表達  pdc516-cd40-igg-gfp質粒抽提后在紫外分光光度計下檢測到od值為0.1257。將該質粒用lipofectamine 2000轉染293細胞的第4天開始可見零星的細胞上有gfp表達，隨著時間的延長，gfp表達的細胞量逐漸增多，第7天左右在熒光顯微鏡下見大量的細胞有綠色熒光發(fā)生（見圖5）。     3  討論     目前控制免疫排斥主要依靠免疫抑制劑，在臨床上也取得了較好的療效，但長期使用免疫抑制劑存在增加機會性感染

19、和腫瘤的發(fā)生率等副作用。近年來，大量文獻報道了使用多種生物制劑預防器官移植后的排斥反應的可行性，包括單克隆抗體、細胞因子、細胞因子可溶性受體等在動物體內和人體實驗中均取得一定的療效。這些制劑最大的優(yōu)點是能阻斷免疫反應中的特異性步驟，減少毒副作用，導致人體對外源臟器的免疫耐受，但是這些生物制劑與傳統(tǒng)的免疫抑制劑一樣需要終身用藥，存在免疫移植的效果不強等問題1。     近年來，國內外許多學者已經嘗試采用基因治療的方法來預防移植后的排斥反應3-5。他們認為，細胞免疫應答是移植排斥的主要機制，而t細胞的有效活化除了需要抗原信號（第一信號）外，同時也需要第二信號的協(xié)同作用

20、，否則t細胞將表現(xiàn)為無反應或凋亡。因此阻斷共刺激信號途徑，防止t細胞活化，可以誘導免疫無能（immune anergy）。研究表明，作為共刺激通路之一的cd40/cd40l通路與b7/cd28共刺激通路相比可能起著更關鍵的作用6。     cd40為i型跨膜糖蛋白,主要表達于b細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、內皮細胞等；cd40l為33kd的ii型跨膜糖蛋白，主要表達于活化的cd4+t淋巴細胞，部分活化的cd8+t細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞、血小板和巨噬細胞1。研究認為，cd40/cd40l交聯(lián)不僅能調節(jié)b細胞的活化，還能夠促進apc細胞表達cd80、cd86等共刺

21、激分子，這些分子與t細胞表面的配體cd28、ctla-4結合，形成對t細胞刺激的第二信號，從而使t細胞完全活化。 因此，我們可以通過阻斷cd40/cd40l共刺激通路從而誘導宿主對移植物的低反應性。     動物實驗顯示，用抗cd40l單克隆抗體阻斷cd40/cd40l之間的相互作用可以延長移植物的存活時間7,8，但需要反復給藥以維持有效血藥濃度，并有引起血栓合并癥的危險9。nomura等10在大鼠模型中單次注入cd40ig重組腺病毒，觀察到移植肝存活時間超過300 d，并出現(xiàn)了供體特異性耐受現(xiàn)象；劉荷中等11人在移植物抗宿主?。╣vhd）小鼠中注入純化的cd40

22、ig融合蛋白，顯著延長了小鼠的平均存活時間，提示應用基因治療的方法阻斷cd40/cd40l通路在移植領域有巨大的開發(fā)前景。     我們克隆了小鼠cd40分子胞外區(qū)和igg2a分子fc段的cdna，成功構建了重組質粒pdc516-cd40-igg-gfp。其真核表達載體pdc516來源于admax腺病毒載體包裝系統(tǒng)，該系統(tǒng)與目前使用最普及的adeasy系統(tǒng)相比，具有效率高、有助于重組腺病毒的基因組完整性等特點。本質粒的成功構建為下一步構建腺病毒載體奠定了基礎，在后續(xù)的實驗中，我們將構建含小鼠cd40ig的腺病毒注入到動物移植模型中，使移植動物能夠持續(xù)表達cd40i

23、g，從而觀察阻斷cd40/cd40l通路與誘導移植免疫耐受的關系，探索其潛在的臨床應用價值。       【參考文獻】  1 guillot c, guillonneau c, mathieu p,et al. prolonged block-ade of cd40-cd40 ligand interactions by gene transfer of cd40ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but

24、does not preventchronic rejectionj.j immunol,2002, 168(4): 1600-1609.2 guillot c, mauff b, cuturi mc, et al. gene therapy in transplantation in the year 2000: moving towards clinical applicationsj. gene ther,2000, 7(1):14-19.3 qin l, ding y, pahud dr, et al. adenovirus-mediated gene transfer of vira

25、l interleukin-10 inhibits the immune response to both alloantigen and adenoviral antigenj. hum gene ther,1997,8(11):1365-1374.4 olthoff km,judge ta,gelman ae,et al. adenovirus-medi-ated gene transfer into cold-preserved liver allografts: sur-vival pattern and unresponsiveness following transduction with ctla4igj. nat med, 1998,4(2):194-200.5 guillot c, mathieu p, coathalem h, et al. tolerance to cardiac allografts via local and systemic mechanisms afteradenovirus-mediated ctla4ig expressionj. j immunol,2000,164(10):5258-5268.6 yamada aa, sayegh mh. the cd154-cd40 costimulatory pathway in