血液凝固分析儀的原理及應(yīng)用

1、血液凝固分析儀的原理及應(yīng)用任遠(yuǎn)強(qiáng) 楊勝科 本文作者任遠(yuǎn)強(qiáng)先生，西安交大開元生物科技發(fā)展有限公司工程師 ; 楊勝科先生， 長(zhǎng)安大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系副教授。 關(guān)鍵詞 : 血凝 血栓與止血 血液凝固分析儀 概述 血栓與止血是血液重要的功能之一，血栓與止血的形成及調(diào)節(jié)組成了血液內(nèi)存在的復(fù)雜、功能對(duì)立的凝血系統(tǒng)和抗凝系統(tǒng)，他們通過各種凝血因子的調(diào)節(jié)保持著動(dòng)態(tài)平衡，使得生理狀態(tài)下血液維持了正常的流體狀態(tài)，既不溢出于血管之外 (出血)，又不凝固于血管之中(血栓形成)。止血與血栓試驗(yàn)的目的就是通過各種凝血因子的檢測(cè)從不同的側(cè)面、不同環(huán)節(jié)了解發(fā)病原因、病理過程，進(jìn)而進(jìn)行疾病的診斷和治療。 近幾年先進(jìn)儀器在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的應(yīng)

2、用，使檢測(cè)方法進(jìn)入了新階段，如利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板膜蛋白、血漿內(nèi)各種抗凝血因子抗體，使用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行遺傳病的診斷，甚至用激光共聚焦顯微鏡觀察不同病理過程血小板中鈣離子濃度、鈣流及鈣波動(dòng)，進(jìn)一步研究止血與血栓疾病的病理生理及藥物作用機(jī)制，這些方法使用的儀器昂貴且試劑不易獲得，不適合廣泛推廣應(yīng)用，更適合試驗(yàn)室研究。血液凝固分析儀 (以下簡(jiǎn)稱血凝儀)的出現(xiàn)解決了此類難題，它是血栓與止血分析的專用儀器，可檢測(cè)多種血栓與止血指標(biāo)，為出血和血栓性疾病診斷、溶栓與抗凝治療監(jiān)測(cè)及療效觀察提供了有價(jià)值的指標(biāo)，是目前血栓/止血實(shí)驗(yàn)室中使用的最基本的設(shè)備。 1910年，Kottman發(fā)明了世界上最早的血凝

3、儀，通過測(cè)定血液凝固時(shí)粘度的變化來反映血漿凝固的時(shí)間。20世紀(jì)60年代，機(jī)械法血凝儀得到開發(fā)，出現(xiàn)了早期的平面磁珠法。70年代以后，由于機(jī)械、電子工業(yè)的發(fā)展，使各種類型的全自動(dòng)血凝儀先后問世。 80年代，由于發(fā)色底物的出現(xiàn)并應(yīng)用于血液凝固的檢測(cè)，使全自動(dòng)血凝儀除了可以進(jìn)行一般的篩選試驗(yàn)外，尚可以進(jìn)行凝血、抗凝、纖維蛋白溶解系統(tǒng)單個(gè)因子的檢測(cè)，使抗凝、纖溶的檢測(cè)成為可能。90年代，全自動(dòng)血凝儀免疫通道的開發(fā)將各種檢測(cè)方法融為一體，檢測(cè)的項(xiàng)目更加全面，為血栓與止血的檢測(cè)提供了新的手段，進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。近年來血凝儀發(fā)展和改進(jìn)的趨勢(shì)主要體現(xiàn)在如下幾個(gè)方面: 即檢測(cè)原理的復(fù)雜化、檢測(cè)速度的增加，試

4、劑分配系統(tǒng)準(zhǔn)確性的提高和儀器隨機(jī)分析功能的增強(qiáng)等。 血凝儀的發(fā)展方向與全自動(dòng)生化分析儀一樣，即進(jìn)一步提高儀器的檢測(cè)自動(dòng)化程度。根據(jù)自動(dòng)化程度的高低，血凝儀又分為全自動(dòng)和半自動(dòng)儀器。全自動(dòng)儀器的特點(diǎn)是檢測(cè)速度快，測(cè)定項(xiàng)目多，檢測(cè)原理較復(fù)雜和儀器設(shè)計(jì)的智能化。使用全自動(dòng)血凝儀時(shí)只要將分離出的血漿樣品放置在指定的位置，儀器便可完成加樣、預(yù)溫、檢測(cè)和報(bào)告打印等全過程。多數(shù)全自動(dòng)血凝儀可任意選擇不同的項(xiàng)目組合進(jìn)行檢測(cè)，樣品的檢測(cè)具有隨機(jī)性，儀器的數(shù)據(jù)處理和存儲(chǔ)功能也較強(qiáng)。半自動(dòng)血凝儀需手工加樣，檢測(cè)速度較慢，原理較單一，檢測(cè)項(xiàng)目少，儀器配備的軟件功能也很有限。 二 血凝儀的基本原理 不同類型的血凝儀采用

5、的原理也不同，目前主要采用的檢測(cè)方法有 : 凝固法、底物顯色法、免疫法、乳膠凝集法等。由于在血栓/止血檢驗(yàn)中最常用的參數(shù)，均可用凝固法測(cè)量，故目前半自動(dòng)血凝儀基本上以凝固法測(cè)量為主，在全自動(dòng)血凝儀中，也一定包括凝固法測(cè)量方式。 1. 凝固法(生物物理法) 凝固法是通過檢測(cè)血漿在凝血激活劑作用下的一系列物理量 (光、電、機(jī)械運(yùn)動(dòng)等)的變化，再由計(jì)算機(jī)分析所得數(shù)據(jù)并將之換算成最終結(jié)果，所以也可將其稱作生物物理法。 a.電流法 電流法利用纖維蛋白原無(wú)導(dǎo)電性而纖維蛋白具有導(dǎo)電性的特點(diǎn)，將待測(cè)樣品作為電路的一部分，根據(jù)凝血過程中電路電流的變化來判斷纖維蛋白的形成。但由于電流法的不可靠性及單一性，所以很快

6、被更靈敏、更易擴(kuò)展的光學(xué)法所淘汰。 b. 光學(xué)法(比濁法) 光學(xué)法血凝儀是根據(jù)凝固過程中濁度的變化來測(cè)定凝血功能。 根據(jù)待驗(yàn)樣品在凝固過程中光的變化來確定檢測(cè)終點(diǎn)的。當(dāng)向樣品中加入凝血激活劑后，隨著樣品中纖維蛋白凝塊的形成過程，樣品的光強(qiáng)度逐步增加，儀器把這種光學(xué)變化描繪成凝固曲線，當(dāng)樣品完全凝固以后，光的強(qiáng)度不再變化。通常是把凝固的起始點(diǎn)作為 0%，凝固終點(diǎn)作為100%，把50%作為凝固時(shí)間。光探測(cè)器接收這一光的變化，將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，經(jīng)過放大再被傳送到監(jiān)測(cè)器上進(jìn)行處理，描出凝固曲線。 光學(xué)法凝血測(cè)試的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高、儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于自動(dòng)化 ; 缺點(diǎn)是樣品的光學(xué)異常、測(cè)試杯的光潔度、加樣

7、中的氣泡等都會(huì)成為測(cè)量的干擾因素。 c.磁珠法 早期的磁珠法是在檢測(cè)杯中放入一粒磁珠，與杯外一根鐵磁金屬桿緊貼呈直線狀，標(biāo)本凝固后，由于纖維蛋白的形成，使磁珠移位而偏離金屬桿，儀器據(jù)此檢測(cè)出凝固終點(diǎn)，這類儀器也可稱為平面磁珠法。早期平面磁珠法能有效克服光學(xué)法中樣品本底干擾問題，但存在靈敏度低等缺點(diǎn)。 現(xiàn)代磁珠法出現(xiàn)在 20世紀(jì)80年代末，90年代初進(jìn)入商品化?，F(xiàn)代磁珠法被稱為雙磁路磁珠法。雙磁路磁珠法的測(cè)試原理如下: 測(cè)試杯的兩側(cè)有一組驅(qū)動(dòng)線圈，它們產(chǎn)生恒定的交變電磁場(chǎng)，使測(cè)試杯內(nèi)特制的去磁小鋼珠保持等幅振蕩運(yùn)動(dòng)。凝血激活劑加入后，隨著纖維蛋白的產(chǎn)生增多，血漿的粘稠度增加，小鋼珠的運(yùn)動(dòng)振幅逐漸

8、減弱，儀器根據(jù)另一組測(cè)量線圈感應(yīng)到小鋼珠運(yùn)動(dòng)的變化，當(dāng)運(yùn)動(dòng)幅度衰減到50%時(shí)確定凝固終點(diǎn)。 2. 底物顯色法(生物化學(xué)法) 底物顯色法是通過測(cè)定產(chǎn)色底物的吸光度變化來推測(cè)所測(cè)物質(zhì)的含量和活性的，該方法又可稱為生物化學(xué)法。檢測(cè)通道由一個(gè)鹵素?zé)魹闄z測(cè)光源，波長(zhǎng)一般為 405nm。探測(cè)器與光源呈直線，與比色計(jì)相仿。 血凝儀使用產(chǎn)色底物檢測(cè)血栓與止血指標(biāo)的原理是 : 通過人工合成與天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列順序、并還有特定作用位點(diǎn)的小肽，并將可水解產(chǎn)色的化學(xué)基因與作用位點(diǎn)的氨基酸相連。測(cè)定時(shí)由于凝血因子具有蛋白水解酶的活性，它不僅能作用于天然蛋白質(zhì)肽鏈，也能作用于人工合成的肽鏈底物，從而釋放出

9、產(chǎn)色基因，使溶液呈色。產(chǎn)生顏色的深淺與凝血因子活性成比例關(guān)系，故可進(jìn)行精確的定量。目前人工合成的多肽底物有幾十種，而最常用的是對(duì)硝基苯胺(PNA)，呈黃色，可用405mm波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。 3. 免疫學(xué)方法 在免疫學(xué)方法中以純化的被檢物質(zhì)為抗原，制備相應(yīng)的抗體，然后用抗原抗體反應(yīng)對(duì)被檢物進(jìn)行定性和定量測(cè)定。常用方法有 : a.免疫擴(kuò)散法。將被檢物與相應(yīng)抗體在一定介質(zhì)中結(jié)合，測(cè)定其沉淀環(huán)大小，與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，計(jì)算待測(cè)物濃度。此法操作簡(jiǎn)單，不需特殊設(shè)備，但耗時(shí)過長(zhǎng)，靈敏度不高，僅適于含量較高凝血因子檢測(cè)。 b.箭電泳。在一定電場(chǎng)中，凝膠支持物內(nèi)的被檢物與其相應(yīng)抗體結(jié)合形成的一個(gè)個(gè)“火箭峰”，火箭峰的高

10、度與其含量成正比，通過測(cè)定峰高并與標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行定量測(cè)定。此法操作復(fù)雜，臨床應(yīng)用較少。 c.雙向免疫電泳。 通過水平與垂直兩個(gè)方向進(jìn)行電泳可將某些分子結(jié)構(gòu)異常的凝血因子進(jìn)行分離。 d.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)。用酶標(biāo)抗原或抗體和被檢物進(jìn)行抗原結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)過洗滌除去未結(jié)合的抗原或抗體及標(biāo)本中的干擾物質(zhì)，留下固定在管壁的抗原抗體復(fù)合物，然后加入酶的底物和色原性物質(zhì)，反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，顏色深淺與被檢物濃度呈比例關(guān)系。該法靈敏度高，特異強(qiáng)，目前已用于許多止血、血栓成分檢測(cè)。 e.免疫比濁法。 將被檢物與其相應(yīng)抗體混合形成復(fù)合物，從而產(chǎn)生足夠大的沉淀顆粒，通過透射比濁或散射比濁進(jìn)

11、行測(cè)定。此法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性好，便于自動(dòng)化。 三 血栓與止血的基本檢測(cè)指標(biāo)及可采用的原理 血栓與止血的基本檢測(cè)指標(biāo)為 : 凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、凝血酶時(shí)間(TT)、內(nèi)源凝血因子、外源凝血因子、高分子量肝素、低分子量肝素、蛋白C、蛋白S等，血凝儀檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)時(shí)采用了不同的原理，表1列出了目前可開展的血栓/止血成份檢測(cè)方法。 四 國(guó)內(nèi)常見的幾種型號(hào)血凝儀的性能比較 1. 國(guó)內(nèi)應(yīng)用情況 目前國(guó)內(nèi)使用的血凝儀主要為進(jìn)口儀器。早期引進(jìn)的血凝儀多是價(jià)格偏低、檢測(cè)速度慢、測(cè)定項(xiàng)目較少的半自動(dòng)儀器，且數(shù)量較少。隨著國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的提高，近 5年來引進(jìn)的儀器數(shù)量大大增加，主要以全