補充左旋精氨酸對耐力訓(xùn)練大鼠股外肌抗氧化酶系的影響

1、補充左旋精氨酸對耐力訓(xùn)練大鼠股外肌抗氧化酶系的影響張漓 徐建方 馮連世 封文平國家體育總局體育科學(xué)研究所運動生物科學(xué)中心(北京100061摘要 目的:研究補充左旋精氨酸(L-Arg對耐力訓(xùn)練大鼠股外肌抗氧化酶系的影響,了解一氧化氮及其自由基衍生物對耐力訓(xùn)練機體骨骼肌自由基生成和清除的作用。方法:通過適應(yīng)性訓(xùn)練篩選出40只SD雄性大鼠,按體重隨機分為:安靜對照組、耐力訓(xùn)練組、小劑量+耐力訓(xùn)練組、大劑量+耐力訓(xùn)練組,每組10只。除安靜對照組外其他動物進行了4周水平跑臺耐力訓(xùn)練,小劑量+耐力訓(xùn)練大鼠和大劑量+耐力訓(xùn)練大鼠分別在每次訓(xùn)練前一小時左右按照40mg/kg體重的劑量和500mg/kg體重的劑

2、量給予L-Arg水溶液灌胃;4周訓(xùn)練后測定各組大鼠股外肌丙二醛(MDA含量、過氧化氫酶(C AT、超氧化物歧化酶(SOD、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST的活性,以及血清肌酸激酶(C K活性。結(jié)果:(1耐力訓(xùn)練對大鼠安靜狀態(tài)下股外肌C AT活性沒有影響;給予小劑量L-Arg能使耐力訓(xùn)練大鼠安靜狀態(tài)下股外肌C AT活性顯著降低(P<0 01,給予大劑量L-Arg反而使CAT活性回升;(2耐力訓(xùn)練對大鼠安靜狀態(tài)下股外肌SOD活性沒有影響,補充L-Arg可使大鼠股外肌SOD活性明顯升高(小劑量P<0 01,大劑量P<0 05;(3耐力訓(xùn)練可使大鼠安靜狀態(tài)下股外肌GST活性顯著下降(P<

3、0 01,補充L-Arg則使其下降不明顯(P>0 05;(4耐力訓(xùn)練能夠使安靜大鼠股外肌MDA和血清CK顯著減少(P<0 05,補充L-Arg會增加經(jīng)過耐力訓(xùn)練的大鼠安靜狀態(tài)下股外肌MDA生成(P<0 01,但血清C K濃度則下降,并且下降趨勢隨補充L-Arg劑量增加而增加。結(jié)論:在耐力運動中NO能夠促進骨骼肌內(nèi)超氧化物自由基及其衍生物自由基的生成,較高濃度的NO還能夠促進過氧化氫、過氧化物和脂質(zhì)氫等自由基的生成,對骨骼肌有一定的自由基損傷作用。但其上調(diào)血流量的保護作用能夠部分抵消其帶來的自由基損害作用。關(guān)鍵詞 耐力訓(xùn)練;大鼠;L-Arg;一氧化氮;抗氧化酶Effect of

4、 Supplementation of Exogenous L-Arg on the Antioxidant Enzymes in Vastus Lateralis ofRats undergoing Endurance TrainingZhang Li,Xu Jian fang,Feng Lianshi,Feng WenpingCenter o f Biological Science,China Institute o f Sport Science,Beijing,China100061Abstract Objective The present study aimed at inves

5、tigating the effects of nitric oxide(NOand its free radical ramifications on the activities of antioxidant enzymes in the skeletal muscle of rats undergoing en-durance training.Methods After beforehand training,40male SD rats were chosen and randomly divided into 4groups in according to the training

6、 perfor mance and body weights:(1sedentary group(SG;(2en-durance training group(E TG;(3endurance training with low dose of L-Arg group(LDTG;and(4en-durance training with high dose of L-Arg group(HDTG.All rats except the SG under went4weeks of en-durance training on treadmill.The LDTG was given40mg/k

7、g wt of L-Arg,and the HDTG group was given 500mg/kg wt of L-Arg1hour before training of each day.All rats were killed24hours after the final train-ing.The MDA,CAT,SOD and GST activities in vastus lateralis,and serum CK activity were determined.Results(1The CAT activity in SG remained unchanged,while

8、 decreased significantly in LDTG(P<0 01,基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(批準(zhǔn)號30570892通訊作者:張漓,Email:zhanglici ;Tel:010-*and sho wed some trend of increasing in HDTG.(2SOD activity remained unchanged in E TG,ho wever,in-creased significantly in LD TG(P<0 05and HDTG(P<0 01.(3GST activity decreased significant

9、ly in ETG(P<0 01,but showed no change in groups with supplementation of L-Arg.(4Endurance training reduced MDA production and serum C K level in SG significantly(P<0 05.The production of MDA in-creased in groups with supple mentation of L-Arg.Ho wever,serum CK decreased while the dose of L-Arg

10、 increased.Conclusions The damaging effect of nitric oxide as a free radical appeared mainly through increasing the production of superoxide radical and its ramification.High level of NO could also increase the output of free radicals such as peroxide,hydro peroxide and lipoxide hydrogen,and hence a

11、ggravate the damage of the skele-tal muscle.But it s free radical damage effects can be partly mitigated by its upgrade-blood-stream effec ts.Key words rat,nitric oxide,antioxidant enzymes,endurance training,L-ArgNO本身是一種自由基,與超氧化物自由基結(jié)合后還會形成化學(xué)活性遠高于NO或超氧化物自由基的物質(zhì)ONOO-1,2,后者可以與CO2結(jié)合成高活性物質(zhì),還可以通過均裂反應(yīng)成為自由基與

12、非自由基3。其中,自由基衍生物ONOO-的活性作用是目前已知生物自由基里活性最高的自由基之一,能夠通過破壞線粒體結(jié)構(gòu)的完整性,誘導(dǎo)線粒體膜通道開放,可逆或不可逆地抑制一些線粒體呼吸鏈的中間反應(yīng),損傷DNA,增強表達P53等作用導(dǎo)致細胞抑制或凋亡4,因此NO作為自由基在人體內(nèi)發(fā)生的病理作用不容忽視,值得深入探討。許多研究都報道過生理濃度的NO對組織細胞有保護作用,高濃度的NO則有促進細胞凋亡的作用5,6,目前國內(nèi)外對NO在腦缺血再灌注中對神經(jīng)元細胞的損傷作用的研究很多7,而對NO的自由基作用對骨骼肌細胞的損傷研究則少見。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),補充左旋精氨酸(L-Arg可以提高機體內(nèi)NO的生成量,

13、同時增加對骨骼肌的損傷8,其中是否有關(guān)聯(lián)還未見相關(guān)報道。本研究期望通過給予耐力運動大鼠外源性L-Arg來提高運動大鼠體內(nèi)NO生成量,進而觀察NO作為自由基物質(zhì)對大鼠骨骼肌及骨骼肌抗氧化酶系帶來的影響,從而為證實運動中NO作為自由基具有損傷骨骼肌的作用提供依據(jù)。1 材料與方法1 1 研究對象與篩選分組實驗對象:雄性SD大鼠50只(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,鼠齡6周,自由飲食,室溫18 2 ,光照時間7 00-19 00。動物篩選與分組:所有實驗大鼠進入動物房進行適應(yīng)性生活5天,適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練9天,隨后進行一次耐力性力竭運動,根據(jù)力竭運動時間篩選出耐力運動能力最接近的40只大鼠,按體重隨機分

14、成4組:安靜對照組(Sedentary Group,SG,n=10,體重295 28 9 61g;(2耐力訓(xùn)練組(Endurance Training Group,E TG,n=10,體重296 82 6 35g;(3小劑量+耐力訓(xùn)練組(Low Dose Training Group,LD TG,n=10,體重295 28 7 82g;(4大劑量+耐力訓(xùn)練組(High Dose T raining Group,HDTG,n=10,體重296 03 8 92g。1 2 運動方式與給藥情況運動方式:除安靜對照組外其他各組動物進行4周水平跑臺耐力訓(xùn)練,速度36米/分、運動時間為60分鐘/日,每周訓(xùn)練

15、6天,休息1天,運動中使用電刺激大鼠尾部。給藥情況:小劑量+耐力訓(xùn)練組大鼠每次訓(xùn)練前1小時左右按照40mg/kg體重的劑量給予濃度10g/L的L-Arg水溶液灌胃;大劑量+耐力訓(xùn)練組大鼠每次訓(xùn)練前1小時左右按照500mg/kg體重的劑量給予濃度125g/L的L-Arg水溶液灌胃。1 3 實驗取材各組大鼠均在4周耐力訓(xùn)練跑結(jié)束24小時后處死取材。按1 0ml/100克體重劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠,腹主動脈取血,然后迅速分離出大鼠右側(cè)股外肌(股四頭肌外側(cè)頭,投入液氮中保存待用。取出的主動脈血待靜置30分鐘后3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,分離出血清保存待用。1 4 測試指標(biāo)與方法1

16、4 1 股外肌丙二醛(MDA含量,和過氧化氫酶(C AT、超氧化物歧化酶(SOD、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST、一氧化氮合酶(NOS活性的測定肌肉用生理鹽水制備成10%的勻漿,3500轉(zhuǎn)/分,離心20分鐘,取上清液測定各指標(biāo)。MDA測試利用MDA與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物,在532nm處有最大吸收峰的原理,組織MDA含量用nmol/mg prot表示;C AT利用可見光法測試,C AT活力定義是每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 mol的H2O2的量為一個活力單位;SOD測試采用黃嘌呤氧化酶法,活力定義是每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達到50%時所對應(yīng)的SOD量為一個亞硝酸鹽單位;GST測試

17、采用可見光法,活力定義是每毫克蛋白質(zhì)每分鐘扣除非酶促反應(yīng)使GSH濃度降低1 mol/L為一個酶活力單位。NOS活性通過測定單位體積血清或單位重量組織蛋白質(zhì)在單位時間內(nèi)生成NO的nmol數(shù)來測定。組織蛋白質(zhì)濃度采用雙縮脲法測定。上述指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒以及MD-100半自動生化分析儀測定,具體方法全部參照試劑盒附帶的說明書進行操作。1 42 血清肌酸激酶(CK血清C K活性測定采用上海生工公司提供的試劑盒,以及MD-100半自動生化分析儀測定,具體方法全部參照試劑盒附帶的說明書進行操作。1 5 數(shù)據(jù)處理所有實驗數(shù)據(jù)均以算術(shù)平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS11 0軟件對各組的

18、實驗結(jié)果分別進行t檢驗,P<0 05為具有顯著性意義,P<0 01為具有非常顯著性意義。2 結(jié)果2 1 大鼠股外肌NOS及抗氧化酶活性變化表1顯示,耐力訓(xùn)練組和大劑量+耐力訓(xùn)練組較安靜對照組NOS活性顯著下降(P<0 01,但小劑量+耐力訓(xùn)練組和大劑量+耐力訓(xùn)練組均顯著高于耐力訓(xùn)練組(P<0 01。耐力訓(xùn)練組股外肌SOD與安靜對照組相比無明顯變化,補充L-Arg的訓(xùn)練組SOD活性明顯升高(小劑量P<0 01,大劑量P<0 05,小劑量+耐力訓(xùn)練組顯著高于耐力訓(xùn)練組,大劑量+耐力訓(xùn)練組與耐力訓(xùn)練組相比有升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義。耐力訓(xùn)練組股外肌C AT活性與安

19、靜對照組相比無明顯差異,給予小劑量L-Arg后C AT活性顯著下降(P<0 01,給予大劑量L-Arg后C AT活性反而回升。經(jīng)過耐力訓(xùn)練后大鼠股外肌GST活性較安靜對照組顯著下降(P<0 01,而給予L-Arg后GST 活性有回升趨勢,小劑量+耐力訓(xùn)練組明顯高于耐力訓(xùn)練組(P<0 05,大劑量+耐力訓(xùn)練組雖與耐力訓(xùn)練組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異,但也有升高趨勢。耐力訓(xùn)練能夠使股外肌MDA水平顯著減少(P<0 01;補充L-Arg則增加耐力訓(xùn)練大鼠股外肌MDA生成(P<0 05。表1 各組大鼠股外肌NOS及抗氧化酶活性的比較Table1 Comparison of NOS

20、 acti vity and antioxidant enzymes in vastus laterali s in each group 組別(Groupsn NOS(U/mg protSOD(NU/mg protC AT(U/mg protGS T(U/mg protMDA( mol/g prot安靜對照組(SG100 07 0 0197 57 8 996 93 1 5636 87 12 840 57 0 13耐力訓(xùn)練組(E TG100 01 0 00*102 90 8 367 40 1 5514 48 6 82*0 32 0 09*小劑量+耐力訓(xùn)練組(LD TG100 05 0 02#1

21、15 13 10 25*#4 53 0 86#28 31 12 26#0 58 0 16#大劑量+耐力訓(xùn)練組(HDTG100 04 0 01*#110 99 13 22*8 02 1 14 23 16 10 320 46 0 09#*P<0 05,*P<0 01,與安靜對照組比較;#P<0 05,#P<0 01,與耐力訓(xùn)練組比較; P<0 01,與小劑量+耐力訓(xùn)練組比較。*P<0 05,*P<0 01,vs.SG;#P<0 05,#P<0 01,vs.ETG; P<0 01vs.LDTG.2.2 大鼠血清CK的變化表2 各組大鼠血清C

22、K的比較(U/LTable2 Comparision of level of serum C K in each group(U/L組別(Groupsn血清CK安靜對照組(SG10934 88 228 12耐力訓(xùn)練組(E TG10712 90 144 61*小劑量+耐力訓(xùn)練組(LDTG10664 38 219 77*大劑量+耐力訓(xùn)練組(HD TG10562 67 116 53*# *P<0 05,*P<0 01,與安靜對照組比較;#P< 0 05,與耐力訓(xùn)練組比較。*P<0 05,*P<0 01,vs.SG;#P<0 05,vs.E TG.表2顯示,耐力訓(xùn)練

23、組、小劑量+耐力訓(xùn)練組和大劑量+耐力訓(xùn)練組大鼠血清C K水平均較安靜對照組顯著下降(P<0 05,P<0 01,而且隨著給予L -Arg劑量的增加,這種下降趨勢更為明顯,表現(xiàn)為小劑量+耐力訓(xùn)練組血清CK數(shù)值低于耐力訓(xùn)練組,而大劑量+耐力訓(xùn)練組進一步下降,并且較耐力訓(xùn)練組有顯著性差異(P<0 05。3 討論3 1 補充不同劑量L-Arg對大鼠骨骼肌NO/NOS 系統(tǒng)的影響NO在體內(nèi)壽命極短,只存在幾秒到幾十秒,其生成水平主要由NOS(一氧化氮合酶的活性決定。從實驗結(jié)果來看(表1,補充不同劑量L-Arg組股外肌NOS活性均比未補充L-Arg組(耐力訓(xùn)練組明顯升高,說明外源性的L-

24、Arg能夠提高大鼠股外肌NO生成量。這是因為NO的合成除取決于胞漿內(nèi)NOS活性外,還與血漿中L-Arg含量和L-Arg 的跨膜轉(zhuǎn)運速率等密切相關(guān)。有研究報道耐力訓(xùn)練能夠上調(diào)大鼠股外肌及其血管壁細胞NOS表達9,還有報道運動鍛煉有促進L-Arg跨膜轉(zhuǎn)運的作用,因此這也是運動加補充L-Arg能夠提高NO生成能力的原因之一10。本研究擬通過觀察增加大鼠股外肌NO生成對抗氧化酶系的影響,來分析NO對股外肌的自由基損傷作用。3 2 耐力訓(xùn)練和補充不同劑量的L-Arg對大鼠骨骼肌抗氧化酶的影響本實驗結(jié)果顯示(如表1,經(jīng)過一般的耐力訓(xùn)練后,大鼠股外肌SOD活性沒有發(fā)生變化,而補充L-Arg能提高SOD的活性

25、。James等報道11,有氧耐力訓(xùn)練1619周后雌性豚鼠動脈血管內(nèi)皮細胞中SOD-1蛋白水平和Cu/Zn-SOD活性顯著上升,等等。這與我們的研究結(jié)果稍有差異,可能是實驗動物及訓(xùn)練負荷不同造成的。超氧化物歧化酶(SOD是有機體內(nèi)主要清除超氧化物自由基的酶,除了氧自由基外SOD還可以清除氮自由基。通過同時參與調(diào)節(jié)體內(nèi)NO水平和O 2水平,SOD可以防止氧、氮自由基對機體造成直接或間接的損傷12。因此補充L-Arg后股外肌SOD活性提高表明NO 具有明顯的超氧化物自由基特征。另外,Fukai 等13發(fā)現(xiàn)NO可以上調(diào)血管細胞外SOD(ec SOD的表達水平,從而防止O 2與NO結(jié)合成化學(xué)活性很強的O

26、NOO-。因此可以認為給予外源性L-Arg增加NO生成是通過在基因表達水平影響SOD酶蛋白的生成而引起SOD活性的提高。本研究發(fā)現(xiàn)耐力訓(xùn)練對大鼠安靜狀態(tài)下的股外肌C AT活性無明顯影響,補充小劑量L-Arg可使耐力訓(xùn)練后股外肌CAT活性顯著降低,而補充大劑量L-Arg則對C AT活性影響不大(表1。由于C AT 主要清除線粒體產(chǎn)生的過氧化氫(H2O212,因此說明補充小劑量L-Arg可能有助于減少線粒體H2O2的產(chǎn)生,這種作用可能是通過促進骨骼肌供血供氧而達到的。但NO生成量過多不但不能有效降低H2O2的生成,反而有增加H2O2生成的作用,可能是由于NO與超氧陰離子O 2結(jié)合后分解釋放出氧化性

27、更強的自由基OH ,兩個OH 可反應(yīng)縮合生成H2O2(OH +OH H2O2,H2O2的增加進而引起CAT適應(yīng)性提高。實驗結(jié)果提示少量增加NO生成量有利于減少H2O2自由基對股外肌的損傷,大量增加NO生成量則會增加其自由基損傷作用。這與NO在低濃度時主要發(fā)揮生理作用,在高濃度時細胞損害作用增強的生理特征是一致的10。本實驗結(jié)果(表1顯示,耐力訓(xùn)練后大鼠股外肌GST活性明顯下降,補充L-Arg后股外肌GST活性下降程度反而減小。這是因為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶主要參與清除機體內(nèi)脂質(zhì)氫、過氧化物(包括H2O2,減輕有機氫過氧化物對機體的損害14,而耐力訓(xùn)練能顯著降低大鼠股外肌脂質(zhì)氫、過氧化物等自由基的生成(

28、如前所述,因此訓(xùn)練后GST活性明顯下降。而補充L-Arg后NO生成增加,其主要衍生物ONOO-自由基活性很強,可以氧化GSH,使后者成為GSSG,還可引發(fā)脂質(zhì)過氧化、氧化蛋白質(zhì)及羥化作用,使脂質(zhì)氫等自由基生成增加,因此能夠激活GST,使其活性提高。總的來看,NO生成增加對目前我們熟知的一些主要抗氧化酶活性均有影響,而且有明顯的劑量-效應(yīng)差異。3 3 耐力訓(xùn)練和補充不同劑量的L-Arg對大鼠骨骼肌過氧化物生成的影響為了解NO對運動機體自由基生成和清除的總體影響,我們測定了大鼠股外肌丙二醛(MDA以反映NO的自由基作用對組織細胞膜的損傷程度。血清C K是目前用于評價骨骼肌細胞膜損傷狀況的最常用的敏

29、感指標(biāo)之一,而且影響因素相對較少;我們也測定了血清CK來評估骨骼肌細胞膜的整體損傷程度。本實驗結(jié)果顯示(表1,耐力訓(xùn)練能夠顯著降低大鼠股外肌MDA生成,而補充不同劑量L-Arg 均能增加經(jīng)過耐力訓(xùn)練大鼠股外肌MDA水平。王長春等也曾報道過,18天的游泳訓(xùn)練可以使大鼠骨骼肌MDA含量下降15,這個結(jié)果和本實驗一致,表明耐力訓(xùn)練后機體自由基生成減少和/或消除自由基能力提高。而補充L-Arg能夠增加MDA生成,說明在肌肉內(nèi)NO的自由基損傷作用的確不容忽視。血清CK測試結(jié)果與MDA不同(表2:耐力訓(xùn)練后機體血清CK有降低的趨勢,這與MDA變化一致;但補充L-Arg后血清C K繼續(xù)顯著下降,并且這種趨勢

30、隨L-Arg劑量增加而更明顯,說明NO生成增加雖然增加了自由基損傷作用,但同時也可因為其增加骨骼肌血液流量等的作用而減少了其他因素(如缺氧、代謝廢物堆積、能量物質(zhì)供應(yīng)不足等對骨骼肌的損害10,其總體效應(yīng)是對骨骼肌有一定的保護作用。4 總結(jié)在耐力運動中NO能夠促進骨骼肌內(nèi)超氧化物自由基及其衍生物自由基的生成,較高濃度的NO 還能夠促進過氧化氫、過氧化物和脂質(zhì)氫等自由基的生成,對骨骼肌有一定的自由基損傷作用。但其上調(diào)血流量的保護作用能夠部分抵消其帶來的自由基損害作用。5 參考文獻1Koppenol WH.The basic chemistry of nitrogen monoxide andper

31、oxyni trite.Free Radic Biol Med,1998,25(4-5:385-391.2Wink DA,Mitchell B.Chemical biology of nitric oxide:in-sights into regulatory,cytotox ic and cytoprotective mechanis ms of ni tric oxide.Free Radic Biol Med,1998,25(4-5:434-456.3Squadrito GL,Pryor WA.Oxidative chemistry of ni tric ox ide:the roles

32、 of superoxide,peroxyni trite,and carbon diox ide.Free Radic Biol Med,1998,25(4-5:392-403.學(xué)報,2005,45(3:176-178.5B oyd CS,Cadenas E.Nitric ox ide and cell signaling pathwaysin mitochondrial-dependent apop tosis.Biol Chem,2002,383 (34:411-423.6Brune B,Zhou J,Von Knethen A.Nitric oxide,oxidativestress,and apoptosis.Kidney Int Suppl,2003,84:22-27.7Keynes RG,Garthwaite J.Nitric Oxide and its role in is-chaemic brain injury.Curr Mol Med,2004,4(2:179-191.8張漓,馮連世,宗丕芳.補