免疫實驗中國醫(yī)科大學臨床藥學

1、實驗安排實驗一、ELISA板包被，封閉；小鼠抗原免疫；補體結合實驗實驗二、小鼠脾細胞提取及計數(shù)實驗三、流式（測小鼠血T細胞）；NO測定； 雙擴；血型鑒定實驗四：ELISA；妊娠反應（試紙法）實驗一：ELISA板包被，封閉小鼠抗原免疫眼球取血（一）包被 、封閉ELISA反應板1. 實驗步驟：a. 微量加樣器的使用b. 包被ELISA 反應板 ，37孵育1小時。c. 封閉ELISA反應板 ，37孵育0.5小時。2. 實驗目的：檢測小鼠抗綿羊紅細胞抗體水平3. 試劑與器材：a. 包被稀釋液（0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 緩沖液，pH9.6）Na2CO3 1.5g；NaHCO3 2.9

2、g 加雙蒸水至1000mlb. 封閉液（5%小牛血清/PBS 溶液）小牛血清50ml；PBS（pH7.4）950mlc. 洗滌液（PBST，pH7.4）NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4.12H2O 2.9g；KCl 0.2g；Tween 20 0.5ml 加雙蒸水至1000ml4. 操作方法：包被酶標反應板：a. 待測血清：綿羊紅細胞（SRBC）免疫小鼠血清b. 用pH9.6 的碳酸鹽緩沖液1：200 稀釋的抗原SRBC，用之包被聚乙烯塑料板。c. 每孔加100ul， 37溫箱孵育1小時封閉酶標反應板d. 棄掉包被液，加入200ul PBS洗滌3 次，每孔洗3遍，每遍

3、1min。e. 甩干后用5%小牛血清/PBS 液封閉，每孔200ul。放370.5小時。f. 封閉結束后，棄掉封閉液，加入200ul PBS洗板3次，并在濾紙上拍干，每孔洗3遍，每遍1min。步驟說明：1. 酶聯(lián)免疫吸附試驗技術（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）（定量、定性實驗）：是在免疫酶技術(immunoenzymatic techniques)的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術,ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為【包被】，加待測抗體(抗原), 再加相應酶標記抗體(抗原),生成【抗原(抗體)-待測抗體(抗原)-酶標記抗體

4、】的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體(抗原)的量。待測抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)生成正比。2. 【包被】：就是將已知抗原或抗體吸附于固相載體表面并保持其免疫原性。在ELISA 板上加上抗原以后，因為電荷數(shù)與板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙；3. 【封閉】：就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而防止在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附原理：4. 抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫學活性; 5. 抗原或抗體可通過共價鍵與酶連接形成酶結合物,而此種酶結合

5、物仍能保持其免疫學和酶學活性; 6. 酶結合物與相應抗原或抗體結合后,可根據(jù)加入底物的顏色反應來判定是否有免疫反應的存在,而且顏色反應的深淺是與標本中相應抗原或抗體的量成正比例的,因此,可以按底物顯色的程度顯示試驗結果. 注意事項：1. 量取樣品時選擇適當量程的加樣器，（P20： 0.520.0 µl；P200： 20200 µl； P1000：2001000 µl）2. 安裝相應的槍頭（白色P20，黃色P200，藍色P1000）（2） 小鼠腹腔免疫1. 實驗動物：昆明鼠6-8周，雌性2. 實驗藥品：抗原：綿羊紅細胞（SRBC）3. 腹腔注射：5%的SRBC注射2

6、ml4. 操作步驟：免疫細胞的制備：準備適量的全血細胞：SRBC1500rpm*10min小心吸棄上清，留紅細胞沉淀3mL生理鹽水，重懸細胞沉淀重復上述步驟，反復洗3次。第三次離心后：3mL生理鹽水，重懸細胞沉淀：制備好的SRBC.腹腔注射：左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠頭略低于尾部。右手持注射器將針頭在下腹部靠近腹白線的兩側進行穿刺，針頭刺入皮膚后進針3mm左右。使注射針頭與皮膚呈45°角刺入腹肌，穿過腹肌進入腹膜腔，當針尖穿過腹肌進入腹膜腔后阻力消失，有落空感。固定針頭，保持針尖不動，回抽針栓，如無回血、腸液或尿液后即可注射。注射量為2ml，標記小鼠。5. 注意事項：免疫之

7、前排空注射器中的空氣；SRBC使用之前要混勻；.進針后的落空感。（3） 小鼠眼球取血1. 實驗目的：小鼠腹腔抗原（SRBC）免疫后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗體，抗體（抗SRBC抗體）主要存在于血清內(nèi)。眼球取血主要目的為收集血清。2. 實驗藥品：麻醉用藥：4%水合氯醛；3. 實驗步驟：a. 小鼠麻醉麻醉用藥：4%水合氯醛；用量：每只小鼠0.4ml，腹腔注射b. 眼球取血：1、抓取小鼠，使眼球突出2、用眼科【彎鑷】深入眼球深部，帶著結締組織，慢速夾去眼球，用1.5ml微量離心管接住流出的血液，每次采血量0.5-1ml 3、實驗臺上靜置2h（11點左右）4、離心10000rpm，10min，收集血清，-20

8、保存c. 把取完眼球血的小鼠泡在裝有70%酒精的燒杯中，接續(xù)【實驗三】d. 將眼球血離心10000rpm，10-15min， e. 使用1000L加樣器收集血清 （4）實驗二：補體結合試驗1. 實驗試劑：2% sRBC；溶血素（血清中含有家兔-抗-sRBC 抗體）；補體（新鮮的豚鼠血清）；生理鹽水2. 實驗器材：小試管、微量加樣器、水浴箱3. 實驗步驟：a. 標記3個清潔、干燥的試管b. 加樣（加樣順序如圖）c. 水浴，37，孵育10m4. 注意事項：a. 挑選干燥、潔凈是試管。若有水的試管會導致紅細胞不等滲溶血。b. 水浴箱不可關閉水浴箱的蓋子。水浴箱的蓋子上的水若調(diào)入試管中，會造成反應體系

9、不等滲，進而導致紅細胞因為滲透壓的差異而破裂溶血。5. 實驗結果：1號管中試劑變澄清，2.3號試管均渾濁實驗三：小鼠脾細胞提取及計數(shù)1. 實驗原理：脾臟是人類最大的免疫器官，捕獲血源性抗原，儲存血液。是動物體內(nèi)最大的淋巴器官。深居于左側肋弓之后，顏色暗紅、質(zhì)地柔軟、呈內(nèi)側向內(nèi)凹陷的扁橢圓形或條索狀等。脾為表面有被膜覆蓋的實體性器官。脾細胞主要成分：淋巴細胞，是執(zhí)行免疫功能的重要細胞。為進一步了解和檢測淋巴細胞的數(shù)量和功能，還需要制備脾細胞懸液。2. 實驗試劑與器材：SRBC免疫一周的小鼠（眼球取血后的死亡小鼠）；PBS液作用是等滲、平衡滲透壓、維持離子強度和PH；70%酒精作用是消毒紅細胞裂解

10、液2ml冷NH4Cl動物解剖器械平鑷和齒鑷、5ml注射器、平皿、1.5ml微量離心管、15ml離心管、吸管、蓋玻片。離心機，細胞計數(shù)板，顯微鏡3. 實驗步驟：a. 取脾：將眼球取血后的小鼠頸椎脫位法處死；70%酒精皮毛全部浸濕3-5分鐘，右側臥位；左手持鑷（尖頭）提起皮膚，右手持剪刀于左側肋骨最低點與髖關節(jié)間做一小切口 ；雙手持鑷子與切口垂直方向鈍性分離皮膚，暴露腹膜；左手持鑷提起腹膜右手持剪刀于腹膜做一小切口，雙手持鑷子與切口垂直方向鈍性分離腹膜，充分暴露視野，于左側肋緣下可見暗紅色條索狀脾臟；持【平鑷】輕輕夾住脾臟，盡可能分離結締組織和系膜（注意防止脾臟破裂）；將取下的脾臟放入裝有5mlP

11、BS液的平皿中。b. 脾細胞提?。悍椒_洗法研磨法優(yōu)點制備的細胞數(shù)比較少，細胞比較分散；能夠保持細胞的完整性，細胞不易破損省時，便于大量操作缺點不能保證細胞的完整性平鑷輕輕夾住脾，用5毫升注射器吸取5mlPBS液，刺入脾臟沖洗脾細胞；拔掉針頭用注射器吸取平皿中PBS液反復沖洗2-4次，直至脾臟由暗紅色變?yōu)榘咨?；把所獲得的細胞懸液收集到15毫升離心管內(nèi)，加PBS液至10ml（方便離心時配平）；c. 三次離心目的操作獲得脾細胞收集離心管配平，1500rpm離心10min。去上清（沉淀貼壁面朝上傾倒上清）裂解紅細胞使用吸管（每吸一次大約1ml）吸取2ml冷NH4Cl裂解RBC?！净靹颉考毎蠓胖眉s5

12、min。加PBS液至10ml；1500r/min再離心5min，去上清洗滌細胞加PBS液5ml洗滌（上下吹打），1500r/min離心10min去上清 。懸浮細胞于1ml的PBS液中【混勻】。d. 棄上清，向離心管中加入1ml PBS液，充分混勻，得混勻液e. 計數(shù)液100倍稀釋：先在EP管里加入990微升PBS液，從混勻液中吸取10微升加入到1.5ml微量離心管中涮一下槍頭，反復抽吸幾次，充分混勻。f. 顯微鏡計數(shù)：10×物鏡找到細胞層和計數(shù)室；40×物鏡找到白細胞計數(shù)區(qū)域。原則是從左到右S形計數(shù)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右實驗四：抗原抗體反應1. 實驗原理：a. 概念：體內(nèi)

13、外發(fā)生的高度特異性結合反應，其結構基礎為抗原表位與抗體超變區(qū)抗原結合位點的結構互補。b. 特點：特異性；非共價鍵結合；比例要適當c. 影響抗原-抗體反應的因素：電解質(zhì)：0.85%氯化鈉溶液；溫度：37；酸堿度：pH6-8?？乖贵w復合物可在一定條件下解離，而免疫學特性不變。d. 凝集反應：在顆粒性抗原或吸附于顆粒上的可溶性抗原（或抗體）中加入相應的抗體（或抗原），在電解質(zhì)存在的條件下出現(xiàn)凝集物的現(xiàn)象，稱凝集反應。參與反應的抗原如細菌，細胞等，稱凝集原，抗體稱為凝集素。包括直接凝集反應（玻片反應、試管反應）和間接凝集反應。本次實驗為玻片反應。e. 凝集反應分類：直接凝集反應：試管法和玻片法（反應

14、界面） 間接凝集反應 間接凝集抑制試驗 協(xié)同凝集反應 抗球蛋白試驗玻片法簡便，快速，為定性試驗，可做為半定量檢測前的篩查試驗，因該反應在玻片上進行而被命名玻片法 ，主要用于臨床的血型鑒定，菌種鑒定 2. 實驗器材：人外周血；抗A、抗B標準血清；（藍色的為抗A，黃色的為抗B）；玻片（兩種），采血針，棉簽，酒精等3. 實驗步驟：a. 準備玻片：取清潔載物玻片一張，于玻片左側和右側各加一滴抗A及抗B標準血清b. 采血：用無菌采血針刺破指尖或耳垂，用滅菌玻片的四個角（取2個即可）分別取血，加入含有抗A及抗B標準血清的液體中c. 反應：經(jīng)12 分鐘后用肉眼觀察結果，出現(xiàn)紅細胞凝集顆粒者即為陽性反應；仍為

15、均勻混懸液者為陰性反應。實驗五：雙向免疫擴散實驗1. 實驗原理：在含有電解質(zhì)的凝膠中，可溶性抗原和相應抗體輻射擴散，形成濃度梯度，在比例適合處形成肉眼可見的白色沉淀線。一條沉淀線為一組特異性抗原抗體復合物。2. 結果分析：a. 沉淀線數(shù)量：對抗原抗體復合物只形成一條沉淀線；b. 沉淀線形狀：沉淀線對于相應的抗原抗體是不可以通透的，對無關的抗原抗體是可以通透的；沉淀線的外形與反應物的分子量有關，通常趨向分子量較大的一方 c. 沉淀線位置：與反應物的相對濃度有關，通?？拷鼭舛刃〉囊环?. 實驗目的：檢測病人血清中的甲胎蛋白（AFP）4. 實驗試劑與器材：待測病人血清：待測1，待測2；陽性對照血清（

16、p）；抗AFP診斷血清；1.5食鹽瓊脂；瓊脂板、打孔器，微量加樣器，濕盒5. 實驗步驟：a. 第一步：鋪板將4ml瓊脂倒入瓊脂板中。b. 第二步：打孔打7個小孔,約7mm間距。c. 第三步：加樣每空加樣約1015l。d. 第四步：孵育放入37溫箱孵育約24小時。6. 注意事項：倒膠要快速；打孔無裂縫；孔勿靠近瓊脂邊緣；加樣不溢出；加樣無氣泡；清洗加樣器1P2Ab12P7mm7. 結果分析：陽性對照孔和樣品孔分別與SRBC小孔之間出現(xiàn)白色沉淀線。兩條沉淀線相會后融合在一起，說明樣品孔與陽性對照孔為相同成分。實驗六：小鼠巨噬細胞NO的測定1. 實驗試劑與材料：NaNO2標準品（100M）；1640

17、培養(yǎng)液；待測樣品（1，2）； Griess試劑：使用之前兩液等量混合【NED 0.2% (0.02g2.5H3PO4 10ml )用超聲波溶解，SA 2%(0.2g2.5% H3PO4 10ml ) 】；微量加樣器、槍頭、板條。2. 實驗原理：a. 巨噬細胞功能：強大的吞噬殺傷病原微生物的能力；重要的抗原提呈細胞，可攝取、加工處理及提呈抗原，激發(fā)適應性免疫應答；活化的巨噬細胞分泌大量細胞因子、補體成分及NO等，調(diào)控免疫應答。b. 誘導型NO合成酶（iNOS）系統(tǒng)為巨噬細胞活化后所產(chǎn)生的反應性氮中間物。iNOS屬胞漿酶，在還原型輔酶II或四氫生物蝶呤存在下，可催化L-精氨酸與氧分子反應，生成胍氨

18、酸和NO。NO與吞噬細胞氧化酶所產(chǎn)生的過氧化氫或過氧化物酶結合，在體內(nèi)酸性環(huán)境中產(chǎn)生可殺傷細菌的過（氧化）亞硝酸鹽基，其在酸性環(huán)境中與Griess試劑中的磺胺和N-奈基乙二胺雙氯化物進行重氮、偶氮反應，產(chǎn)生鮮艷橙紅色產(chǎn)物。因此通過Griess法檢測NO的水平來反映巨噬細胞的活化程度。3. 實驗步驟：a. 于孔28中每孔加入100l 1640培養(yǎng)液b. 于孔1中加入200l NaNO2標準品c. 從孔1中吸出100l 加入2中，吹吸3次，再從2中吸出100l 加入3中，吹吸3次，再從3中吸出100l 加入4中，吹吸3次，以此類推，直至第7孔，混勻后吸取100l 棄掉。d. 于9和10中加入待測1

19、，11和12中加入待測2，每孔100l e. Griess試劑，每孔100l，室溫10分鐘，觀測結果實驗七：小鼠外周血T細胞亞群的鑒定流式細胞術1. 實驗原理：a. 流式細胞術：（FlowCytometry，F(xiàn)CM）利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術。b. 流式細胞儀特點：特異性好；靈敏度高（一般能測出單個細胞上<600個熒光分子,兩個細胞間的熒光差5%即可區(qū)分）；多參數(shù)分析（細胞大小，胞內(nèi)顆粒豐富程度，熒光強弱）；快速采集分析（每秒可檢測1000-5000細胞，甚至上萬個細胞）；客觀性；流式細胞

20、儀的分選速度：一般流式細胞儀分選速度1000個/秒，分選細胞純度可達99%以上c. 流式細胞儀工作原理：將待測標本制備成單細胞懸液,經(jīng)熒光標記抗體染色后由氣壓裝置送入流動室。流動室由樣品管和鞘液管組成,鞘液管充滿流動的鞘液,鞘液流與樣品流壓力不等,當兩者壓力差達到一定程度時,鞘液裹挾著樣品流迫使細胞有序地排列成單列,逐個進入激光聚焦區(qū)經(jīng)激光束激發(fā),產(chǎn)生散射光和熒光信號；通過一些波長選擇通透性濾光片,即可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開來。散射光和熒光信號接收后轉換成數(shù)字信號送計算機處理,可在計算機上直觀地統(tǒng)計染上各種熒光染料的細胞各自的百分率。d. 流式細胞儀應用： 分選細胞（嚴格無菌操作）；分析細胞大小和內(nèi)部復雜程度 （顆粒性）；檢測細胞表面表型: 抗細胞表面抗原抗體, MHC 四聚體等；透