白色鏈霉菌PL3-6菌株產(chǎn)聚賴(lài)氨酸發(fā)酵條件研究

1、2008屆畢業(yè)生畢業(yè)論文題 目: 白色鏈霉菌PL3-6菌株產(chǎn)聚賴(lài)氨酸發(fā)酵條件研究 院系名稱(chēng)： 生物工程 專(zhuān)業(yè)班級(jí)： 生物工程0402班 學(xué)生姓名： 趙愛(ài)霞 學(xué) 號(hào)： 指導(dǎo)教師： 惠明、田青 教師職稱(chēng)： 副教授、助教 2008年 06月 01日摘 要-聚賴(lài)氨酸(-Poly-L-Lysine)是由微生物發(fā)酵合成的一種由賴(lài)氨酸單體通過(guò)-酞胺鍵形成的多膚。-PL 具有優(yōu)良的抑菌作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌、酵母和一些病毒都有抑制作用，而且兼有水溶性好、熱穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的一株白色鏈霉菌Streptomyces albulus PL3-6 發(fā)酵產(chǎn)-聚賴(lài)氨酸(-PL) 的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了

2、優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)-PL 的優(yōu)化培養(yǎng)基為:葡萄糖 3.0 g·L-1、酵母粉 0.5 g·L- 1、(N H4)2SO4 1.2 g·L- 1、KH2 PO4 0.20g·L-1、 K2HPO4 0.12 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.05 g·L- 1、FeSO4·7H2O 0.003 g·L- 1、ZnSO4·7H2O 0.008 g·L- 1。在優(yōu)化培養(yǎng)基下，-PL 搖瓶產(chǎn)量達(dá)到4.05 g·L- 1 ，比優(yōu)化前提高了25 %。采用 D152 弱酸性陽(yáng)離子

3、交換樹(shù)脂(H型)對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)的-聚賴(lài)氨酸進(jìn)行了分離提取。參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)了合理的工藝流程。離心分離發(fā)酵(pH3.2 )，調(diào)節(jié)濾液的pH值到8.5，過(guò)濾除去沉淀。濾液通過(guò)D152 離子交換柱(H型)，用水和0.2 N 醋酸洗滌，用0.1N 的鹽酸洗脫。用1N的NaOH 調(diào)節(jié)洗脫液的pH 值到6.5，加入活性炭脫色后濃縮到小體積。加入乙醇和乙醚的混合物(體積比2:1)后，析出白色晶體。關(guān)鍵詞： -聚賴(lài)氨酸 白色鏈霉菌 發(fā)酵條件 提取 離子交換Title The study on ferment condition of Streptomyces albulus PL3-6 produced -PL A

4、bstract-Poly-L-Lysine is comprised of lysine linked by amide bond through microbial fermentation. It has excellent antibacterial activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria, yeast and some kinds of viruses. In additional -Poly-L-Lysine is soluble and attractive heat stable. The ferment

5、ation medium of Streptomyces albulus producing -poly-L-Lysine was optimized by orthogonal experiments. The optimal medium consisted of 3.0 g·L- 1 glucose, 0.5 g·L- 1 yeast extract, 1.2 g·L-1 (NH4)2SO4， 0.20 g·L-1 KH2PO4, 0.12 g·L-1 K2HPO4, 0.05 g·L-1 MgSO4·7H2O, 0.

6、003 g·L-1 FeSO4·7H2O and 0.008 g·L-1 ZnSO4·7H2O. The yield of -PL reached 4.05 g·L-1with optimal medium, which increased 25% compared to initial medium. The separation and extraction of -Poly-L-Lysine from fermentation liquid by using weak acid anion-exchange resin D152 .The

7、 culture broth (pH3.2) was filtered and the filtrate was adjusted to pH8.5. Then, the precipitate formed was removed by filtration. The filtrate was applied on a column of weak acid anion-exchange resin D152 (H+-from) and washed with 0.2 N acetic acid and water, successively. The substance was elute

8、d with 0.1N hydrochloric acid. The eluate was neutralized with 1N sodium hydroxide and decolorized with active charcoal, and then evaporated to a small volume .The substance was precipitated as a white powder by addition of an ethanol and ether (2:1) mixture. Keywords: -Poly-L-Lysine; Streptomyces a

9、lbulus; ferment condition; extraction ion exchange resins目 次1 引言 11.1 -聚賴(lài)氨酸 11.2 物理和化學(xué)性質(zhì) 11.3 聚賴(lài)氨酸的發(fā)酵生產(chǎn) 21.4 研究?jī)r(jià)值 32 材料與方法 52.1 材料 52.1.1 菌種 52.1.2 試劑 62.1.3 相關(guān)溶液及其配制 62.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 72.2 方法72.2.1 菌種的分離與純化 72.2.2 培養(yǎng)方法 82.2.3 分析方法 82.2.4 提取方法 92.2.5 驗(yàn)證方法 93 結(jié)果與討論103.1 -PL標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 103.2 碳氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 103.3 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化

10、實(shí)驗(yàn) 123.4 -PL的提取 143.4.1 發(fā)酵液的預(yù)處理 143.4.2 離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理 153.4.3 離子交換提取 163.4.4 發(fā)酵液的紫外吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 163.4.5 -聚賴(lài)氨酸組成定性分析 17結(jié)論 18致謝 19參考文獻(xiàn)201 引言隨著人們生活水平的提高和健康意識(shí)的加強(qiáng)，對(duì)食品品質(zhì)提出了更高的要求，除了食品的營(yíng)養(yǎng)、感官和外觀包裝外，食品的食用安全性更為人們所關(guān)注。由于食品的特殊性，對(duì)其防腐保鮮一直是食品研究中的重要方面。長(zhǎng)期以來(lái)，由于受到經(jīng)濟(jì)環(huán)境和開(kāi)發(fā)水平的制約，幾乎所有的食品都采用化學(xué)合成防腐劑來(lái)延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期。化學(xué)防腐劑如果超劑量使用會(huì)產(chǎn)生累積毒素和致癌作用，

11、存在局限性。因此，安全、廣譜、高效及經(jīng)濟(jì)實(shí)用的天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)成為食品防腐領(lǐng)域發(fā)展的趨勢(shì)和要求。微生物食品防腐劑是天然防腐劑中的一大類(lèi)，其是指通過(guò)微生物發(fā)酵的方法，從發(fā)酵液中提取分離得到有抑菌作用的物質(zhì)，主要為多膚類(lèi)物質(zhì)。目前，國(guó)際上批準(zhǔn)使用的微生物食品防腐劑僅有乳酸鏈球菌素(Nisin)和納他霉素(Natamycin)。我國(guó)分別于1990年和1996年批準(zhǔn)上述兩種微生物防腐劑用于食品防腐保鮮。另外，-聚賴(lài)氨酸也是一種抑菌效果明顯的微生物食品防腐劑，其在日本應(yīng)用廣泛，在我國(guó)的研究才剛剛起步。由于這三種微生物防腐劑安全無(wú)毒、抑菌作用強(qiáng)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。11 -聚賴(lài)氨酸1977年

12、日本學(xué)者S.shima和H.sakai1從放線菌培養(yǎng)過(guò)濾液中提取出一種含有2530個(gè)賴(lài)氨酸殘基的同型單體聚合物。這種賴(lài)氨酸聚合物是賴(lài)氨酸殘基通過(guò)-梭基和-氨基形成的酞胺鍵連接而成，故稱(chēng)為-多聚賴(lài)氨酸(-PL)。實(shí)際上多聚賴(lài)氨酸的合成是早在1947年由K.L.Eprain首先完成的2但是化學(xué)法合成的聚賴(lài)氨酸為型，其賴(lài)氨酸殘基之間的酞胺鍵是由-氨基和-梭基縮合而成，研究也證明了-PL比-聚賴(lài)氨酸抑菌活性差且有毒性，因此目前在國(guó)際市場(chǎng)上。-聚賴(lài)氨酸作為食品防腐劑已經(jīng)取代了-多聚賴(lài)氨酸3。12 物理和化學(xué)性質(zhì)-聚賴(lài)氨酸是一種含有2530個(gè)賴(lài)氨酸殘基的同型單體聚合物多肽。賴(lài)氨酸殘基通過(guò)-羧基和-氨基形成

13、的酰胺鍵連接4。具有高抑菌活性-聚賴(lài)氨酸的分子量在36004300之間，當(dāng)分子量低于1300時(shí)，-聚賴(lài)氨酸失去抑菌活性。紅外光譜分析表明: -聚賴(lài)氨酸在16801640cm-1和15801520cm-1有強(qiáng)吸收峰5。H-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH-CO n-OH-聚賴(lài)氨酸結(jié)構(gòu)式 NH2-聚賴(lài)氨酸帶正電荷，可以和陰離子物質(zhì)發(fā)生結(jié)合；沒(méi)有固定的熔點(diǎn)，250以上開(kāi)始軟化分解；易溶于水、乙醇，但不溶于乙酸乙醋、乙醚等有機(jī)溶劑；能夠承受一般食品加工過(guò)程中的熱處理，熱穩(wěn)定性高，120加熱10min 仍具有抑菌活性17，可以隨原料一同進(jìn)行滅菌處理，防止二次污染；-聚賴(lài)氨酸經(jīng)6N HCl 酸解

14、24h后，測(cè)其賴(lài)氨酸的旋光度為23.8°，表明每個(gè)殘基上攜帶1mol HCl和水6。-PL抑菌的最適pH 58，也就是說(shuō)其在中性和微酸性環(huán)境中有較強(qiáng)的抑菌性，而在酸性和堿性條件下，抑菌效果不太理想。可能由于聚賴(lài)氨酸作為賴(lài)氨酸的聚合物，在酸性和堿性條件下易分解7。-PL 作為一種濃縮膠質(zhì)溶液的交聯(lián)劑，它的效力對(duì)pH和膠質(zhì)分布有依賴(lài)性。在膠質(zhì)中，陽(yáng)離子電荷與陰離子縮氨酸聚合物的平衡導(dǎo)致了膠體的不透明性和最終導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的崩潰。在pH接近中性的時(shí)候，L-聚賴(lài)氨酸可以作為一種有效的膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)劑8。13 聚賴(lài)氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)最初用野生的S . albulus 346進(jìn)行發(fā)酵的研究中，-PL在最

15、優(yōu)化的培養(yǎng)基中的積累濃度是0.5 g/L。在發(fā)酵過(guò)程中，-PL 的最大積累濃度開(kāi)始于pH 值6.0。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，培養(yǎng)基pH 值的降低是-PL 生產(chǎn)的關(guān)鍵(pH值3.05.0)。在發(fā)酵過(guò)程中，在培養(yǎng)基中添加L-賴(lài)氨酸對(duì)-PL 的生產(chǎn)沒(méi)有影響后，Shima 等發(fā)現(xiàn)給靜止的細(xì)胞中添加葡萄糖和硫酸銨作為培養(yǎng)基，且在酸性pH 值的條件下，-PL的積累量可達(dá)45 g/ L 。-PL在pH 值5.06.0時(shí)產(chǎn)量迅速下降，說(shuō)明S . albulus 中含有-PL降解酶。為了提高-PL 的生產(chǎn)力，Hiraki等在S .albulus 346 中篩選出對(duì)S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸(Glycine)

16、 有抵抗力的變種。在野生種346中，L-賴(lài)氨酸會(huì)導(dǎo)致天冬氨酸激酶合成的部分抑制，這種酶是L-賴(lài)氨酸生物合成的關(guān)鍵酶，而甘氨酸可以抑制這種酶的活性。S-2-氨乙基半胱氨酸是L-賴(lài)氨酸的類(lèi)似物，在2 mg/mL S-2-氨乙基半胱氨酸存在的情況下， S . albulus 346 的生長(zhǎng)不會(huì)被抑制；進(jìn)一步增加甘氨酸到1 mg/mL會(huì)抑制其生長(zhǎng)。在對(duì)S-2-氨乙基半胱氨酸和甘氨酸耐受性的菌種中，90% 是-PL的高產(chǎn)菌。其中之一(11011A)在測(cè)試管中的最大生產(chǎn)量是2.11 mg/mL ，是野生種346 的10倍。這個(gè)變種有很高的天冬氨酸激酶活性。在3 L搖瓶發(fā)酵罐中，以pH控制、葡萄糖和硫酸銨流

17、加補(bǔ)料的方法， S . aLbuLus11011A在120 h 內(nèi)靠吸收葡萄糖的收益可達(dá)20 mg/ mL (8.9%) 。Kahar 等論證了利用S . albulus 410 生產(chǎn)-PL 中嚴(yán)格控制pH值和葡萄糖濃度的重要性9。在-PL 發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)基的pH 值通常會(huì)從最初的6. 8 降到36 h 后的4.2，然后96 h 內(nèi)逐漸降到3.2。在pH 值低于4.2后，-PL開(kāi)始逐漸在培養(yǎng)基中積累，所以在-PL的生產(chǎn)中嚴(yán)格控制pH 值是有必要的。pH值的控制分2個(gè)階段，第1階段為菌體的生長(zhǎng)階段，pH 值大于5.0 (培養(yǎng)過(guò)程pH值自然下降，當(dāng)?shù)陀?.0時(shí)，用氨水調(diào)節(jié)) ；第2階段為產(chǎn)物積累

18、階段，pH 值控制在4.0。在發(fā)酵過(guò)程中， 發(fā)酵液的葡萄糖濃度控制在10 g/L ，當(dāng)葡萄糖濃度低于10 g/L 時(shí)，流加碳源和氮源(含有80%葡萄糖和8%硫酸銨的培養(yǎng)基) ，使葡萄糖濃度維持在10 g/L(一般在48 h后) ，經(jīng)過(guò)47 d 的發(fā)酵，-PL的產(chǎn)率最高達(dá)48.3 g/L。迄今為止-聚賴(lài)氨酸的微生物發(fā)酵在日本已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，年銷(xiāo)售量為1000 t。但在我國(guó)還處于實(shí)驗(yàn)室階段，小試和中試采用易操作的分批發(fā)酵。14 研究?jī)r(jià)值隨著人們對(duì)食品安全性的認(rèn)識(shí)和要求的逐步提高，化學(xué)防腐劑受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，食品防霉防腐劑的天然化已成為今后的發(fā)展趨勢(shì)。天然防霉防腐劑是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外倡導(dǎo)、開(kāi)發(fā)和尋求的新型產(chǎn)品

19、，開(kāi)發(fā)抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒的天然防霉防腐劑已成為各國(guó)科技工作者的研究熱點(diǎn)。它不但對(duì)人體健康無(wú)害，有的還具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是今后開(kāi)發(fā)的方向。目前，國(guó)外食品防腐劑行業(yè)已相當(dāng)成熟，開(kāi)發(fā)出了數(shù)十種天然食品防腐劑，建立了完備的法規(guī)。國(guó)內(nèi)對(duì)天然食品防腐劑的研究起步較晚，目前尚屬初級(jí)階段，為適應(yīng)市場(chǎng)需求，國(guó)內(nèi)學(xué)者也做了大量的工作。21世紀(jì)是"綠色"的世紀(jì)，是追求食品安全與可持續(xù)發(fā)展的世紀(jì)。因此，開(kāi)發(fā)綠色食品、有機(jī)食品成為提高經(jīng)濟(jì)效益，增加市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，提高人民生活質(zhì)量的重要舉措。隨著人民生活水平的進(jìn)一步提高，天然食品防腐劑在食品加工保藏過(guò)程中將被廣泛使用。生物技術(shù)的飛速發(fā)展，為開(kāi)發(fā)、應(yīng)用天

20、然食品防腐劑開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。至今-PL 發(fā)酵生產(chǎn)的研究已歷經(jīng)幾十年，目前雖然-PL 發(fā)酵生產(chǎn)已在日本實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，-PL 作為一種天然、無(wú)毒、可生物降解的聚氨基酸，不僅在食品工業(yè)有廣泛的應(yīng)用，而且其在醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用也將不斷拓開(kāi)。-聚賴(lài)氨酸在目前的日本添加劑目錄表中屬于一種天然添加劑，1989年日本窒素公司首先用生物技術(shù)方法工業(yè)化生產(chǎn)聚賴(lài)氨酸，同年，日本在添加劑目錄表中把-PL歸屬于一種天然添加劑，并允許使用。以后韓國(guó)也允許作為食品添加劑使用。在美國(guó)和歐洲，主要是使用山梨酸作為防腐劑，但自2003年7月10日FDA 收到日本窒素公司的申請(qǐng)后，目前已正式批準(zhǔn)(GRAS Notice

21、NoGRN 000135)該公司生產(chǎn)的的-PL 作為天然食品添加劑。該公司還將逐步把-PL的應(yīng)用拓展至纖維、化妝品及其他貨品，甚至把-PL 作為抗菌材料用于廚房及浴室用具中。國(guó)內(nèi)對(duì)-聚賴(lài)氨酸的應(yīng)用處于研發(fā)階段，有關(guān)- PL在醫(yī)藥和基因芯片領(lǐng)域的應(yīng)用研究開(kāi)展得較多，在食品方面目前尚未列入使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。因此，-聚賴(lài)氨酸的研究及食品防腐劑的應(yīng)用具有廣闊的前景和發(fā)展空間，- PL 獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)可以應(yīng)用到除了食品工業(yè)以外的其他很多領(lǐng)域，所以將來(lái)-PL 會(huì)有巨大的需求。今后的研究重點(diǎn)是篩選到產(chǎn)聚賴(lài)氨酸的菌株，對(duì)其進(jìn)行改造，大幅度提高產(chǎn)量；并加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，揭示其抑菌機(jī)理，同時(shí)加強(qiáng)應(yīng)用研究。2 材料與方

22、法21 材料2.1.1 菌種白色鏈霉菌（Streptomyces albulus） 實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。2.1.2 試劑藥品名稱(chēng)生產(chǎn)廠商無(wú)水葡萄糖中國(guó)派尼化學(xué)試劑廠·鄭州(NH4)2SO4天津市化學(xué)試劑三廠酵母膏北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠蛋白胨北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠牛肉膏北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司ZnSO4·7H2O洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠FeSO4·7H2O上海第二鋼鐵廠MgSO4·7H2O洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠NaH2PO4洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠Na2HPO4天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心KH2PO4天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心K2HPO4天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心

23、甲基橙天津市化學(xué)試劑一廠鹽酸洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠醋酸開(kāi)封化學(xué)試劑總廠乙醇洛陽(yáng)吳華化學(xué)試劑有限公司磷酸開(kāi)封開(kāi)化有限公司NaOH天津市化學(xué)試劑廠丙酮洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠甲醛洛陽(yáng)市化學(xué)試劑廠茚三酮天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心-聚賴(lài)氨酸SIGMA(固體標(biāo)準(zhǔn)品)2.1.3 相關(guān)溶液及其配制10（1）0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖溶液的配置取62.5 mL 的0.2 mol/L 的NaH2PO4 溶液和37.5 mL 的0.2 mol/L 的Na2HPO4 混合即得到0.1 mol/L 磷酸鈉緩沖溶液。（2）1 mmol/L 甲基橙溶液 稱(chēng)取0.0327 g 甲基橙定容于100 mL 磷酸鈉緩沖溶液中。（3）1 m

24、ol/L 和0.1mol/L 鹽酸溶液 1 mol/LHCl：量取90 mL 的36%-37%濃度的HCl 定容于1000 mL 蒸餾水中。 0.1 mol/LHCl：量取9 mL 的36%-37%濃度的HCl 定容于1000 mL 蒸餾水中。（4）1 N和5 N的NaOH溶液 1 N 的NaOH 溶液：稱(chēng)取40 g NaOH 固體定容于1000 mL 蒸餾水中。 5 N 的NaOH 溶液：稱(chēng)取10 g NaOH 固體定容于50 mL 蒸餾水中。（5）0.2 N 的醋酸溶液 稱(chēng)取質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.5% 的濃醋酸定容與500 mL 蒸餾水中。（6）0.1% 磷酸溶液 量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85% 的磷酸

25、定容于1000 mL 蒸餾水中。2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器儀器名稱(chēng)生產(chǎn)廠商723N可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海申安醫(yī)療器械廠752紫外光柵分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司PYXDHS40X50BS 電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠GZXGFMBS1（9053A）電熱鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠LD5-2A型低速離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠pHSJ-4A型數(shù)字PH計(jì)上海雷磁儀器廠LDZX50FB立式高壓蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠TGL16C臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠FA12048電子天平上海精密科技有限公司THZ-30恒溫培養(yǎng)搖床上海-恒科學(xué)儀器有限公司超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司SWCJ2F型雙人雙面凈化

26、工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠2.1.5 培養(yǎng)基11（1）高氏一號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉 2 g，K2HPO4 0.05 g，MgSO4 7H2O 0.05 g，KNO3 0.1 g，NaCL 0.05 g，F(xiàn)eSO4 7H2O 0.001 g，瓊脂 1.5 g，水 1000mL， PH值 7.2 （2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏 2 g， 蛋白胨 10 g， NaCl 5 g，瓊脂 15 g， 水1000 mL（3）貝特納培養(yǎng)基葡萄糖 1 g/L， ，蛋白胨 0.2 g/L，酵母膏 0.1 g/L，瓊脂 1.5 g/L，pH值 7.5（4）種子培養(yǎng)基 葡萄糖 5 g

27、/L，酵母膏 0.5 g/L，(NH4)2SO4 1 g/L，KH2PO4 0.6 g/L， K2HPO4 0.8 g/L，MgSO4 7H2O 0.02 g/L，F(xiàn)eSO4 7H2O 0.02 g/L，pH值 6.8（5） 發(fā)酵培養(yǎng)基 基本組成與種子培養(yǎng)基相同。在培養(yǎng)基碳氮源的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中 ，碳氮源含量按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行 ，無(wú)機(jī)鹽的含量同種子培養(yǎng)基。在碳氮源最有條件下進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化，在無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，碳氮源按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)最有條件配制。22 方法2.2.1 菌種的分離與純化11（1） 保藏菌種的活化與稀釋涂布取一環(huán)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株按10-1用無(wú)菌水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)〔煌瑵舛鹊木鷳?.1 m

28、L裝有15 mL左右的貝特納培養(yǎng)基的平板上，30倒置培養(yǎng)34 d。再挑取菌落較大的進(jìn)行劃線分離。如圖1：（2） 抑菌圈法 圖1 聚賴(lài)氨酸劃線平板 底層鋪10 mL下層培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的單菌落點(diǎn)接至培養(yǎng)基上，30下培養(yǎng)2 d，將上層培養(yǎng)基冷卻至50左右，加入10%敏感菌培養(yǎng)液搖勻，去10 mL鋪于底層培養(yǎng)基上。點(diǎn)解菌落間距要足夠大，以免抑菌圈互相重疊。將平板于30恒溫培養(yǎng)24 h，出現(xiàn)邊緣清晰的抑菌圈。（3） 單菌落分離純化 挑選抑菌圈較大的菌落轉(zhuǎn)接到貝特納斜面培養(yǎng)基，30恒溫培養(yǎng)7 d，待斜面完全被孢子覆蓋，冰箱（4）保存?zhèn)溆?。如圖2：2.2.2 培養(yǎng)方法 （1） 種子培養(yǎng)液的制備 圖 PL3

29、-6菌株斜面 取1環(huán)斜面菌種于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30、220r·min-1菌培養(yǎng)24 h得到種子培養(yǎng)液。如圖3、圖4：圖 種子培養(yǎng)液 圖 培養(yǎng)后的種子液（2） 發(fā)酵培養(yǎng) 以1%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30，220 rmin-1條件下培養(yǎng)72 h。如圖5、圖6： 圖 發(fā)酵培養(yǎng)基圖 發(fā)酵完成液2.2.3 分析方法（1） 發(fā)酵液pH的測(cè)定 將發(fā)酵液4000 r/min離心8 min，上清液采用pHSJ-4型pH計(jì)測(cè)定。（2） -PL產(chǎn)量的測(cè)定發(fā)酵液中-PL產(chǎn)量的測(cè)定： 采用Itzhaki方法12 測(cè)定-PL產(chǎn)量

30、。測(cè)定前先將從水中重結(jié)晶的甲基橙溶于pH值為6.6的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制成濃度為1 mmol/L的溶液。將1.9 mL的磷酸鹽緩沖液和2.0 mL、1 mmol/L甲基橙溶液依次加入到0.1 mL發(fā)酵液上清液中，所得混合物在30條件下劇烈震蕩，反應(yīng)30 min；然后4000 r/min離心15 min，除去產(chǎn)生的-PL與甲基橙形成的復(fù)合物。取上清液1 mL用磷酸鈉緩沖液稀釋至50 mL，在465 nm處測(cè)吸光度。2.2.4 提取方法 采用 D152弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(H型)對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)的-聚賴(lài)氨酸進(jìn)行了分離提取。2.2.5 驗(yàn)證方法13 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行紫外掃描，測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)

31、；通過(guò)水解洗脫濃縮液中的聚賴(lài)氨酸經(jīng)行紙層析，與標(biāo)準(zhǔn)賴(lài)氨酸的遷移率作對(duì)比。3 結(jié)果與討論3.1 -PL標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制聚賴(lài)氨酸的溴化物，甲基橙從水中重結(jié)晶，并干燥至恒重，實(shí)驗(yàn)前將兩者溶于pH值為6.6的0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液中。取2 mL不同濃度的聚賴(lài)氨酸溶液（0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1 mg/L）與2 mL、1 mmol/L的甲基橙混合，混合液震蕩反應(yīng)30 min，4000 r/min條件下離心15 min，取上清液稀釋至50 mL，以磷酸緩沖液為空白樣，在465 nm下測(cè)其吸光度A465。 表1 不同濃度下-PL的吸光度 Tab.1 Th

32、e absorbency of -PL in different concentration X0.3850.3050.2440.1690.114Y0.20.40.60.81 3.2 碳氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在Streptomyces albulus PL3-6產(chǎn)聚賴(lài)氨酸的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果上，選取葡萄糖量、(NH4)2SO4含量和酵母膏含量三個(gè)因素，利用正交表L9(34)進(jìn)行3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果和分析如表1表3所示。表2 碳氮源優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)L9 (34)因素水平表(g/L)Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment L9 (34)

33、foroptimizing carbon and nitrogen sources (g/L)水平A.葡萄糖含量B.(NH4)2SO4含量酵母膏含量1233.05.07.00.40.81.20.30.50.7表3 碳氮源優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)L9 (34)結(jié)果Tab.3 Results of orthogonal experiment L9 (34) for optimizing carbon and nitrogen sources試驗(yàn)號(hào)ABCY-PL產(chǎn)量/(g/L)1234 56789K1K2K3RKi21112223339.6109.3418.0900.506245.0541231231238.5

34、208.7559.7660.415244.6151232313128.5609.5338.9480.325244.2182.8873.2603.4633.1533.0053.1832.4802.4903.120Yi = 27.041Yi 2 = 82.143以n表示試驗(yàn)的總次數(shù)，a、b、c表示A、B、C三因素每個(gè)水平的重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)，則有 n=9, a=3，b=3，c=3.先計(jì)算 2=(xi)2=×27.0412=81.246，QA= (Ki2)- 2 =×245.054-81.246=0.439，QB= (Ki2)- 2 =×244.615-81.246=0.29

35、2，QC= (Ki2)- 2 =×244.218-81.246=0.160.而 Q總=Xi2- 2=82.143-81.246=0.897于是 誤差：Qe= Q總-（ QA + QB + QC）=0.897-（0.439+0.292+0.160）=0.006每個(gè)因素的自由度為水平數(shù)減1，Q總的自由度為n-1，列出方差分析表如下：表4 碳氮源優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)L9 (34)方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment L9 (34) foroptimizing carbon and nitrogen sources方差來(lái)源平均和自由

36、度均方差F值顯著性ABC誤總和0.4390.2920.1600.0060.897222280.21950.14600.08000.003073.16748.66726.6發(fā)67* * * *注：查F臨界值表 F0.1( 2，2 ) = 9.00 F0.05( 2，2 ) = 19.00 F0.01(2，2 ) = 99.00 根據(jù)F值大小可知決定碳氮因素對(duì)實(shí)驗(yàn)影響從大到小的順序?yàn)椋篈 B C再根據(jù)每個(gè)因素k值大小可以看出，碳氮源含量最佳水平為A1B3C2，即葡萄糖 3.0 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、酵母膏 0.5 g/L 。從表4方差分析可以看出，葡萄糖含量對(duì)聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量影響

37、較顯著，(NH4)2SO4含量和酵母膏對(duì)聚賴(lài)氨酸產(chǎn)量影響顯著。從在這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以看出碳氮源對(duì)聚賴(lài)氨酸的生產(chǎn)非常重要，但由于實(shí)驗(yàn)室條件的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的誤差。3.3 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化實(shí)驗(yàn)以碳氮源最優(yōu)條件為基礎(chǔ)，在Streptomyces albulus PL3-6產(chǎn)聚賴(lài)氨酸的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取無(wú)機(jī)鹽KH2PO4含量、K2HPO4含量、ZnSO47H2O含量、等五個(gè)因素，利用正交表L8(27)經(jīng)行5個(gè)因素兩個(gè)水平正交試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果和分析如表5、表6所示。表5 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交試驗(yàn)L8 (27)水平表(g/L)Tab.5 Factors and Levels of orthogonal exp

38、eriment L8 (27) for optimizing inorganic salts (g/L)水平A. KH2PO4B. K2HPO4C. MgSO4·7H2OD. FeSO4·7H2OE.ZnSO4·7H2O120.100.200.080.120.050.100.0030.0060.0040.008 表6 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)L8 (27)Tab.6 Results of orthogonal experiment L8 (27) for optimizing inorganic salts實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCDEY-PL產(chǎn)量/(g/L)12345678K1K2

39、RKi 1111222213.55214.9241.372406.382 1122112213.72014.7561.036405.978 1212121214.71213.7640.948405.891 1212212 114.35814.1180.240405.470 1221122113.80214.6740.872405.821 3.2413.2693.8323.2103.6383.5724.0013.713Yi = 28.476Yi2 =101.967表7 無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)L8(27)方差分析Tab.7 Variance analysis of orthogonal experim

40、ent L8 (27) for optimizing inorganic salts方差來(lái)源平均和自由度均方差F值顯著性ABCDE誤總和0.23550.13450.11280.00750.09530.02140.371611111270.23550.13450.11280.00750.09530.010722.0112.5710.540.708.91* *注：查F臨界值表 F0.05(1，2) = 18.51 F0.1(1，2) = 8.53從表6中可以看出，無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化的最佳水平為A2B2C1D1E2，即KH2PO4 0.20g/L、K2HPO4 0.12 g/L、MgSO47H2O 0.05

41、 g/L、FeSO47H2O 0.003 g/L、ZnSO47H2O 0.008 g/L根據(jù)表7中F值的大小可知決定因素對(duì)實(shí)驗(yàn)影響從大到小的順序?yàn)椋篈 B C E D從表7中可以看出，KH2PO4含量、K2HPO4含量、MgSO47H2O含量對(duì)-PL產(chǎn)量影響顯著，ZnSO47H2O含量對(duì)-PL產(chǎn)量有一定影響，F(xiàn)eSO47H2O含量對(duì)-PL產(chǎn)量沒(méi)影響。3.4 -PL的提取3.4.1 發(fā)酵液的預(yù)處理微生物發(fā)酵液的成分極為復(fù)雜，其中除了所培養(yǎng)的微生物菌體及殘存的固體培養(yǎng)基外，還有未被微生物完全利用的糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)以及微生物的各種代謝產(chǎn)物。從微生物發(fā)酵液中提取發(fā)酵產(chǎn)品的第一個(gè)步驟就是預(yù)處理，其目

42、的不僅在于分離菌體和其他懸浮顆粒，還著眼于除去可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利用提取和精制中常用的各后繼工序。各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵液特性不同，其預(yù)處理方法的選擇也有所不同。大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，也有少數(shù)產(chǎn)物存在于菌體中，或發(fā)酵液和菌體中都含有。發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液中除了目的產(chǎn)物-聚賴(lài)氨酸，還含有大量的菌體、殘?zhí)恰⑵渌x副產(chǎn)物，以及Ca2+、Mg2+、Fe2+等金屬離子。這些物質(zhì)對(duì)采用離子交換樹(shù)脂提取都將產(chǎn)生很大的影響，降低提取收率，所以發(fā)酵液必須經(jīng)過(guò)預(yù)處理。（1） 離心分離14固液分離是生物產(chǎn)品工廠中經(jīng)常遇到的重要單元操作。培養(yǎng)基、發(fā)酵液、某些中間產(chǎn)品和半成品等都需要進(jìn)行固

43、液分離。工業(yè)上常用的固液分離的方法是離心和過(guò)濾。目前在實(shí)驗(yàn)室條件下，發(fā)酵液體積小時(shí)離心較過(guò)濾快速、方便，如果發(fā)酵殘余體積大，離心就顯得效率低下，發(fā)酵工業(yè)中固液分離常采用的方法是過(guò)濾，如選用板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾。實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的體積大約為1 L，所以采用離心分離。剛下罐的發(fā)酵液為棕黃色粘稠液體，離心除去菌體后得到澄清透明的發(fā)酵液。離心速率為4000 rpm，離心時(shí)間為15min。（2） 發(fā)酵液的相對(duì)純化 發(fā)酵液中主要的無(wú)機(jī)離子有Ca2+、M g2+、Fe2+等，高價(jià)無(wú)機(jī)離子的存在，在采用離子交換法提取時(shí)，會(huì)影響樹(shù)脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量?？扇苄缘鞍踪|(zhì)的存在，不僅在采用離子交換和吸附法提取時(shí)會(huì)降低

44、其交換容量和吸附能力，而且在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清15蛋白質(zhì)從有規(guī)則的排列變成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的過(guò)程稱(chēng)為變性，變性蛋白質(zhì)的溶解度較小，可采用使蛋白質(zhì)變性的方法沉淀除去可溶性的蛋白質(zhì)。使蛋白質(zhì)變性的方法很多，最常用的是加熱法，加熱不僅使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)降低液體粘度，提高過(guò)濾速率。但加熱法只適合于對(duì)熱比較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物。使蛋白質(zhì)變性的其他方法有:大幅度調(diào)節(jié)pH值，常將發(fā)酵液pH值調(diào)至偏酸性范圍(pH23)或在堿性范圍內(nèi)(pH89 )使蛋白質(zhì)凝固。本實(shí)驗(yàn)采用將發(fā)酵液調(diào)到堿性范圍內(nèi)(pH89 )，使蛋白質(zhì)變性凝固后過(guò)濾除去16。綜合決定：除去發(fā)酵液中的高價(jià)無(wú)機(jī)離子；離子交換

45、適合的上柱pH值；蛋白質(zhì)變性沉淀適合的pH值，用5 N的NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值到8.5。調(diào)節(jié)pH值以后，發(fā)酵液中產(chǎn)生大量白色絮狀沉淀，靜置一段時(shí)間，過(guò)濾除去產(chǎn)生的沉淀。3.4.2 離子交換樹(shù)脂的預(yù)處理離子交換樹(shù)脂在使用前都必須經(jīng)過(guò)一系列的處理才能投入使用。一般是經(jīng)過(guò)去雜、過(guò)篩、用水漂洗，除去破碎、空心的樹(shù)脂，洗去泥土和雜質(zhì)，再用酒精洗去可能吸附的少量有機(jī)物質(zhì)。然后進(jìn)入化學(xué)處理:用810倍體積1 mol/L的HCI處理2-4小時(shí)(經(jīng)常攪拌)，用水反復(fù)洗至中性;然后用1 mol/L的NaOH浸泡24h(經(jīng)常攪拌)，用水反復(fù)洗至中性;再用810倍體積1 mol/L的HCl的浸泡24h，用水洗至中性

46、備用。這個(gè)過(guò)程是酸-堿-酸，得到的是氫型樹(shù)脂。對(duì)于強(qiáng)酸型樹(shù)脂，如果想得到鈉型樹(shù)脂，則處理的過(guò)程為堿-酸-堿;對(duì)陰離子樹(shù)脂，堿-酸-堿處理，得到的是經(jīng)型樹(shù)脂，酸-堿-酸處理則得到的是氯型樹(shù)脂，最后的一步稱(chēng)為轉(zhuǎn)型。在蛋白質(zhì)或酶的離子交換分離過(guò)程中，要求樹(shù)脂有一定的pH值，因此，在樹(shù)脂轉(zhuǎn)型后，應(yīng)用相應(yīng)pH值的緩沖溶液平衡一段時(shí)間才可以使用。3.4.3 離子交換提取11取50 mL 濕的D152樹(shù)脂裝填于1.6 cm ×45 cm 的玻璃柱中, 置于鐵架臺(tái)上，通過(guò)恒流泵控制上柱液的流速為6 mL/min。待發(fā)酵液上柱完畢后，先用蒸餾水沖洗柱子，此階段可加快流速。用0.2 N醋酸洗滌柱子，待洗

47、滌完畢后，用0.1 N的鹽酸洗脫，收集洗脫液，如圖7所示。用1 N的NaOH溶液調(diào)節(jié)洗脫液的pH值到6.5，加入活性炭脫色液過(guò)濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到小體積，后按體積比為2:1加入乙醇和乙醚的混合物，析出白色晶體，如圖8所示。 圖7離子交換脫色后的洗脫濃縮液 圖8 提取物3.4.4 發(fā)酵液的紫外吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 測(cè)定用0.1%磷酸溶液配成的10 mg/ml -聚賴(lài)氨酸提取物，以磷酸溶液作對(duì)比， 經(jīng)行紫外掃描，可以看出提取的-聚賴(lài)氨酸提取物的最大吸收波長(zhǎng)為192 nm，如圖9所示，但雜峰比較多，說(shuō)明提取物中含有雜質(zhì)比較多，需進(jìn)一步純化精制，但由于時(shí)間各種原因所限制，沒(méi)進(jìn)一步純化精制。 圖9 -聚賴(lài)氨

48、酸紫外吸收波長(zhǎng)3.4.5 -聚賴(lài)氨酸組成定性分析量取1 mL的離子交換洗脫濃縮液放到帶有塞子的試管中，加如6 mol/L的鹽酸溶液3 mL，在110烘箱中水解24 h，過(guò)濾并洗滌濾渣。將濾液和標(biāo)準(zhǔn)L-賴(lài)氨酸樣品點(diǎn)樣于層析紙上，展開(kāi)劑為正丁醇:甲酸:水= 15:3:2 (V /V) ,顯色劑為茚三酮的丙酮溶液，其結(jié)果如下圖所示： 圖9樣品水解后的紙層析圖結(jié) 論通過(guò)在各個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取了培養(yǎng)基諸成分多個(gè)水平進(jìn)行白色鏈霉菌產(chǎn)-PL發(fā)酵條件優(yōu)化，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)獲得了優(yōu)化條件：葡萄糖 3.0 g/L、(NH4)2SO4 1.2 g/L、酵母膏 0.5 g/L、KH2PO4 0.20 g/L、K2HPO4 0.12 g/L、MgSO47H2O 0.05 g/L、FeSO47H2O 0.003 g/L、ZnSO47H2O 0.008 g/L，-PL 搖瓶產(chǎn)量達(dá)到4.05 g·L- 1 ，比優(yōu)化前提高了25 %。另外，采