親合組織化學(xué)技術(shù)

1、第五章第五章 親合組織化學(xué)技術(shù)親合組織化學(xué)技術(shù)發(fā)展歷史發(fā)展歷史v6060年代：發(fā)現(xiàn)生物素和卵白素年代：發(fā)現(xiàn)生物素和卵白素v7070年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌年代：植物凝集素、生物素、葡萄球菌A A蛋白蛋白-BRAB-BRAB、LABLAB、SPA-HRPSPA-HRP、ABCABCv親和組織化學(xué)：親和組織化學(xué)：19761976年年BayerBayer首次提出首次提出 包括植物凝集素和糖類、生物素和抗生物素、葡萄球菌包括植物凝集素和糖類、生物素和抗生物素、葡萄球菌A A蛋蛋白與白與IgGIgG、陽離子與陰離子、激素、維生素、糖及類脂質(zhì)作、陽離子與陰離子、激素、維生素、糖及類脂質(zhì)作用部位和

2、受體等用部位和受體等植物凝集素植物凝集素(Lectin(Lectin) )生物素生物素(Biotin)(Biotin)葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白蛋白(SPA) (SPA) SPASPAHRPHRP法、法、ABCABC法和法和LABLAB法等。法等。親合組織化學(xué)技術(shù)親合組織化學(xué)技術(shù)v定義：定義：是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)，建立的組織細(xì)胞基礎(chǔ)化學(xué)技術(shù)。礎(chǔ)，建立的組織細(xì)胞基礎(chǔ)化學(xué)技術(shù)。v本質(zhì)：本質(zhì)：區(qū)別于一般的組織化學(xué)，非抗原抗體反應(yīng)。區(qū)別于一般的組織化學(xué)，非抗原抗體反應(yīng)。v優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，有利于微量抗原（或抗體）在細(xì)胞或亞敏感性

3、高，有利于微量抗原（或抗體）在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位。細(xì)胞水平的定位。一一 抗生物素抗生物素生物素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)生物素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 二二 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A技術(shù)技術(shù) 三三 凝集素組織化學(xué)技術(shù)凝集素組織化學(xué)技術(shù)四四 其它親和細(xì)胞化學(xué)其它親和細(xì)胞化學(xué)一、抗生物素一、抗生物素生物素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)生物素免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) ( (一一) ) 基本原理基本原理 親合素（抗生物素親合素（抗生物素/ /卵白素）卵白素） 是雞蛋白中含有的一種堿性蛋白，屬于糖蛋白是雞蛋白中含有的一種堿性蛋白，屬于糖蛋白; ;具有具有4 4個(gè)同維生素個(gè)同維生素H (H (生物素生物素) )親合力極高的結(jié)合點(diǎn)。親合

4、力極高的結(jié)合點(diǎn)。 鏈酶親合素鏈酶親合素 是一種從鏈酶菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，和親合素一樣，也有四個(gè)生物素結(jié)是一種從鏈酶菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，和親合素一樣，也有四個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，是一種親和力更高的生物素結(jié)合蛋白。合位點(diǎn)，是一種親和力更高的生物素結(jié)合蛋白。生物素（維生素生物素（維生素H H）是一種小分子的水溶性維生素，它與親合素鏈酶親合素之間有很強(qiáng)的親合是一種小分子的水溶性維生素，它與親合素鏈酶親合素之間有很強(qiáng)的親合力，較之抗體對(duì)抗原的親合力要高出力，較之抗體對(duì)抗原的親合力要高出100100萬倍，能夠彼此牢固結(jié)合而不影響萬倍，能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性。彼此的生物學(xué)活性。 生物素

5、、親合素、鏈酶親合素：生物素、親合素、鏈酶親合素：能與熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結(jié)合。能與熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結(jié)合。 親合素、鏈酶親合素：親合素、鏈酶親合素：同一定濃度的生物素化酶混合后，形成親合素一生物同一定濃度的生物素化酶混合后，形成親合素一生物素一酶復(fù)合物。這種復(fù)合物可以和各種生物素標(biāo)記抗體結(jié)合。素一酶復(fù)合物。這種復(fù)合物可以和各種生物素標(biāo)記抗體結(jié)合。（二）幾種親合素（二）幾種親合素生物素染色技術(shù)生物素染色技術(shù) v1 1 親合素一生物素親合素一生物素過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(ABC)(ABC)v2 2鏈酶親合素鏈酶親合素- -生物素生物素- -過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)

6、過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC(SABC法法) )v3 3標(biāo)記生物素標(biāo)記生物素抗生物素技術(shù)抗生物素技術(shù)(LAB)(LAB)v4.SP/SAP4.SP/SAP法法v5.Envision5.Envision法法v6.CSA6.CSA法法ABCABC復(fù)合物：復(fù)合物：復(fù)合物復(fù)合物1 1 親合素一生物素親合素一生物素過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(ABC)(ABC) 基本原理基本原理 是將親合素作為是將親合素作為“橋橋”與生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶與生物素化的抗體與生物素結(jié)合的酶（HRP)HRP)連接起來。連接起來。 第一抗體：第一抗體：為未標(biāo)記特異性抗體，能結(jié)合組織中待測(cè)抗原；為未標(biāo)記特

7、異性抗體，能結(jié)合組織中待測(cè)抗原； 第二抗體：第二抗體：為為生物素化的橋抗體生物素化的橋抗體，能與第一抗體結(jié)合；，能與第一抗體結(jié)合； 第三抗體：第三抗體：是結(jié)合了過氧化物酶的親合素復(fù)合物是結(jié)合了過氧化物酶的親合素復(fù)合物( (即即ABCABC) ) 。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：敏感性強(qiáng)（比敏感性強(qiáng)（比PAP高高20-40倍）；倍）；特異性強(qiáng)，背景染色淡；特異性強(qiáng)，背景染色淡；方法簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間方法簡(jiǎn)便，節(jié)約時(shí)間（比（比PAPPAP縮短縮短2h2h） ；由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力，可由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。用于雙重或多重免疫染色。 操作步驟操作

8、步驟 冰凍切片或石蠟切片均可。冰凍切片或石蠟切片均可。 冰凍切片：丙酮固定，冰凍切片：丙酮固定，PBS PBS 洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 石蠟切片：脫蠟，系列酒精至水。石蠟切片：脫蠟，系列酒精至水。 第一抗體第一抗體孵育，過夜。孵育，過夜。 PBS PBS洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 加加生物素標(biāo)記的第二抗體生物素標(biāo)記的第二抗體，孵育，孵育15min15min。 PBS PBS洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 加加ABCABC復(fù)合物復(fù)合物室溫作用室溫作用15min15min。 PBS PBS洗洗5min5min，更換，更換3 3次。次。 用

9、用DABDAB顯色。顯色。 復(fù)染、封片、觀察。復(fù)染、封片、觀察。 結(jié)果結(jié)果 呈棕黃色為陽性表達(dá)，核被蘇木精染成淺藍(lán)色。呈棕黃色為陽性表達(dá)，核被蘇木精染成淺藍(lán)色。(4) (4) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) v消除內(nèi)源性生物素：消除內(nèi)源性生物素：染色前以染色前以0.010.01的親合素和的親合素和0.010.01生物素溶生物素溶液分別作用液分別作用20min20min以消除內(nèi)源性生物素活性，每次作用后用以消除內(nèi)源性生物素活性，每次作用后用PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min5min。v消除內(nèi)源性過氧化物酶：消除內(nèi)源性過氧化物酶：可用可用3 3 H H2 2O O2 2孵育孵育5-105-10分鐘以滅活

10、內(nèi)源分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。蒸餾水洗性過氧化物酶活性。蒸餾水洗3 3次。次。v試劑的保存：試劑的保存：溫度以溫度以44為佳，可達(dá)為佳，可達(dá)2 2年之久，在年之久，在2020時(shí)其生物時(shí)其生物活性反而在短期內(nèi)被破壞。活性反而在短期內(nèi)被破壞。 此外，生物素制劑之間相互親和性差異大，注意廠家和批號(hào)。此外，生物素制劑之間相互親和性差異大，注意廠家和批號(hào)。SABC法原理：原理： 一抗生物素化二抗一抗生物素化二抗SABCSABC復(fù)合物復(fù)合物SABCSABC復(fù)合物復(fù)合物 生物素標(biāo)記的二抗生物素標(biāo)記的二抗鏈霉卵白素連接鏈霉卵白素連接 生物素標(biāo)記的酶。生物素標(biāo)記的酶。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：敏感性略高于敏感性略高于S

11、PSP法，低背景和操法，低背景和操作簡(jiǎn)便作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：因體內(nèi)含有內(nèi)源性生物素，易產(chǎn)因體內(nèi)含有內(nèi)源性生物素，易產(chǎn)生非特異性染色。生非特異性染色。一抗一抗+ +生物素標(biāo)記二抗生物素標(biāo)記二抗+ +滴加試劑滴加試劑SABCSABC（鏈霉卵白素（鏈霉卵白素+ +辣根酶標(biāo)記生物素辣根酶標(biāo)記生物素)+)+辣根酶底物顯色辣根酶底物顯色2 2 鏈酶親合素鏈酶親合素- -生物素生物素- -過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(SABC(SABC法法) )SABCSABC試劑盒試劑盒( (含正常血清，生物素化二抗，含正常血清，生物素化二抗，SABCSABC等等) )操作程序操作程序1 1）載玻片防脫處理：可

12、選擇）載玻片防脫處理：可選擇APESAPES或或PolyPolyLysineLysine，烤片。，烤片。2 2）切片常規(guī)脫蠟至水。）切片常規(guī)脫蠟至水。3 3）3 3H H2 20 02 2 滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3 3次。次。4 4）抗原熱修復(fù)：將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液）抗原熱修復(fù)：將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0)(PH6.0)，電爐或，電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5 51010分鐘后，反復(fù)分鐘后，反復(fù)1 12 2次。次。冷卻后冷卻后PBSPBS洗滌。洗滌。5 5）滴加）滴加5 5BSABSA封閉液，室溫封閉液，室溫2020分鐘。甩

13、去多余液體，不洗。分鐘。甩去多余液體，不洗。6 6）滴加適當(dāng)稀釋的）滴加適當(dāng)稀釋的一抗一抗，371371小時(shí)左右或小時(shí)左右或202202小時(shí)左右。小時(shí)左右。 也可也可44過夜。過夜。PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗2 2分鐘分鐘3 3次。次。 對(duì)照切片用對(duì)照切片用PBSPBS代替一抗。代替一抗。7 7）滴加）滴加生物素化二抗生物素化二抗，202037203720分鐘。分鐘。PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗洗2 2分鐘分鐘3 3次。次。 8 8）滴加試劑）滴加試劑SABCSABC，202037203720分鐘。分鐘。PBS(pH7.2PBS(pH7.

14、27.6)7.6)洗洗5 5分鐘分鐘4 4次。次。9 9）DABDAB顯色：使用顯色：使用DABDAB顯色試劑盒。取顯色試劑盒。取1ml1ml蒸餾水，加試劑盒蒸餾水，加試劑盒中中A A、B B、C C試劑各試劑各1 1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5 5一一3030分鐘之間。蒸餾水洗滌。分鐘之間。蒸餾水洗滌。 1010）蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。）蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。結(jié)果結(jié)果 棕褐色為陽性結(jié)果，而細(xì)胞核染為淡藍(lán)色。棕褐色為陽性結(jié)果，而細(xì)胞核染為淡藍(lán)色。 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)

15、1 1）染色背景過高：）染色背景過高： 在在SABCSABC反應(yīng)之后，反應(yīng)之后，DABDAB顯色之前，用加有顯色之前，用加有0.0l0.0l一一0.020.02TWEEN20TWEEN20的的PBS(pH7.2PBS(pH7.27.6)7.6)洗滌切片洗滌切片4 4次，單純次，單純PBSPBS洗洗2 2次，次，然后然后DABDAB顯色。顯色。 2 2）抗原熱修復(fù)：）抗原熱修復(fù)：可選可選0.01M0.01M枸櫞酸鹽緩沖液；枸櫞酸鹽緩沖液； 也可以使用也可以使用PBSPBS、TBSTBS等多種緩沖液。等多種緩沖液。 3 3 標(biāo)記生物素標(biāo)記生物素抗生物素技術(shù)抗生物素技術(shù)(LAB)(LAB)v原理：原

16、理： 第第抗體：抗體：生物素標(biāo)記；生物素標(biāo)記； 第二抗體：第二抗體：酶標(biāo)記抗生物素酶標(biāo)記抗生物素( (親合素親合素) ) v操作步驟：操作步驟： 切片中加入切片中加入生物素標(biāo)記一抗生物素標(biāo)記一抗，室溫孵育，室溫孵育1 h1 h，。，。 0.01MPBS 0.01MPBS洗洗3 3次，每次次，每次5 min5 min。 20-50ug 20-50ugml ml HRP-HRP-抗生物素抗生物素液孵育。液孵育。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。 DAB DAB顯色。蒸餾水漂洗。顯色。蒸餾水漂洗。 蘇木精復(fù)染核。梯度乙醇脫水、透明、封片、鏡檢。蘇木精復(fù)染核。梯度乙醇脫水、透明

17、、封片、鏡檢。 應(yīng)用不如應(yīng)用不如ABCABC普遍，但手續(xù)較簡(jiǎn)便，但靈敏度低。普遍，但手續(xù)較簡(jiǎn)便，但靈敏度低。SPSP法法（過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素/ /過氧化過氧化物酶標(biāo)記的堿性磷酸酶染色）物酶標(biāo)記的堿性磷酸酶染色）原理：原理：一抗生物素化二抗酶標(biāo)記的鏈一抗生物素化二抗酶標(biāo)記的鏈霉卵白素霉卵白素優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：高靈敏度、低背景、操作方高靈敏度、低背景、操作方便便缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：不適用于內(nèi)源性生物素豐富不適用于內(nèi)源性生物素豐富的組織的組織v三步法（以三步法（以SPSP試劑盒為例）試劑盒為例） 石蠟切片脫蠟至水。石蠟切片脫蠟至水。 蒸餾水沖洗，蒸餾水沖洗，PBSPBS浸泡浸泡

18、5 5分鐘，如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。分鐘，如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。 3%H 3%H2 2O O2 2室溫孵育室溫孵育5-105-10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBSPBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 5-10% 5-10%正常山羊血清封閉，室溫孵育正常山羊血清封閉，室溫孵育1010分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的比例稀釋的一抗一抗或一抗工作液，或一抗工作液，3737孵育孵育1-21-2小時(shí)或小時(shí)或44過夜。過夜。 PBS PBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 滴加適當(dāng)比

19、例稀釋的滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS1%BSA-PBS稀釋），稀釋），3737孵育孵育10-10-3030分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，3737或室溫孵育或室溫孵育10-2010-20分鐘。分鐘。 PBS PBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 滴加適當(dāng)比例稀釋的滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBSPBS稀釋），稀釋），3737孵育孵育10-10-3030分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，3737或室溫孵育或室溫孵育10

20、-2010-20分鐘。分鐘。 PBS PBS沖洗，沖洗，2 2分鐘分鐘3 3次。次。 顯色劑顯色（顯色劑顯色（DABDAB或或AECAEC）。）。 自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明（如需要）、封片。自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明（如需要）、封片。原理：原理：將二抗和酶通過一個(gè)多聚葡聚糖骨將二抗和酶通過一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體架聯(lián)接成一個(gè)多聚體 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1 1 簡(jiǎn)便、快速、敏感性是簡(jiǎn)便、快速、敏感性是SPSP、SABCSABC法的幾十倍。法的幾十倍。2 2 人體組織中不含有這種多聚物，人體組織中不含有這種多聚物，從而避免了組織中生物素的干擾從而避免了組織中生物素的干擾缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：因大

21、分子穿透核膜困難因大分子穿透核膜困難, ,對(duì)于核內(nèi)抗原的定位不能選用此法。對(duì)于核內(nèi)抗原的定位不能選用此法。Envision法法一抗一抗+二抗標(biāo)記多聚螯合物酶二抗標(biāo)記多聚螯合物酶EnvisionEnvision法法vEnVisionEnVision工作程序：工作程序：1 1） 脫蠟、水化組織切片。脫蠟、水化組織切片。2 2） 預(yù)處理組織切片（據(jù)一抗具體說明而定）預(yù)處理組織切片（據(jù)一抗具體說明而定）3 3） 蒸餾水漂洗，置于蒸餾水漂洗，置于PBSPBS中。中。4 4） 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（僅用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（僅用于EnVisionTMEnVisionTM/HRP/HRP）5 5） 蒸餾水

22、漂洗，置于蒸餾水漂洗，置于PBSPBS，1010分鐘分鐘6 6） 一抗一抗孵育孵育10-3010-30分鐘分鐘7 7） PBSPBS漂洗漂洗1010分鐘分鐘8 8） EnVisionEnVisionTMTM孵育孵育10-3010-30分鐘分鐘9 9） PBSPBS漂洗漂洗1010分鐘分鐘10) 10) 色源底物溶液孵育色源底物溶液孵育1010分鐘分鐘11) 11) 蒸餾水漂洗蒸餾水漂洗12) 12) 復(fù)染及封片復(fù)染及封片CSACSA法（催化信號(hào)放大法）法（催化信號(hào)放大法）原理：原理：是酪胺的過氧化物酶反應(yīng)是酪胺的過氧化物酶反應(yīng)(即即HRP催化酪胺催化酪胺鹽，形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)鹽，形成共價(jià)鍵結(jié)合

23、位點(diǎn))，產(chǎn)生大量的酶，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣結(jié)合，這樣在抗原在抗原抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積，與隨后加入的鏈霉親和素積，與隨后加入的鏈霉親和素HRP結(jié)合，結(jié)合，如經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以網(wǎng)絡(luò)許許多如經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大，可以網(wǎng)絡(luò)許許多多的酶分子，最后通過多的酶分子，最后通過DAB的顯色反應(yīng)，的顯色反應(yīng)，其敏感性得到幾何級(jí)放大。其敏感性得到幾何級(jí)放大。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：比比EnVision法敏感法敏感20100倍。倍。適合于實(shí)驗(yàn)病理學(xué)和第

24、一抗體昂貴、抗原性適合于實(shí)驗(yàn)病理學(xué)和第一抗體昂貴、抗原性較弱的較弱的IHC檢測(cè)以及抗原破壞嚴(yán)重、抗原量檢測(cè)以及抗原破壞嚴(yán)重、抗原量較少的組織細(xì)胞抗原的檢測(cè)方法較少的組織細(xì)胞抗原的檢測(cè)方法;核內(nèi)抗原的檢測(cè)（原為雜交）。核內(nèi)抗原的檢測(cè)（原為雜交）。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作步驟多、孵育時(shí)間長(zhǎng)，存在嚴(yán)重的內(nèi)源操作步驟多、孵育時(shí)間長(zhǎng)，存在嚴(yán)重的內(nèi)源性干擾，背景染色有時(shí)較重。性干擾，背景染色有時(shí)較重。二、葡萄球菌蛋白二、葡萄球菌蛋白A A技術(shù)技術(shù) 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)A(SPA)： 金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，作為橋抗體或標(biāo)記抗體金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)，作為橋抗體或標(biāo)記抗體不受種

25、屬特異性的限制，它能和人及許多動(dòng)物不受種屬特異性的限制，它能和人及許多動(dòng)物IgGIgG結(jié)合，對(duì)結(jié)合，對(duì)IgGIgG免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性。免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性。 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A(SPA)A(SPA)技術(shù)原理：技術(shù)原理： 結(jié)合部位是結(jié)合部位是FcFc段，不影響抗體的活性；段，不影響抗體的活性； 結(jié)合力是雙價(jià)的，可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)結(jié)合力是雙價(jià)的，可同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgGIgG分子；分子； 可將酶、熒光素、膠體金等標(biāo)記在可將酶、熒光素、膠體金等標(biāo)記在SPASPA上。上。 SPA SPA應(yīng)用應(yīng)用: :1 1 免疫球蛋白的制備和分析免疫球蛋白的制備和分析能和能和IgGIgG及其某些及其

26、某些FcFc段結(jié)合，可提純、分析免疫球蛋白制劑。段結(jié)合，可提純、分析免疫球蛋白制劑。2 2 應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合力是雙價(jià)的，可作為橋抗體或標(biāo)記抗體。且不受種屬特異性限制；結(jié)合力是雙價(jià)的，可作為橋抗體或標(biāo)記抗體。且不受種屬特異性限制；分子量小，穿透力強(qiáng)。分子量小，穿透力強(qiáng)。3 3 應(yīng)用于多種細(xì)菌、支原體和病毒的簡(jiǎn)易快速診斷應(yīng)用于多種細(xì)菌、支原體和病毒的簡(jiǎn)易快速診斷SPASPA菌體為載體，結(jié)合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集素，用于細(xì)菌體為載體，結(jié)合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集素，用于細(xì)菌、病毒的定群和分型。菌、病毒的定群和分型。4 4 可作為固相吸附劑研究免疫復(fù)合

27、物、膜抗原、膜受體和膜可作為固相吸附劑研究免疫復(fù)合物、膜抗原、膜受體和膜IgIg SPASPA在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中的應(yīng)用在免疫細(xì)胞化學(xué)染色中的應(yīng)用vSPASPA可被熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等標(biāo)記，其中最常用可被熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等標(biāo)記，其中最常用的酶為的酶為HRPHRPv1 SPA-HRP1 SPA-HRP用于間接法的染色用于間接法的染色 (1) (1) 切片脫蠟至水，切片脫蠟至水，3 3H H2 2O O2 2抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。 (2) (2) 水洗后，水洗后，PBSPBS漂洗。漂洗。 (3) (3) 加加一抗一抗，3737孵育孵育60min60m

28、in或或44過夜。過夜。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。 (4(4) SPA-HRP) SPA-HRP室溫室溫30min30min。0.01M PBS0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。 (5) DAB(5) DAB顯色。顯色。 (6) (6) 蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固。蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固。2 SPA2 SPA用于用于PAPPAP法的染色法的染色 (1)(1)切片脫蠟至水，切片脫蠟至水，0.30.3H H2 20 02 2甲醇處理切片。甲醇處理切片。 (2)10(2)10卵蛋白卵蛋白TrisTris緩沖液處理緩沖液處理20min20min。 (3)(

29、3)加加第一抗體第一抗體3737孵育孵育60min60min或或44過夜。過夜。 (4)0.05M Tris-HCl(4)0.05M Tris-HCl，pH7.6pH7.6，洗滌，洗滌3 3次。次。 (5)(5)SPASPA(1ug(1ugm1)m1)孵育孵育15min15min，0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl溶液漂洗溶液漂洗3 3次。次。 (6)(6)PAPPAP復(fù)合物復(fù)合物( (無動(dòng)物種屬限制無動(dòng)物種屬限制) )孵育孵育15min15min。0.05M Tris-HCl0.05M Tris-HCl溶液漂洗溶液漂洗3 3次。（次。（抗酶抗體抗酶抗體 + + 足量的酶

30、足量的酶 = = 形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物）形成穩(wěn)定的五角形復(fù)合物） (7)DAB(7)DAB顯色。顯色。 (8)(8)蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固。蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封固。三、凝集素組織化學(xué)技術(shù)三、凝集素組織化學(xué)技術(shù)凝集素凝集素(1ectin)(1ectin)：從各種植物、無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖從各種植物、無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，能凝集紅細(xì)胞。的蛋白，能凝集紅細(xì)胞。常用：常用：刀豆素刀豆素(ConA(ConA) )、麥胚素、麥胚素(WGA)(WGA)、花生凝集素、花生凝集素(PNA)(PNA)、 大豆凝集素大豆凝集素(SBA)(SBA)等等凝

31、集素特性：凝集素特性：凝集素具有多價(jià)結(jié)合的能力，能識(shí)別糖蛋白和糖肽，特別是細(xì)凝集素具有多價(jià)結(jié)合的能力，能識(shí)別糖蛋白和糖肽，特別是細(xì)胞膜中碳水化合物胞膜中碳水化合物抗原決定簇抗原決定簇，結(jié)合力為一專一性能，能與熒，結(jié)合力為一專一性能，能與熒光素、生物素、酶、膠體金及鐵蛋白等光素、生物素、酶、膠體金及鐵蛋白等示蹤物示蹤物結(jié)合，從而在結(jié)合，從而在光鏡、電鏡水平顯示其結(jié)合部位。因此凝集素可作為一種光鏡、電鏡水平顯示其結(jié)合部位。因此凝集素可作為一種探針探針來研究細(xì)胞膜上特定的糖基結(jié)構(gòu)。來研究細(xì)胞膜上特定的糖基結(jié)構(gòu)。凝集素受體是存在于細(xì)胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖，而凝集素受體是存在于細(xì)胞膜上的糖蛋白和糖

32、脂中的寡糖，而這種受體可區(qū)別細(xì)胞的類型和反映細(xì)胞在分化、成熟和在腫這種受體可區(qū)別細(xì)胞的類型和反映細(xì)胞在分化、成熟和在腫瘤細(xì)胞中的作用。瘤細(xì)胞中的作用。1 1 作為細(xì)胞分化成熟的標(biāo)記作為細(xì)胞分化成熟的標(biāo)記血細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞的分群血細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞的分群2 2 作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記人視網(wǎng)膜人視網(wǎng)膜 視錐細(xì)胞（視錐細(xì)胞（PNA+PNA+）視桿細(xì)胞（）視桿細(xì)胞（PNA-PNA-）乳腺乳腺 乳腺上皮細(xì)胞（乳腺上皮細(xì)胞（PNA+PNA+）肌上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞（）肌上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞（PNA-PNA-）3 3 在腫瘤中凝集素結(jié)合的改變?cè)谀[瘤中凝集素結(jié)合的改變 PHAPHA胃癌

33、診斷性標(biāo)志胃癌診斷性標(biāo)志應(yīng)用：應(yīng)用：凝集素在免疫細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用方法：凝集素在免疫細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用方法： 1 1 直接法直接法 將標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，與相應(yīng)糖蛋白或糖脂結(jié)合。將標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，與相應(yīng)糖蛋白或糖脂結(jié)合。 (1) (1) 操作步驟操作步驟 1)1)切片脫蠟至水切片脫蠟至水( (或恒冷箱切片，冷丙酮固定，室溫干燥或恒冷箱切片，冷丙酮固定，室溫干燥) )。 2)32)3H H2 2O O2 2甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶101015min15min。3) 3) 過氧化物酶標(biāo)記的花生凝集素過氧化物酶標(biāo)記的花生凝集素，室溫，室溫30-60min30-60min。4) 0.01M PBS4) 0.01M PBS漂洗漂洗3 3次。次。5) DAB5) DAB顯色。顯色。6) 6) 常規(guī)脫水、透明、封固。常規(guī)脫水、透明、封固。 (2) (2) 結(jié)果結(jié)果 陽性部位呈棕褐色陽性部位呈棕褐色 2 2 間接法間接法 細(xì)胞膜上的相應(yīng)糖基細(xì)胞膜上的相應(yīng)糖基+ +凝集素凝集素+ +標(biāo)記的抗凝集素抗體標(biāo)記的抗凝集素抗體操作步驟操作步驟