生物化學(xué)與分子生物學(xué)：14_DNA的生物合成

1、Chapter 14 DNA Biosynthesis， Replication學(xué)習(xí)目的：學(xué)習(xí)目的：1. 理解理解DNA復(fù)制的基本特征。復(fù)制的基本特征。2. 理解理解DNA復(fù)制的酶學(xué)。復(fù)制的酶學(xué)。3. 理解理解DNA復(fù)制的基本過程復(fù)制的基本過程。DNA是由四種脫氧核糖核苷酸所組成的長鏈大分是由四種脫氧核糖核苷酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物的遺傳信息就貯子，是遺傳信息的攜帶者。生物的遺傳信息就貯存在存在DNA的四種脫氧核糖核苷酸的排列順序中。的四種脫氧核糖核苷酸的排列順序中。DNA通過通過復(fù)制復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過過轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄和和翻譯翻譯

2、，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的遺傳學(xué)的中心法則中心法則。 在在RNA病毒中，其遺傳信息貯存在病毒中，其遺傳信息貯存在RNA分子中。分子中。因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是因此，在這些生物體中，遺傳信息的流向是RNA通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代，通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由，再由DNA通過轉(zhuǎn)通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺

3、傳信息的流向就稱為稱為反中心法則反中心法則。DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDPDNA復(fù)制（復(fù)制（DDDP）轉(zhuǎn)錄（轉(zhuǎn)錄（DDRP）RNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)翻譯翻譯RNA復(fù)制（復(fù)制（RDRP）反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄（RDDP）Section 1 The Basic Features of DNA ReplicationDNA在復(fù)制時，以親代在復(fù)制時，以親代DNA的每一股作模板，合的每一股作模板

4、，合成完全相同的兩個雙鏈子代成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代，每個子代DNA中都含有一股親代中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的的半保留復(fù)制半保留復(fù)制。 一、一、DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制以半保留方式進(jìn)行復(fù)制DNA Is Replicated by Semi-conservative Pattern 重要概念：重要概念：semi-conservative replication可能的可能的DNA復(fù)制方式復(fù)制方式DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由年由M. Meselson 和和 F. Stahl 所完成的實驗所證明。該所完成的

5、實驗所證明。該實驗步驟為：實驗步驟為：Step I 將大腸桿菌在含將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)橹械膲A基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。Step II 將大腸桿菌移至只含將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。步培養(yǎng)一代、二代、三代。Step III 分別提取分別提取DNA，作密度梯度離心，將，作密度梯度離心，將具有不同密度的具有不同密度的DNA分離開。分離開。DNA半保留復(fù)制的實驗證明半保留復(fù)制的實驗證明DNA半保留復(fù)制研究實驗步驟半保留復(fù)制研究實驗步驟DNA半保留復(fù)制研究實驗結(jié)果示意圖半保留復(fù)制研究實驗

6、結(jié)果示意圖按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代與親代DNA的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性保守性。遺傳的保守性是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但遺傳的保守性是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不不是絕對的是絕對的。半保留復(fù)制的意義半保留復(fù)制的意義DNA在復(fù)制時，需在特定的位點起始，這是一些在復(fù)制時，需在特定的位點起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點復(fù)制起始點(origin) 。在原核生物中，復(fù)制起始點通常為一個，而在真在原核生物中，復(fù)制起始點通常為

7、一個，而在真核生物中則為多個。核生物中則為多個。二、二、DNA復(fù)制從起始點向兩個方向延伸復(fù)制從起始點向兩個方向延伸The Chain Elongation is from the Origin to Two Different Directions in the Process of DNA Replication細(xì)菌和酵母菌中細(xì)菌和酵母菌中DNA復(fù)制起始點的堿基序列復(fù)制起始點的堿基序列習(xí)慣上把兩個相鄰習(xí)慣上把兩個相鄰DNA復(fù)制起始點之間的距離復(fù)制起始點之間的距離（或（或DNA片段）定為一個片段）定為一個復(fù)制子（復(fù)制子（replicon） 。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制的功能單位。復(fù)制子是獨立完成復(fù)制

8、的功能單位。DNA復(fù)制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，復(fù)制時，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉（復(fù)制叉（replication fork）。53oriorioriori535533553復(fù)制子復(fù)制子3復(fù)制起始點與復(fù)制子示意圖復(fù)制起始點與復(fù)制子示意圖復(fù)制起始點、復(fù)制子與復(fù)制叉（動畫演示）復(fù)制起始點、復(fù)制子與復(fù)制叉（動畫演示）DNA replication with two forksDNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點復(fù)制時，以復(fù)制起始點(origin)為中心，向兩個方為中心，向兩個方向進(jìn)行解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為向進(jìn)行解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，

9、稱為雙向復(fù)制（雙向復(fù)制（bidirectional replication）。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。雙向復(fù)制與單向復(fù)制雙向復(fù)制與單向復(fù)制參與參與DNA復(fù)制的復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有聚合酶，必須以一段具有3-端自由羥基（端自由羥基（3-OH）的）的RNA作為作為引物引物(primer) ，才能開始聚合子代才能開始聚合子代DNA鏈。鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為引物的大小，在原核生物中通常為50100個個核苷酸，而在真核生物中約為核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其

10、模板引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。的堿基順序相配對。 三、三、DNA復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)性復(fù)制反應(yīng)呈半不連續(xù)性The Reaction of DNA Replication Exhibits Semi-discontinuous ReplicationDNA聚合酶只能以聚合酶只能以53方向聚合方向聚合子代子代DNA鏈鏈，即即模板模板DNA鏈鏈的方向必須是的方向必須是35。由于由于DNA分子中兩條鏈的走向相反，因此當(dāng)分分子中兩條鏈的走向相反，因此當(dāng)分別以兩條親代別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代鏈作為模板聚合子代DNA鏈時，子代鏈的聚合方向也是不同的。鏈時，子代鏈的聚合方向也是

11、不同的。3 5 3 5 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈(leading strand)后隨鏈后隨鏈(lagging strand)DNA的半不連續(xù)復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制3 5 以以35方向的親代方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的在復(fù)制時基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向為聚合方向為53 ，這一條鏈被稱為，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈領(lǐng)頭鏈（leading strand）。以以53方向的親代方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也在復(fù)制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是是53，這條鏈被稱為，這

12、條鏈被稱為后隨鏈（隨從鏈，后隨鏈（隨從鏈，lagging strand）。由于親代由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的，因此，雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的，因此，后隨鏈的合成也是一段一段的。后隨鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時，在復(fù)制時，由后隨鏈所形成的一些子代由后隨鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為短鏈稱為岡崎片岡崎片段段。岡崎片段的大小，在原核生物中約為岡崎片段的大小，在原核生物中約為10002000個核苷酸，而在真核生物中約為個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。個核苷酸。 重要概念：重要概念：Okazaki fragmentSection 2 Enzymology and To

13、pology for DNA ReplicationDNA復(fù)制時，在聚合酶的催化下，以四種脫氧核復(fù)制時，在聚合酶的催化下，以四種脫氧核糖核苷酸為糖核苷酸為底物（原料）底物（原料），即，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP，脫水縮合生成，脫水縮合生成3,5-磷酸二酯鍵而磷酸二酯鍵而連接成多核苷酸鏈。連接成多核苷酸鏈。一、復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)是核苷酸之間脫水縮合一、復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)是核苷酸之間脫水縮合The Basic Chemical Reaction of Replication is the Dehydrated Condensation Between Nucleotides(dNMP

14、)n + dNTP (dNMP)n+1 +PPiDNA復(fù)制過程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應(yīng)復(fù)制過程中脫氧核糖核苷酸的聚合反應(yīng)DNA的復(fù)制還是模板依賴性的，必須要以親代的復(fù)制還是模板依賴性的，必須要以親代DNA鏈作為模板。鏈作為模板。親代親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進(jìn)的兩股鏈解開后，可分別作為模板進(jìn)行復(fù)制。行復(fù)制。 二、二、DNADNA聚合酶催化脫氧核苷酸之間的聚合聚合酶催化脫氧核苷酸之間的聚合The Polymerizing Reactions Between Deoxynucleotides Are Catalyzed by DNA Polymerase全稱：全稱：依賴依賴DNA的

15、的DNA聚合酶聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP )簡稱：簡稱：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合酶活性的聚合酶活性 2. 53 或或3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。能辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解。 DNA聚合酶的核酸外切酶活性聚合酶

16、的核酸外切酶活性在原核生物中發(fā)現(xiàn)的在原核生物中發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶至少有三種，聚合酶至少有三種，分別命名為分別命名為DNA聚合酶聚合酶（pol ），DNA聚聚合酶合酶（pol ），DNA聚合酶聚合酶（pol ），這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與參與DNA復(fù)制的主要是復(fù)制的主要是pol 和和pol 。（一）原核生物至少有三種（一）原核生物至少有三種DNA聚合酶聚合酶pol 為具有三種酶活性為具有三種酶活性的單一肽鏈的大分子蛋的單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì)，可被特異的蛋白白質(zhì)，可被特異的蛋白酶水解為兩個片段，其酶水解為兩個片段，其中的大片段保留了兩種中的

17、大片段保留了兩種酶活性酶活性,即即53聚合酶聚合酶和和35外切酶外切酶活性，通?；钚裕ǔ１环Q為被稱為Klenow fragment。 Klenow片段的分子結(jié)構(gòu)片段的分子結(jié)構(gòu)pol 由十種亞基組成不對稱異源二聚體結(jié)構(gòu)，由十種亞基組成不對稱異源二聚體結(jié)構(gòu)，其中：其中：a a亞基亞基具有具有53聚合聚合DNA的酶活性，參與的酶活性，參與DNA復(fù)復(fù)制；制；e e亞基亞基具有具有35 外切酶的活性，與復(fù)制校正有關(guān)；外切酶的活性，與復(fù)制校正有關(guān)；b b亞基亞基具有具有DNA滑動鉗夾作用，與親代滑動鉗夾作用，與親代DNA鏈的結(jié)鏈的結(jié)合有關(guān)（在真核生物中，則是以合有關(guān)（在真核生物中，則是以增殖細(xì)胞核抗原增

18、殖細(xì)胞核抗原PCNA作為鉗夾蛋白）。作為鉗夾蛋白）。原核生物原核生物DNA聚合酶聚合酶的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶鉗夾加載蛋白鉗夾加載蛋白滑動鉗夾滑動鉗夾3-5 外切酶外切酶 原核生物中的三種原核生物中的三種DNA聚合酶聚合酶 在真核生物中發(fā)現(xiàn)的在真核生物中發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶主要有五種聚合酶主要有五種:DNA-pol a a 起始引發(fā)。起始引發(fā)。參與低保真度的復(fù)制參與低保真度的復(fù)制 。DNA-pol b b在在線粒體線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。復(fù)制中起催化作用。DNA-pol 延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。DNA-pol 參與參與DNA損傷修復(fù)，

19、可能有填補缺口損傷修復(fù)，可能有填補缺口的作用。的作用。DNA-pol e e（二）真核生物（二）真核生物DNA聚合酶主要有五種聚合酶主要有五種真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶為了保證遺傳的穩(wěn)定，為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保的復(fù)制必須具有高保真性。真性。DNA復(fù)制時的保真性主要與下列因素有關(guān)：復(fù)制時的保真性主要與下列因素有關(guān)：1.遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；2.DNA聚合酶在復(fù)制時對堿基的正確選擇聚合酶在復(fù)制時對堿基的正確選擇；3.對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯誤及時進(jìn)行校正對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯誤及時進(jìn)行校正。 三、三、DNADNA聚合酶的堿基選擇和校對功能實現(xiàn)復(fù)制

20、的保真性聚合酶的堿基選擇和校對功能實現(xiàn)復(fù)制的保真性The Verification and Base-selection of DNA Polymerase Contribute to the Fidelity of Replication（一）復(fù)制的保真性依賴于正確的堿基選擇（一）復(fù)制的保真性依賴于正確的堿基選擇DNA聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）聚合酶靠其大分子結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)非共價（氫鍵）與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成，即只有當(dāng)堿與共價（磷酸二酯鍵）鍵的有序形成，即只有當(dāng)堿基之間完成正確的氫鍵形成后，才會催化磷酸二酯基之間完成正確的氫鍵形成后，才會催化磷酸二酯鍵的連接。鍵的連接。嘌呤的

21、化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成順式和反式構(gòu)型，與相應(yīng)的嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于嘧啶形成氫鍵配對，嘌呤應(yīng)處于反式構(gòu)型反式構(gòu)型。 嘌呤化學(xué)結(jié)構(gòu)的順式和反式構(gòu)型嘌呤化學(xué)結(jié)構(gòu)的順式和反式構(gòu)型（二）核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)并切除錯配堿基（二）核酸外切酶活性在復(fù)制中辨認(rèn)并切除錯配堿基A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合酶活性摻入正確配對的底物。酶活性摻入正確配對的底物。B：堿基配對正確，：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)外切酶活性。不表現(xiàn)外切酶活性。解旋酶（解旋酶（helicase） ，又稱解鏈酶、又稱解鏈酶、Dn

22、aB蛋白蛋白或或rep蛋白，是用于解開蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶。雙鏈的酶。每解開一對堿基，需消耗每解開一對堿基，需消耗2分子分子ATP。（一）解旋酶、引物酶和引發(fā)體（一）解旋酶、引物酶和引發(fā)體四、復(fù)制時解鏈伴有四、復(fù)制時解鏈伴有DNADNA分子拓?fù)鋵W(xué)的變化分子拓?fù)鋵W(xué)的變化The relaxation of double strand DNA is followed by the topological changes in replication引物酶（引物酶（primerase）本質(zhì)上是一種本質(zhì)上是一種依賴依賴DNA的的RNA聚合酶（聚合酶（DDRP），該酶以，該酶以DNA為模板，為模

23、板，聚合一段聚合一段RNA短鏈引物，以提供自由的短鏈引物，以提供自由的3-OH，使子代使子代DNA鏈能夠開始聚合。鏈能夠開始聚合。引物酶需組裝成引物酶需組裝成引發(fā)體引發(fā)體才能催化才能催化RNA引物的合引物的合成。成。在在E. coli中，含有中，含有解旋酶解旋酶（DnaB蛋白）蛋白） 、DnaC蛋白蛋白、引物酶引物酶（DnaG蛋白）和蛋白）和DNA復(fù)制起始區(qū)復(fù)制起始區(qū)域域的復(fù)合結(jié)構(gòu)被稱為的復(fù)合結(jié)構(gòu)被稱為引發(fā)體（引發(fā)體（primosome） 。DNA復(fù)制起始時的解鏈則是復(fù)制起始時的解鏈則是DnaA（辨認(rèn)復(fù)制起始（辨認(rèn)復(fù)制起始點）、點）、DnaB和和DnaC三種蛋白共同作用的結(jié)果。三種蛋白共同作用

24、的結(jié)果。 Dna A Dna B Dna CDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶含有解螺旋酶(DnaB蛋白蛋白)、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶(DnaG蛋白蛋白)和和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。 引發(fā)體的組裝形成引發(fā)體的組裝形成3 HO53 5 3 5 引物酶催化合成短鏈引物酶催化合成短鏈RNA引物分子引物分子 引物引物引物引物酶酶單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白（single strand DNA binding protein, SSB），又稱螺旋反穩(wěn)蛋白又稱螺旋反穩(wěn)蛋白(HDP)，在真，在真核生物中通常稱

25、為核生物中通常稱為復(fù)制蛋白復(fù)制蛋白A（RPA），是一些能，是一些能夠與單鏈夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。（二）單鏈（二）單鏈DNADNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白Single-strand DNA Binding Protein (SSB)SSB的生理作用的生理作用1. 使解開雙螺旋后的使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，單鏈能夠穩(wěn)定存在，即即穩(wěn)定單鏈穩(wěn)定單鏈DNA，便于其作為模板復(fù)制子代，便于其作為模板復(fù)制子代DNA；2. 保護單鏈保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。（三）（三）DNADNA拓?fù)洚悩?gòu)酶改變拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNADNA超螺旋狀態(tài)超螺旋狀態(tài)人類拓?fù)洚?/p>

26、構(gòu)酶人類拓?fù)洚悩?gòu)酶的分子結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是一類能夠松解拓?fù)洚悩?gòu)酶是一類能夠松解DNA超螺旋超螺旋結(jié)構(gòu)的酶。結(jié)構(gòu)的酶。1010 8 8 局部解鏈后局部解鏈后DNA復(fù)制過程中正超螺旋的形成復(fù)制過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用特點拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用特點既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵、又能連接磷酸二酯鍵 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶的拓?fù)洚悩?gòu)酶的分類分類拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶u切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時候封閉切口，閉切口，DNA變?yōu)樗?/p>

27、弛狀態(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。u反應(yīng)反應(yīng)不需不需ATP。拓?fù)洚愅負(fù)洚悩?gòu)酶構(gòu)酶u切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。u利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機制拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用機制DNA連接酶（連接酶（DNA ligase）可催化兩段可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，從而把兩段相鄰片段之間磷酸二酯鍵的形成，從而把兩段相鄰的的DNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。五、五、DNA連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口連接酶連接復(fù)制中產(chǎn)生的單鏈缺口The G

28、ap of Single Strands Produced in Replication is Sealed by DNA LigaseDNA連接酶連接酶ATPADP+PiHO5POO-O-O353POO-O-O3553DNA連接酶的連接作用連接酶的連接作用DNA連接酶連接酶催化的條件催化的條件是：是： 需一段需一段DNA片段具有片段具有3-OH，而另一段而另一段DNA片段具有片段具有5-Pi基基； 未封閉的未封閉的缺口位于雙鏈缺口位于雙鏈DNA中中，即其中有，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；一條鏈?zhǔn)峭暾模?需要消耗能量，需要消耗能量，由由ATP供能供能。1. DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作

29、用。連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。2. 在在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。3. 是基因工程的重要工具酶之是基因工程的重要工具酶之一。一。DNA連接酶的作用連接酶的作用Section 3 The Process of Prokaryotic DNA Replication1. 由由DnaA蛋白識別復(fù)制起始點（蛋白識別復(fù)制起始點（oriC）。）。2. 由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈鏈DNA（需（需DnaA、B

30、、C蛋白的協(xié)同作用）。蛋白的協(xié)同作用）。3. 單鏈單鏈DNA結(jié)合蛋白（結(jié)合蛋白（SSB）四聚體結(jié)合在兩條單）四聚體結(jié)合在兩條單鏈鏈DNA上，形成上，形成復(fù)制叉復(fù)制叉。（一）（一）DNA的解鏈的解鏈一、復(fù)制的起始一、復(fù)制的起始Initiation of DNA Replication（二）引發(fā)體組裝和引物合成（二）引發(fā)體組裝和引物合成1. 由解旋酶（由解旋酶（DnaB蛋白）蛋白） 、DnaC蛋白、引物酶蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和蛋白）和DNA復(fù)制起始區(qū)域形成復(fù)制起始區(qū)域形成引發(fā)體引發(fā)體；2. 在引物酶的催化下，以在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短為模板，合成一段短的的RNA片段（片

31、段（RNA引物引物），從而獲得），從而獲得3-端自由端自由羥基（羥基（3-OH）。）。 二、復(fù)制的延長二、復(fù)制的延長Elongation of DNA Replication復(fù)制的延長指在復(fù)制的延長指在DNA聚合酶催化下，以聚合酶催化下，以35方向方向的親代的親代DNA鏈為模板，從鏈為模板，從53方向聚合子代方向聚合子代DNA鏈。鏈。復(fù)制延長的化學(xué)本質(zhì)是復(fù)制延長的化學(xué)本質(zhì)是dNTP以以dNMP的方式逐個的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，并催化磷酸二酯鍵加入引物或延長中的子鏈上，并催化磷酸二酯鍵不斷生成。不斷生成。 在原核生物中，參與在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長的是復(fù)制延長的是DNA聚合聚

32、合酶酶。 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-polDNA復(fù)制的延長過程復(fù)制的延長過程領(lǐng)頭鏈的合成過程領(lǐng)頭鏈的合成過程后隨鏈的合成過程后隨鏈的合成過程DNA聚合酶聚合酶催化領(lǐng)頭鏈和后隨鏈同時合成催化領(lǐng)頭鏈和后隨鏈同時合成DNA聚合酶聚合酶催化領(lǐng)頭鏈和后隨鏈同時合成催化領(lǐng)頭鏈和后隨鏈同時合成三、復(fù)制的終止三、復(fù)制的終止Termination of DNA Replication在復(fù)制過程中形成的在復(fù)制過程中形成的RNA引物，需由引物，需由RNA酶酶來來水解去除；水解去除；RNA引物水解后遺留的空缺，由引物水解后遺留的空缺，由DNA聚合酶聚合酶

33、催化延長空缺處的催化延長空缺處的DNA，直到剩下最后一個磷，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的斷口。酸酯鍵的斷口。（一）去除引物，填補空缺（一）去除引物，填補空缺在在DNA連接酶連接酶的催化下，生成斷口最后一個磷的催化下，生成斷口最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。長鏈。 （二）封閉斷口，連接岡崎片段（二）封閉斷口，連接岡崎片段5 5 5 RNA酶酶OH P5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA連接酶連接酶 后隨鏈上不連續(xù)性片段的連接后隨鏈上不連續(xù)性片段的連接Section 4 The Process of

34、 Eukaryotic DNA Replication一、真核生物復(fù)制的起始與原核生物類似一、真核生物復(fù)制的起始與原核生物類似The Initiation in Eukaryotic Replication Is Similar to that in Prokaryotes基本過程包括：解旋解鏈，形成復(fù)制叉；組裝引基本過程包括：解旋解鏈，形成復(fù)制叉；組裝引發(fā)體，合成發(fā)體，合成RNA-DNA引物。引物。主要區(qū)別：主要區(qū)別：1. 復(fù)制起始點更多，序列更短；復(fù)制起始點更多，序列更短；2. 復(fù)制有時序性，分組激活；復(fù)制有時序性，分組激活；3. 參與的酶和蛋白因子更多；參與的酶和蛋白因子更多；4. 復(fù)制

35、的起始與細(xì)胞周期的調(diào)控相關(guān)聯(lián)。復(fù)制的起始與細(xì)胞周期的調(diào)控相關(guān)聯(lián)。真核生物真核生物DNA復(fù)制起始需要：復(fù)制起始需要：1. DNA聚合酶聚合酶a a 與引物酶構(gòu)成復(fù)合體，催與引物酶構(gòu)成復(fù)合體，催化化RNA-DNA引物合成，起始引發(fā)；引物合成，起始引發(fā)；2. DNA聚合酶聚合酶 具有解螺旋酶和具有解螺旋酶和DNA聚合聚合酶活性，參與復(fù)制起始，并且是子代鏈延長酶活性，參與復(fù)制起始，并且是子代鏈延長時主要的復(fù)制酶；時主要的復(fù)制酶；3. DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和復(fù)制因子（拓?fù)洚悩?gòu)酶和復(fù)制因子（RFA、RFC等）；等）；4. 增殖細(xì)胞核抗原（增殖細(xì)胞核抗原（PCNA） 可滑動的可滑動的DNA鏈鉗夾。鏈鉗夾。二、真

36、核生物復(fù)制的延長發(fā)生二、真核生物復(fù)制的延長發(fā)生DNADNA聚合酶的頻繁轉(zhuǎn)換聚合酶的頻繁轉(zhuǎn)換DNA Polymerases could be Exchanged Frequently in the Elongation of Eukaryotic Replication在真核生物在真核生物DNA復(fù)制的延長階段，在引物酶復(fù)制的延長階段，在引物酶-DNA聚合酶聚合酶a a復(fù)合體復(fù)合體催化合成的催化合成的RNA-DNA雜合引雜合引物物的基礎(chǔ)上，由的基礎(chǔ)上，由DNA聚合酶聚合酶 取代取代DNA聚合酶聚合酶a a催催化化領(lǐng)頭鏈的連續(xù)合成，或領(lǐng)頭鏈的連續(xù)合成，或催化后隨鏈催化后隨鏈的不連續(xù)合的不連續(xù)合成。成

37、。真核生物真核生物DNA的復(fù)制裝置的復(fù)制裝置由于真核生物由于真核生物DNA存在較多的復(fù)制子，故領(lǐng)存在較多的復(fù)制子，故領(lǐng)頭鏈和后隨鏈都比較短。頭鏈和后隨鏈都比較短。領(lǐng)頭鏈通常為半個復(fù)制子的長度（雙向復(fù)領(lǐng)頭鏈通常為半個復(fù)制子的長度（雙向復(fù)制），而后隨鏈則大致與一個核小體單位的制），而后隨鏈則大致與一個核小體單位的長度相當(dāng)。長度相當(dāng)。因此，延長階段存在因此，延長階段存在DNA聚合酶聚合酶a a和和DNA聚聚合酶合酶 之間之間的頻繁轉(zhuǎn)換。的頻繁轉(zhuǎn)換。1. 去除引物，填補空缺，連接片段去除引物，填補空缺，連接片段真核生物真核生物DNA復(fù)復(fù)制終止時，首先由制終止時，首先由RNase H和內(nèi)切核酸酶和內(nèi)切核

38、酸酶FEN1水解去水解去除除RNA-DNA引物；由引物；由DNA聚合酶聚合酶e e催化催化填補空缺；再填補空缺；再由由DNA連接酶連接酶催化連接岡崎片段。催化連接岡崎片段。2. 核小體組裝核小體組裝DNA復(fù)制完成后，組蛋白八聚體立即復(fù)制完成后，組蛋白八聚體立即與與DNA重新組裝形成核小體。重新組裝形成核小體。3. 重建端粒重建端粒線狀線狀DNA復(fù)制完成后，復(fù)制完成后，3-末端由于末端由于RNA引物被水解而形成空缺，需進(jìn)行填補，即完成端粒的重引物被水解而形成空缺，需進(jìn)行填補，即完成端粒的重建。建。三、真核生物復(fù)制的終止需組裝核小體和重建端粒三、真核生物復(fù)制的終止需組裝核小體和重建端粒Re-ass

39、embly of Nucleosome and Reconstruction of Telomere Are Needed in Termination of Eukaryotic Replication端粒（端粒（telomere）是是指真核生物染色體線指真核生物染色體線性性DNA分子末端的結(jié)分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。粒狀。功能功能維持染色體的穩(wěn)定性維持染色體的穩(wěn)定性保證保證DNA復(fù)制的完整性復(fù)制的完整性端粒的結(jié)構(gòu)特點端粒的結(jié)構(gòu)特點由末端單鏈由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。末端末端DNA序列是多次重復(fù)的富含序列是多次重復(fù)的富含G、T堿堿基的短序

40、列?；亩绦蛄小TTTGGGGTTTTGGGG線性線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。5 3 3 5 5 3 3 5 端粒酶（端粒酶（telomerase）端粒酶是一種端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其以其RNA為模板，通為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進(jìn)行延長。鏈進(jìn)行延長。端粒酶的分子結(jié)構(gòu)端粒酶的分子結(jié)構(gòu)端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA

41、, hTR)端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 端粒酶的組成端粒酶的組成端粒酶的作用機制端粒酶的作用機制爬行模型爬行模型端粒酶的爬行模型（動畫演示）端粒酶的爬行模型（動畫演示）四、真核生物染色體四、真核生物染色體DNADNA在每個細(xì)胞周期只能復(fù)制一次在每個細(xì)胞周期只能復(fù)制一次Only One Time of Replication Happens in Each Cell Cycle for

42、Eukaryotic Chromosome DNA為了保證子代細(xì)胞中染色體為了保證子代細(xì)胞中染色體DNA的數(shù)目不會發(fā)生改的數(shù)目不會發(fā)生改變，真核生物染色體變，真核生物染色體DNA在每一細(xì)胞周期中只能被在每一細(xì)胞周期中只能被復(fù)制一次。復(fù)制一次。DNA的復(fù)制開始于復(fù)制起始點，這是一種能的復(fù)制開始于復(fù)制起始點，這是一種能自主復(fù)自主復(fù)制的序列（制的序列（ARS），散在分布于整個染色體，散在分布于整個染色體DNA分分子中。子中。在整個細(xì)胞周期中，復(fù)制起始點上結(jié)合有在整個細(xì)胞周期中，復(fù)制起始點上結(jié)合有起始識別起始識別復(fù)合物（復(fù)合物（ORC），其作用是提供一個與其他調(diào)節(jié)因，其作用是提供一個與其他調(diào)節(jié)因子結(jié)合的停泊