下一代測序技術(shù)_技術(shù)回顧與展望

1、中國科學: 生命科學2010年 第40卷 第1期: 23 37 SCIENTIA SINICA Vitae 英文版見: ZHOU X G, REN L F Ren, LI Y T, et al. The next-generation sequencing technology: A technology review and future perspective. Sci China Life Sci, 2010,53, doi: 10.1007/s11427-010-0023-6中國科學雜志社SCIENCE CHINA PRESS評 述下一代測序技術(shù): 技術(shù)回顧與展望周曉光*, 任魯風,

2、李運濤, 張猛, 俞育德, 于軍*中國科學院科研裝備研制項目(批準號: YZ200823資助摘要 在過去的30年中, 作為最重要的生物醫(yī)學研究手段之一, DNA測序技術(shù)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出能力呈指數(shù)增長, 而且這一技術(shù)本身也演變成為一個面向工程學和物理學的新技術(shù)領(lǐng)域. 本文分析了下一代測序儀的技術(shù)特點, 并對其未來的發(fā)展以及應用進行了前瞻性的展望. 預期在剛剛出現(xiàn)的技術(shù)中, 有些技術(shù)假以時日能夠發(fā)展成熟, 實現(xiàn)1000美元基因組和100美元基因組的目標. 同時建議中國科學家在這場對科學研究以及社會醫(yī)療保健體系都將產(chǎn)生深遠影響的運動中發(fā)揮積極的作用.關(guān)鍵詞 基因組學 DNA 測序下一代測序技術(shù)測序儀DNA

3、 測序技術(shù)自發(fā)明以來就一直在推動分子 生物學發(fā)展方面起著至關(guān)重要的作用1. 從早期Frederick Sanger的手工測序, 以及基于Sanger 法開發(fā)的第1代自動化測序儀, 到目前的下一代測序平臺, 這一領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)生了巨大的變化2. 有人甚至將基因組測序技術(shù)的發(fā)展與半導體技術(shù)的發(fā)展相提并論, 這也不無道理3在過去的數(shù)十年中, 每經(jīng)過幾年, 測序速度就呈指數(shù)增長, 與半導體工業(yè)發(fā)展的摩爾定律(Moores law非常相似4. 這種高速的發(fā)展, 如圖1所示, 從根本上改變了人們研究所有生命藍圖的方式. 并且推動了基因組學及其分支乃至其他密切相關(guān)學科的創(chuàng)立與發(fā)展, 諸如比較基因組學、生物信息學

4、、系統(tǒng)生物學以及合成生物學. 某種程度上, DNA 測序技術(shù)的進展已經(jīng)使生命研究的基本元素發(fā)生了轉(zhuǎn)變從單一、局部的基因或基因的片段轉(zhuǎn)變成整個基因組. 反過來, 這種轉(zhuǎn)變又需要更加強大的測序技術(shù)來支持. 測序技術(shù)與其應用之間的協(xié)同關(guān)系使得兩者的發(fā)展在可預見的未來內(nèi)保持這種趨勢, 并且由于其對個體化疾病診斷與治療具有確定性的推動作用而加速. 本文回顧了測序技術(shù)的演進, 分析圖1 測序技術(shù)發(fā)展時間軸周曉光等: 下一代測序技術(shù): 技術(shù)回顧與展望24幾代測序技術(shù)的優(yōu)點與缺點. 并對這一領(lǐng)域可能的發(fā)展方向做出了預測. 為便于討論, 根據(jù)技術(shù)的進展, 將測序技術(shù)分為具有不同亞代的3代(表1. 盡管根據(jù)技術(shù)進

5、展將其劃為不同世代有些武斷, 但是這種方法還是能夠體現(xiàn)每個階段的關(guān)鍵技術(shù)進展.1 技術(shù)回顧與近期發(fā)展1.1 第1代測序技術(shù)熒光標記的Sanger 法在第一臺全自動測序儀出現(xiàn)之前, 使用最為廣泛的測序方法就是Sanger 在20世紀70年代中期發(fā)明的末端終止法測序技術(shù). Sanger也因此獲得1980年的諾貝爾化學獎5. 他的發(fā)明第一次為科研人員開啟了深入研究生命遺傳密碼的大門.原來的方法主要依靠手工操作, 難以自動化. 例如, 它利用放射性同位素標記引物來進行DNA 梯狀成像, 操作十分不方便. 要使用雙脫氧核苷酸分別做4個末端終止反應, 然后采用平板凝膠電泳技術(shù), 用4條電泳道來分離4個反應

6、所得產(chǎn)物, 費時費力, 試劑消耗也大, 這些都嚴重限制了測序的通量. 因此, 對于開發(fā)非放射性的第一代測序技術(shù)勢在必行.(1 G1.1. 最早版本的第1代測序儀是20世紀80 年代中期在Cal Tech的Leroy Hood實驗室發(fā)明的6. 這一測序儀通過修改Sanger 法得以實現(xiàn). 最關(guān)鍵的改變是采用具有顏色的熒光染料代替同位素標記. 4種雙脫氧核苷酸終止子被標記上不同顏色的熒光基團. 另外, 與最初的Sanger 法不同, 熒光基團是標記在終止子上, 而不是在引物上. 這種不同顏色標記的方案可以實現(xiàn)一個反應管中同時進行4個末端終止反應. 采用聚丙烯酰胺凝膠分離, 并通過計算機熒光檢測系統(tǒng)

7、分析梯狀反應產(chǎn)物. 這些改進極大地提高了測序速度, 減少了測序過程中的人為干擾.次年, 利用Leroy Hood實驗室的技術(shù), ABI推出了第一款半自動DNA 測序儀ABI 3707. 在隨后的20年中, 測序儀的性能得到了極大的提升. 但基本工作原理直到最近才有所改變.(2 G1.2. 第1代測序儀的第2個版本出現(xiàn)在20世紀末. 這一版本的測序儀, 其測序速度與質(zhì)量得到了進一步的提高. 這主要歸功于兩方面的工作: 第一, 平板電泳分離技術(shù)被毛細管電泳所取代; 第二, 通過更高程度的并行化使得同時進行測序的樣本數(shù)量增加. 使用毛細管替代平板凝膠取消了手工上樣, 降低了試劑的消耗, 提升了分析的

8、速度. 另外, 緊湊的毛表1 測序技術(shù)發(fā)展路線a代次 第1代第2代第3代版本 1.1 1.2 2.1 2.2 2.3 3.1 3.2 平 臺Sanger 法ABIABI/GenoMEMSSBS Illumina SBL ABI/Polonator G.007CompleteGenomicsSBP RocheSM-SBSFDHelicos ?FEPacific Biosciences/ VisiGenSM-SBL SM-SBP納米孔PoC 刀 PoC 石墨烯PoCa SBS: 合成法測序(sequence-by-synthesis; SBL: 連接法測序(sequence-by-ligation

9、; SBP: 焦磷酸測序(sequence-by-pyrosequencing;SM: 單分子(single molecule; FD: DNA固定化(fixed DNA; FE: 酶固定化(fixed enzyme; PoC: 概念驗證(proof-of-concept; ?: 預期可能出現(xiàn)的技術(shù)中國科學: 生命科學 2010年 第40卷 第1期 25細管電泳設(shè)備的形式更易于實現(xiàn)并行化, 可以獲得更高的通量. ABI 3730測序儀和Amersham Mega- BACE 分別可以在一次運行中分析96個或384個樣本. 這一代測序儀在人類基因組計劃DNA 測序的后期階段起到了關(guān)鍵的作用, 加

10、速了人類基因組計劃的完成. 而且由于其在原始數(shù)據(jù)質(zhì)量以及序列讀長方面具有的優(yōu)勢, 這些測序儀今天還在使用之中.通過幾十年的逐步改進, 第1代測序儀的讀長可以超過1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%, 測定每千堿基序列的成本是0.5美元, 每天的數(shù)據(jù)通量可以達到600000堿基. 不論這些數(shù)字如何令人印象深刻, 第1代測序技術(shù)在速度和成本方面都已達到了極限. 由于其對電泳分離技術(shù)的依賴, 使其難以進一步提升分析的速度和提高并行化程度, 并且難以通過微型化降低測序成本. 因此, 需要開發(fā)全新的技術(shù)來突破這些局限.盡管如此, 第1代技術(shù)是不會很快消失, 它將與新的若干代測序平臺并

11、存. 這些久經(jīng)考驗的方法可靠、準確, 且已形成規(guī)?；? 特別是在PCR 產(chǎn)物測序、質(zhì)粒和細菌人工染色體的末端測序、以及STR 基因分型方面, 將繼續(xù)發(fā)揮重要作用.1.2 第2代測序技術(shù)循環(huán)陣列合成測序法所謂下一代測序方法, 包括大量基于不同技術(shù)的方法. 盡管從模板文庫制備、片段擴增到測序, 這些方法所采用的技術(shù)與生物化學相當多樣, 但是都采用了大規(guī)模矩陣結(jié)構(gòu)的微陣列分析技術(shù)陣列上的DNA 樣本可以被同時并行分析. 此外, 測序是利用DNA 聚合酶8或連接酶9以及引物對模板進行一系列的延伸, 通過顯微設(shè)備觀察并記錄連續(xù)測序循環(huán)中的光學信號實現(xiàn)的.在一般性描述中, 下一代測序技術(shù)的幾個關(guān)鍵特點是顯

12、而易見的: 第一, 通過有序或者無序的陣列配置可以實現(xiàn)大規(guī)模的并行化, 以提供高程度的信息密度. 理論上, 只有光的衍射極限會限制并行化的提高(即用來檢測獨立光學事件的半波長. 這極大地提高了總的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量; 第二, 不采用電泳, 設(shè)備易于微型化. 相對于第1代測序技術(shù), 樣本和試劑的消耗量得以降低.(1 G2.1下一代測序儀. 所有的下一代測序平臺遵循了類似的工作流程, 如圖2所示, 都要經(jīng)過克隆擴增以加強測序過程中的光學檢測靈敏度. 3種廣泛使用的商業(yè)化平臺是Illumina 的Genome Analyzer, 羅氏454基因組測序儀以及AB Life Technologies的SO

13、LiD 系統(tǒng). 它們基本都是在20世紀90年代末被發(fā)明和開發(fā)出來, 在2005年前后商業(yè)化. Polonator G.007是最近剛剛實現(xiàn)商業(yè)化的新設(shè)備, 該儀器最初由哈佛大學George Church實驗室開發(fā), 現(xiàn)在由Dover Systems公司制造. Complete Genomics公司最近推出了基于其專利技術(shù)的測序服務平臺, 但該公圖2 第2代測序技術(shù)工作流程周曉光等: 下一代測序技術(shù): 技術(shù)回顧與展望26司并沒有表示要在市場銷售這一設(shè)備. 這些儀器都采用了合成測序法, 只是在DNA 陣列的排布、DNA 簇擴增, 以及基于酶的測序生化反應方面存在差異.首先, 構(gòu)建DNA 模板文庫.

14、 通過隨機打斷基因組DNA 獲得DNA 文庫片段(長度為數(shù)十到數(shù)百堿基, 或者構(gòu)建控制距離分布的配對末端片段. 在雙鏈片段的兩端連上接頭序列, 然后變性得到單鏈模板文庫, 并固定在固體表面上. 固體表面可以是平面或是微球的表面. 克隆的擴增通過以下幾種方式之一進行, 如橋式PCR 10、微乳滴PCR 11或原位成簇12. 在芯片上形成DNA 簇陣列的DNA 簇或擴增微球, 利用聚合酶或者連接酶進行一系列循環(huán)的反應操作, 通過顯微檢測系統(tǒng)監(jiān)控每個循環(huán)生化反應中產(chǎn)生的光學事件, 用CCD 相機將圖像采集并記錄下來. 對產(chǎn)生的陣列圖像進行時序分析, 獲得DNA 片段的序列. 然后按照一定的計算機算法

15、將這些片段組裝成更長的重疊群.(i Illumina Genome Analyzer. 單鏈文庫片段的擴增是通過所謂“橋式擴增”過程實現(xiàn)的13. 單鏈DNA 兩端加上非對稱的接頭, 并利用兩端的接頭將片段固定在芯片表面形成寡核苷酸橋. 芯片具有8個獨立的道, 每條道的表面均可固定寡核苷酸. 固定了寡核苷酸橋的芯片放置于流通池內(nèi). 經(jīng)過多個PCR 熱循環(huán), 成千上萬的復制產(chǎn)物制備出來, 每一簇都分別固定在芯片表面一個單一的物理位置上. 流通池中芯片表面的8個道中, 每條道上都可以獨立產(chǎn)生數(shù)百萬這樣的簇(這樣, 可以在一個反應中對8個不同的文庫并行測序. 然后, 測序引物雜交到擴增產(chǎn)物中的通用序列

16、上, 開始測序反應.Illumina 公司的測序儀采用合成測序法, 使用熒光標記的核苷酸以及可逆的終止子. 在每一輪測序循環(huán)中, 標記不同熒光基團的4種核苷酸以及DNA 聚合酶同時加入流通池通道中, 按照堿基互補配對的原則進行DNA 鏈的延伸. 每個核苷酸的3羥基是被封閉起來, 以防止額外的延伸. 采集熒光圖像, 堿基特異的熒光標記揭示了這一輪中新加入核苷酸是什么, 也就獲得模板中這一位置的DNA 序列. 然后, 打開3端, 繼續(xù)進行下一輪反應. 這一過程重復多次, 到50個循環(huán), 產(chǎn)生50個堿基的DNA 序列.該平臺的測序通量是傳統(tǒng)平臺(第1代測序儀 的數(shù)千倍. 其主要的缺點是由于光信號衰減

17、和移相的原因使得序列讀長較短. 由于要記錄每個DNA 簇的光學信號, 每一簇中所有DNA 鏈的延伸保持同步至關(guān)重要. 但是, 測序中每一步化學反應都可能失敗, 例如不能將熒光標記物切掉, 或者未能去除封閉基團. 這將導致一個簇中的一些DNA 鏈過長, 而另一些DNA 鏈可能沒有同步延伸, 進而引起信號衰減或熒光信號相位移. 此外, 錯誤率是累積的, 即DNA 鏈越長, 錯誤率越高. 這些都限制了讀長的增加.(ii Roche 454 Genome Sequencer. 454測序儀利用微乳滴PCR(emulsion PCR, emPCR來生成擴增產(chǎn)物14. 將固化引物的微球與單鏈DNA 文庫模

18、板以及必要的PCR 反應化合物一起混合, 微球與文庫片段的比例適當, 以確保大多數(shù)微球結(jié)合的單鏈DNA 分子不超過一個. 水溶液與油混合形成油包水結(jié)構(gòu)乳滴. 每個乳滴都是一個進行后續(xù)PCR 反應的微型化學反應器. 經(jīng)過多輪熱循環(huán), 每個微球表面都結(jié)合了數(shù)千個相同的DNA 拷貝. 然后富集微球, 轉(zhuǎn)移并放置到刻有規(guī)則微孔陣列的微孔板上. 每個微孔只能容納一個微球. 微孔板被安裝成為流通池的一部分. 其中一面可以通過測序反應的化合物, 另一面則與CCD 光學檢測系統(tǒng)的光纖部件相接觸.堿基測定采用邊合成邊測序, 利用焦磷酸法產(chǎn)生的光學信號來進行檢測15. 通常所說的焦磷酸測序法是利用ATP 硫酰化酶

19、和熒光素酶. 在三磷酸核苷結(jié)合到DNA 鏈上的時候釋放焦磷酸, 通過ATP 硫?；负蜔晒馑孛府a(chǎn)生一系列級聯(lián)反應, 導致生物化學發(fā)光放出光信號. 測序是順次向流通池中加入4種dNTP 中的一種. 每個微孔之中有或是沒有光信號釋放出來分別表明dNTP 連接到片段上或者不是互補的核苷酸, 這樣也就確定了DNA 模板上的互補堿基.焦磷酸測序的主要優(yōu)勢是它的速度和讀長將近500堿基. 與這里討論的其他下一代測序技術(shù)不同, 除了DNA 聚合酶反應所需化合物, 焦磷酸測序法并不需要額外的化合物用于DNA 鏈的延長, 例如, 并不需要去掉標記基團或解除終止子的封閉, 這就降低了化學反應出現(xiàn)意外的幾率. 導致

20、移相的主要原因如DNA 鏈提前終止或者延伸不同步出現(xiàn)的幾率較少. 但是這種非同步的處理方式也賦予焦磷酸測序技術(shù)一個局限, 由于沒有終止基團可以停止DNA中國科學: 生命科學 2010年 第40卷 第1期27鏈的延伸, 在測定同核苷酸聚合物區(qū)域時, 如一連串的GGGGGG, 焦磷酸測序會遇到問題, 不得不依靠光信號的強度來推斷同聚核苷酸的長度, 這就容易產(chǎn)生錯誤. 因此, 這一技術(shù)平臺主要的錯誤類型就是插入-缺失, 而不是堿基的替換. 454的另一個缺點是由于它依賴于包含一系列酶的焦磷酸檢測, 與其他下一代測序技術(shù)相比, 其試劑價格相對較高.(iii Life Technologies SOLi

21、D System. 與454的情況相同, SOLiD系統(tǒng)也采用了微乳滴PCR 與微球相結(jié)合的策略來擴增DNA 模板. 打破微乳滴后, 擴增微球被收集、富集并固定在一個平的玻璃基板上形成一個無規(guī)則的陣列.它的邊合成邊測序采用的是連接反應而不是上述平臺所采用的聚合反應16. 另外, 它采用了雙堿基編碼策略來協(xié)助檢測錯誤. 一段與DNA 文庫模板連在微球上的接頭序列互補的通用引物雜交到接頭區(qū)域上, 然后進行一系列連接反應. 每個連接反應都發(fā)生在延伸鏈和有熒光標記的變性八核苷酸探針池中的探針(熒光標記在第8堿基上 間. 八核苷酸探針池設(shè)計成在核苷酸的堿基識別位點, 其第1和2位的堿基與特定的熒光顏色有

22、明確的對應關(guān)系. 連接反應后, 獲取熒光圖象. 接下來, 在第5和6位堿基之間切開八核苷酸, 將最后3個堿基以及熒光基團去除. 接下來每一輪連接反應都可以獲得延伸鏈上第1和2位堿基的信息(即模板序列的第12, 67, 1112, 1617, 2122, 2627以及第3132位上的堿基. 7輪連接反應后, 已經(jīng)擴增的鏈變性脫落, 系統(tǒng)重置. 第2個引物結(jié)合到接頭區(qū)域. 第2個引物在DNA 模板上的起始位置與第1個引物相比提前一個堿基. 接下來有另外7輪上述連接循環(huán). 這樣就可以讀取一組新的位置01, 56,等的信息. 這一過程繼續(xù)進行, 重置后所用的引物都比上一個引物提前一個堿基, 直到所有位

23、置上的序列信息均被讀取. 這種方法雖然聽上去較復雜, 但實際上, 整個系統(tǒng)都是在計算機控制下自動運行. 由于每個堿基都被測定了兩遍, 即在兩個獨立的連接反應中被測定, 這個方法使該測序技術(shù)具有可以確定錯誤識別堿基的優(yōu)點16. 該技術(shù)主要的缺點是序列讀長相對較短. 這也是由于同一簇擴增產(chǎn)物中存在移相造成的.(iv Polonator G.007. Polonator是另外一款使用連接測序技術(shù)的下一代測序儀. 它采用的是單堿基探針, 而不是上述雙堿基編碼的策略. 測序是通過在結(jié)合到經(jīng)微乳滴PCR 擴增的DNA 簇上的通用引物與九堿基探針之間的一系列連接反應進行的9. 每次連接反應, 將一個九堿基探

24、針池與DNA 連接酶一起加入, 以進行引物-探針連接. 九堿基探針池中包括很多熒光標記的變性寡核苷酸探針. 熒光標記與每個讀取位置對應(即熒光顏色與讀取位置的堿基相對應. 每次連接之后獲取熒光圖像. 然后, 延伸的引物探針鏈經(jīng)變性進行系統(tǒng)重置. 接下來, 對下一個讀取位置進行引物與第2個九堿基探針池之間的連接. 這一重置-連接-獲取圖像的過程重復進行, 直到所有位置的信息被讀取.這一系統(tǒng)中, 系統(tǒng)重置后, 并不需要進行連串的連接反應, 因此測序錯誤也不累積, 這是該系統(tǒng)的一個優(yōu)點. 但是, 這就使引物間可能的讀取位置受到限制, 讀長更短. 這一缺陷在某種程度上可以通過在文庫序列中使用多重錨定位

25、置來擴展讀取區(qū)間. 與其他商業(yè)化的下一代測序儀相比, Polonator的價格明顯低得多, 而且是一個開源的技術(shù)平臺, 就是說它允許最終用戶變更并且改進測序操作或化學試劑.(v Complete Genomics. Complete Genomics所采用的連接測序方法基本與Polonator 相同. 只不過它采用了獨特的設(shè)計, 增加芯片表面DNA 簇的密度, 以降低試劑的消耗17. 為了增加讀長, 在基因組片段兩側(cè)加上了多個(4個 接頭以形成環(huán)狀DNA 模板18. 模板序列通過環(huán)形PCR 擴增, 以獲得包含源于模板序列的兩百個拷貝的串聯(lián)體. 這種串聯(lián)體折疊成球狀結(jié)構(gòu), 被稱為DNA 納米球(

26、DNB. 每個球自動聚集在水平基質(zhì)表面的黏性(活化 點上, 形成高密度的納米球陣列. 納米球不會黏在芯片上活化點中間的區(qū)域, 這樣就形成了一個規(guī)則排布的納米球矩陣. 因為納米球可以更加有效的利用三維空間, 與DNA 簇或者微球相比, 納米球可以形成密度更高的陣列. 這一技術(shù)還取消了在其他下一代測序儀中都使用的流 通池19.該測序技術(shù)采用的方法與Polonator 相近, 即連接測序, 使用單堿基讀取特定位置信息. Complete Genomics 創(chuàng)造了組合探針錨定連接(combinatorial probe-anchor ligation, cPAL的方法. cPAL的變性寡核周曉光等:

27、下一代測序技術(shù): 技術(shù)回顧與展望28苷酸探針庫中的探針用熒光標記, 4種不同顏色的熒光分別與給定位置上4種不同的堿基相對應. 讀取每一個位置, 都有一個單獨的探針庫. 根據(jù)堿基互補配對原則, 一個特定的探針庫與錨定序列在讀取位置處連接起來, 通過熒光顏色對應讀取出相應的堿基信息. 每次讀取后, 探針與錨定序列復合體被洗去. 另一個錨定序列與模板雜交, 針對另外一個位置的探針庫加入循環(huán). 這一過程重復進行直到讀取所有位置的信息. 最近Complete Genomics通過測定3個人類基因組, 展示了其測序的準確度以及成本效益20.由于沒有使用AB SOLiD系統(tǒng)的連續(xù)性探針, 使得該技術(shù)具有一些

28、優(yōu)點. 首先, 沒有記憶效應, 前面連接循環(huán)中產(chǎn)生的錯誤不會帶到后面的循環(huán)中, 具有更高的容錯能力; 另外, 每個循環(huán)中連接產(chǎn)量不高, 降低了如探針以及錨定序列等試劑的用量. 但是, 由于寡核苷酸探針的長度限制(9個堿基, 從每個錨定序列位置獲得的讀長依然很短. 對每個文庫片段, 使用4個錨定位置以獲取全部序列.與第1代測序儀相比, 以合成測序為基礎(chǔ)的下一代測序平臺速度顯著提高, 成本明顯降低. 每臺設(shè)備每天產(chǎn)出千兆堿基的序列不足為奇. 但是, 除了羅氏的454平臺之外, 讀長短成了下一代測序平臺的致命傷. 這主要是由于DNA 簇中存在的光學信號移相造成的. 應運而生的單分子測序技術(shù)是解決這一

29、問題的一種方案.(2 G2.2單分子測序(SMS. 為克服下一代測序平臺讀長較短這一主要缺點, 經(jīng)過努力, 開發(fā)出了單分子測序平臺, 通過在單一DNA 分子組成的陣列上進行合成測序. 在一個限定的表面上, 使用單個分子可以增加獨立分析的DNA 片段的數(shù)量. 因此, 可以使數(shù)據(jù)產(chǎn)出量更高. 當然, 這也意味著不再需要昂貴的DNA 簇擴增步驟了. 這將進一步降低測序的成本. 但同時也帶來了一些新的挑戰(zhàn), 主要是集中在單分子水平光學信號的檢測方面. 主要的問題是要降低非檢測特異性的背景干擾, 例如沒有參與到實際化學反應中的游離熒光分子. 有幾種不同的辦法試圖解決這一問題. 基本的原則都是將檢測局限在

30、測序反應發(fā)生的實際位置附近, 例如使用消逝波. 下面介紹一些已經(jīng)開發(fā)或正在開發(fā)中的平臺.(i Helicos HeliScope. Helicos Biosciences公司開發(fā)的HeliScope 遺傳分析系統(tǒng)是近來市場上最早出現(xiàn)的單分子測序儀器. 它以Quake 集團的工作為基礎(chǔ)21, 在單個分子上邊合成邊測序. 構(gòu)建的單鏈DNA 文庫未經(jīng)擴增, 沒有規(guī)律地排列在平面基板上. 每個測序循環(huán)中, DNA聚合酶和4種熒光標記的核苷酸中的一種流入, 按照模板序列延伸DNA 鏈, 陣列中發(fā)生了堿基延伸反應的DNA 鏈就會發(fā)出熒光, 并通過CCD 記錄下來. 經(jīng)過洗滌, 延伸了的DNA 鏈上的熒光物

31、質(zhì)被切除并被移走, 便可以進行下一輪單個堿基的延伸, 熒光標記的切除以及圖像的獲取. 在焦磷酸測序中, 每個重復的循環(huán)是不同步的, 陣列中的一些鏈可能延伸到前邊, 一些可能落在后面, 甚至根本沒有延伸. 而在這里, 每條鏈都是獨立操作的, 根本不用考慮移相的問題. 但是這也意味著, 焦磷酸測序法所遇到的同核苷酸寡聚物對HeliScope 也是問題. 與454不同, 單分子操作可以讓人們通過動力學控制酶的反應, 降低DNA 鏈延伸的速度, 在dNTP 被洗掉前, 減少兩個連續(xù)堿基連接在鏈上的可能22.如前所述, 檢測是單分子測序技術(shù)所面臨的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn). HeliScope利用了一項被稱為全內(nèi)反

32、射顯微鏡(total internal reflection microscopy, TIRM的技術(shù). 只有靠近流通池反應表面很薄的一層空間內(nèi)的熒光集團才能被消逝波所激發(fā)產(chǎn)生熒光23. 這有助于降低熒光背景. 盡管有精密的光學儀器, 捕捉單分子事件仍然是個挑戰(zhàn). 因此, 與成簇檢測為基礎(chǔ)的測序儀先行者相比, 該平臺的原始數(shù)據(jù)準確度明顯較低, 主要的錯誤類型是缺失. 但是, 雙向測序策略可以顯著提升準確率. 單分子意味著可以在測序結(jié)束后, 去掉延伸鏈, 將模板重置為最初的狀態(tài). 從而可以利用遠端的接頭, 從相反的方向進行另一次測序, 生成同一模板的第2個序列信息. 重復的序列可以用于去除缺失錯誤

33、, 因而, 相對于單向測序顯著提高了準確率.(ii VisiGen. VisiGen生物技術(shù)公司, 目前是Life Technologies 的一部分. 該公司一直致力于研發(fā)一種單分子的合成測序儀24.概括地說, 他們加工了一種蛋白質(zhì)納米裝置來實時觀察和記錄DNA 聚合酶合成DNA 的過程. 這是通過熒光供體和受體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET實現(xiàn)的.中國科學: 生命科學 2010年 第40卷 第1期29在熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程中, 只有在附近存在能量供體時, 受體分子才會在激發(fā)狀態(tài)下發(fā)出熒光. 在他們的設(shè)計中,

34、每一個dNTP 分子的磷酸上攜帶一個具有特定顏色的熒光受體基團, 而DNA 聚合酶經(jīng)過修飾, 在其活性位點附近攜帶一個熒光供體基團. 在DNA 堿基延伸的時候, 一個與模板配對的堿基被DNA 聚合酶捕獲, 并使熒光受體基團靠近供體基團. 熒光能量轉(zhuǎn)移發(fā)生, 發(fā)出相應顏色的熒光. 一旦結(jié)束, 熒光基團作為焦磷酸的一部分被DNA 聚合酶釋放. 這樣在本質(zhì)上當核苷酸連接起來的同時協(xié)同地產(chǎn)生了一個熒光的爆發(fā). 通過記錄和分析時序的熒光爆發(fā)就構(gòu)建了DNA 序列信息. 值得注意的是在去除熒光標記或是切除封閉基團時, 整個過程是沒有停頓的, 這確實是一個實時的過程, 意味著其工作速度極快, 要考慮到光學記錄

35、裝置能否跟上這一速度. 為了進一步降低背景的干擾, 他們也采用全內(nèi)反射顯微鏡作為熒光檢測設(shè)備. 而且, 與Helicos 的平臺不同, 這套系統(tǒng)將DNA 聚合酶固化在基質(zhì)表面上, 而不是固定DNA. 這樣DNA 鏈的延長就不受限制. 固定酶而不是DNA 的另一個好處是當DNA 延長時, 可以將核苷酸連接控制在很小的檢測空間范圍內(nèi), 即DNA 鏈增長時熒光不會超出檢測范圍. 盡管Life Technolo- gies 公司沒有公布儀器的性能, 但估計它的速度很 快, 且讀長較長. 理論上, 讀長只是由DNA 聚合酶的處理特性決定的. 實際上, 其他因素, 如DNA 聚合酶上攜帶的熒光供體的光漂白

36、作用也會限制讀長. 據(jù)報道, Life Technologies公司正在開發(fā)一種量子點熒光標記以解決這一問題.(iii Pacific Biosciences. Pacific Biosciences公司致力于開發(fā)一種新的測序技術(shù)單分子實時技術(shù)(single molecule real time, SMRT25. 這一單分子合成測序技術(shù)依賴于被稱為零級波導(zero mode waveguide, ZMW的納米結(jié)構(gòu)來實時觀察DNA 的聚合26. 該結(jié)構(gòu)在一片薄金屬膜上蝕刻出數(shù)以千計直徑數(shù)十納米的亞波長小孔. 并將金屬膜附著在透明的支持基質(zhì)上. 由于每個小孔的尺寸低于光的波長, 所以當光線從透明

37、一側(cè)照射時無法透射. 并且在每個小孔的底部形成指數(shù)衰減的消逝波, 這樣創(chuàng)造了一個很小體積的檢測空間. 每個小孔底部固定一個聚合酶分子. 在測序過程中, 由固定的酶根據(jù)單鏈DNA 模板合成雙鏈. 每次加入一個堿基, 聚合酶捕獲具有熒光標記的dNTP(也是標記在-磷酸上, 并將其帶到檢測區(qū)間, 產(chǎn)生熒光光曝. 光曝的熒光顏色就揭示了模板上的互補堿基. 通過連續(xù)實時的監(jiān)控每個波導孔的熒光光曝, 就快速測定了每一個孔內(nèi)DNA 模板的序列.PacificBio 的技術(shù)在高速測序、長序列產(chǎn)出和低成本方面有著巨大的潛力. 但是, 與其他單分子測序平臺一樣, 實時檢測單個分子對于提高原始數(shù)據(jù)準確率是一個挑戰(zhàn),

38、 并可能成為一個障礙. 如前所述, 可以通過對同一樣品進行重置后進行多次測序來減少誤讀. 另外, 當前的CCD 技術(shù)也限制了同時觀察零級波導的最大面積. 聚合酶所占據(jù)的零級波導比例較低(約30%也限制了可用的波導數(shù)量27. 所有這些都成為提高SMRT 技術(shù)數(shù)據(jù)通量的限制. 盡管有這些限制, 預計在2010年推出的第一個版本的設(shè)備的序列讀長將不低于1500個堿基, 一次測序只要15 min, 每次測序的實際成本不超過60美元. 當這些技術(shù)問題都被解決的時候, 預計未來版本的設(shè)備每天可能產(chǎn)出100G 的數(shù)據(jù), 而序列讀長將達到10萬堿基.(iv Mobious Nexus I. 除了宣布他們打算開

39、發(fā)一款單分子測序儀之外, 到目前為止, Mobious Biosy- stems 公司并沒有透露關(guān)于其Polykinetic Sequencing技術(shù)的很多細節(jié)28. 該技術(shù)利用了聚合酶在DNA 合成時的天然化學方式. 當聚合酶按照模板, 將堿基連接到DNA 鏈上時, 它首先需要測試溶液中某一堿基以確定其是否與模板堿基相匹配. 如果不匹配, 則馬上將該堿基釋放. 如果匹配, 聚合酶將抓住它, 并繼續(xù)進行耗時的步驟, 將核苷酸連接到DNA 鏈上. Mobious 的合成測序方法就是利用匹配與不匹配堿基在這一步驟所需時間的差異進行檢測. 按照順序, 每次在反應體系中加入4種核苷酸中的一種, 通過測

40、定DNA 聚合酶(固定在基質(zhì)表面上 抓住核苷酸以及完成聚合的時間, 可以推斷出該核苷酸與模板是否匹配. 檢測聚合酶的構(gòu)象變化就可以來記錄這一過程中的時間差異. VisiGen所采用的使用配對的供體和受體的熒光共振能量轉(zhuǎn)移策略也可用于這一檢測. 熒光的主要問題是熒光基團的光漂白. 為解決這一問題, Mobious利用酶的構(gòu)象改變時電磁性質(zhì)發(fā)生變化的特性, 通過離子體共振光譜, 核磁共振等進行檢周曉光等: 下一代測序技術(shù): 技術(shù)回顧與展望30測29. 除去單分子測序本身的原因, 這種方法所帶來的一個優(yōu)點是由于沒有使用熒光標記核苷酸, 試劑成本降低的空間更大.1.3 第3代測序技術(shù)直接測序在所有上述

41、第2代測序技術(shù)中, 序列都是在熒光或者化學發(fā)光物質(zhì)的協(xié)助下, 通過讀取DNA 聚合酶或DNA 連接酶將堿基連接到DNA 鏈上過程中釋放出的光學信號而間接確定的. 除了需要昂貴的光學監(jiān)測系統(tǒng), 還要記錄、存儲并分析大量的光學圖像. 這都使儀器的復雜性和成本增加. 依賴生物化學反應讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用, 在目前測序成本中比例相當大. 直接讀取序列信息, 不使用化學試劑, 對于進一步降低測序成本是非?？扇〉? 在一個正在發(fā)生突破瓶頸巨變的領(lǐng)域內(nèi), 很難準確預測未來將發(fā)生什么. 但是, 最近幾個領(lǐng)域大量的研究工作表明未來新一代的測序平臺將在其中產(chǎn)生.(1 非光學顯微鏡成像. 常言道“百

42、聞不如一見”, 確定DNA 序列的最直接方法之一就是將核苷酸(主要是堿基 的空間線性排列方式可視化. 如果一個DNA 鏈的圖片具有足夠高的分辨率, 可以將DNA 鏈上的4種堿基區(qū)分開來, 那么序列將非常容易地被讀出. 這正是目前顯微鏡領(lǐng)域科研人員所努力實現(xiàn)的. 這一設(shè)想是借助具有原子水平分辨率的非光學顯微鏡, 如掃描隧道顯微鏡(STM、原子力顯微鏡(AFM等30,31. 盡管非常有限, 但還是有一定的進展. 最近, 日本大阪大學的研究小組發(fā)現(xiàn), 在一條拉長的DNA 鏈上, 利用掃描隧道顯微鏡的圖像, 根據(jù)獨特的電子指紋, 可以將鳥嘌呤與其他3種堿基區(qū)分開來32. 另外一些團隊一直積極地致力于使

43、用原子力顯微鏡來記錄將每個堿基緊密連接的環(huán)拉開所需力的大小, 以區(qū)分不同的堿基33. 而ZS Genetics公司致力于使用電子顯微鏡直接測序. 為了解決天然DNA 分子在電子顯微鏡下對比度不足的問題, 他們在聚合酶合成新DNA 鏈時加入更重的元素34. 在電子顯微鏡下觀察就可以獲得的更重的DNA 并確定其序列.(2 納米孔. 本研究注意到另外一個非?；钴S的領(lǐng)域是利用納米孔結(jié)構(gòu)進行測序. 顧名思義, 納米孔就是直徑在納米尺度的小孔(12 nm. 通常是利用固態(tài)物質(zhì)或者生物分子制成的小孔. 這種想法是在電場驅(qū)動下, 當線狀DNA 分子通過小孔時, 通過一些物理手段來確定堿基的序列. 在全球, 許

44、多公司和組織, 如Agilent, DNA Electronics, IBM, NabSys, Oxford Nanopore Technologies, Sequenom等都在進行納米孔測序的開發(fā), 但采用的方法不同.所有以納米孔為基礎(chǔ)的測序技術(shù)都面臨兩個關(guān)鍵的挑戰(zhàn)35: ( 區(qū)分4種核苷酸的速度要與DNA 運動的速度相稱; ( 控制DNA 通過納米孔的速度. 初步嘗試測量離子電流的波動單鏈DNA 分子通過納米孔時, 堵塞納米孔從而造成電壓的波動. 但迄今為止, 成效甚微. 計算和實驗表明, 僅僅測量通過納米孔離子電導率是不可能提供識別DNA 分子中每個核苷酸所需要的分辨率36. 納米孔通道

45、長度通常為5 nm, 可以容納十多個堿基, 這一尺寸對于測序所需要的分辨單個堿基引起的電流變化過長.盡管離子電流測量還不能區(qū)分單個堿基, 但其可以很容易地辨別單鏈與雙鏈DNA 37. NABsys公司與Brown 大學的一個團隊合作, 利用這一性能來開發(fā)一種雜交測序法雜交輔助的納米孔測序方法(hybridization assisted nanopore sequencing, HANS38. 將基因組DNA 隨機切割成大約100 kb左右的片段, 制成單鏈并與六寡聚核苷酸探針雜交. 然后驅(qū)動結(jié)合了探針的基因組文庫片段通過可尋址的納米孔陣列. 通過每個孔的離子電流均可獨立測量. 追蹤電流的變化

46、確定探針雜交在每個基因組片段上的精確位置. 利用基因組片段上雜交探針的重疊區(qū)域?qū)⒒蚪M片段文庫排列起來, 建立一組完整的基因組探針圖. 利用計算機算法, 獲得完整的基因組序列. 但確定雜交位置的精確度和一致性還需要進一步驗證.為了提高納米孔的靈敏度以確定不同的堿基, 科研人員也在嘗試其他方法, 包括在納米孔內(nèi)嵌入電子探針39. 他們期望僅靠納米孔兩側(cè)的隧道電極在每個堿基被驅(qū)動通過納米孔時能夠記錄特征性隧道電流. 計算機模擬以及成功用于揭示原子水平特性的掃描隧道顯微鏡的經(jīng)驗都讓本研究組對這一工作持樂觀態(tài)度. 但制作這種納米尺度的裝置并不簡單. 對這一問題, 另一個創(chuàng)造性的解決方案是發(fā)展化學功能的

47、納米孔, 而不是嵌入固態(tài)電極. Lindsa及其同事提出了在核酸通過納米孔時, 使用兩種化學探針分別與磷酸基團和堿基基團形成氫鍵的設(shè)想. 與中國科學: 生命科學 2010年 第40卷 第1期31磷酸基團作用的探針起到捕獲核酸的作用, 而與堿基作用的探針起到識別的作用40. 針對4種不同的核苷酸, 需要4種不同的探針.另外一些研究團隊正在開發(fā)一種固體納米孔生物孔(Biopore. 其中一個團隊利用改造了MspA 蛋白質(zhì)構(gòu)建了生物納米孔, 用以分析單鏈DNA 分 子41. 他們證實單鏈DNA 分子可以通過這個生物孔. Oxford Nanopore Technologies與牛津大學合作, 正設(shè)計

48、另外一種基因工程蛋白質(zhì)納米孔. 通過遺傳工程改造, 他們已經(jīng)可以構(gòu)建一種將氨基化環(huán)糊精(Am- inocyclodextrin 配體共價連接到位于脂雙層膜中的-溶血蛋白內(nèi)生物納米孔42. 最近, 他們證實驅(qū)動4種核苷酸單磷酸(dNMPs通過生物孔, 通過納米孔的電流將分別減少到4種不同的狀態(tài), 每種狀態(tài)都與一種核苷酸單磷酸相對應43. 將這一機制與外切酶將核苷酸從DNA 鏈上切除并釋放出來相結(jié)合, 提供了另外一種納米孔測序技術(shù). 為了做到這一點, 至關(guān)重要的是外切酶的固定方式, 以確保切除下來的核苷酸單磷酸能被嚴格單一地運送并通過納米孔.除了堿基的檢測, 控制DNA 的運動以及通過納米孔的速度

49、也是非常重要和具有挑戰(zhàn)性的. DNA高速移動通過納米孔具備了開發(fā)超高速測序方法的可能. 但是, 如果DNA 鏈通過孔隙速度過快, 用來確定每個堿基的時間就非常短. 在DNA 隨機運動以及DNA 分子與納米孔表面非特異作用的情況下, 這種情況還可能更加嚴重44. 所有這些增加了DNA 分子轉(zhuǎn)位通過納米孔速度的不確定性. 盡管可以通過降低溫度、增加溶液黏度、降低納米孔的偏好性等降低DNA 通過的速度, 但速度的變化還是一個問題. 對于克服這一困難有種種設(shè)想. 其中之一是想法是將某種類型的進行性酶(Processive Enzyme加入與通過的DNA 鏈結(jié)合45. 這將顯著降低移動的速度. 最近,

50、IBM 宣布了其納米孔裝置, 被稱為DNA 晶體管46, 將納米孔嵌入金屬層中, 形成可以通過調(diào)控將DNA 分子捕獲在納米孔內(nèi)的金屬介質(zhì)結(jié)構(gòu). 計算機模擬表明, 經(jīng)過周期性的門電位的開關(guān), 每次將一個堿基通過納米孔是可行的, 這就給探測通過的核苷酸留出了充足的時間.(3 石墨烯和碳納米管. 石墨烯是由碳原子構(gòu)成的二維晶體, 碳原子排列與石墨的單原子層一樣. 非常穩(wěn)定并具有非常良好的導電性, 非常適合制作核酸測序用電極的材料. 有種設(shè)想是在石墨烯上打出一個大約1 nm寬的縫隙47. 引導DNA 分子垂直通過縫隙. 當DNA 通過時, 縫隙兩邊的石墨烯邊緣可以作為電極來確定核酸的序列. 除了在石墨

51、烯上打出這樣一個縫隙是一種挑戰(zhàn)之外, 控制DNA 的運動、移動的方向以及通過縫隙的速度同樣是不小的障礙.由于其獨特的電物理特性及其納米尺度的結(jié)構(gòu), 雖然到目前為止還沒有開發(fā)出任何裝置, 但是碳納米管(CNT在高速DNA 測序中已經(jīng)表現(xiàn)出了巨大的潛力. 已經(jīng)有工作表明, 碳納米管表面同DNA 分子之間可以高度的互相作用, 甚至是與序列特異性相關(guān)48. 長的基因組單鏈DNA 可以纏繞在一條單壁碳納米管上, 形成一個穩(wěn)定的DNA-碳納米管復合物49. 計算機模擬表明, 引入的4種核苷酸表現(xiàn)出獨特的局部密度50. 這是碳納米管可以單獨或者與其他技術(shù)整合作為電測序的候選材料. 這些設(shè)想還停留在理論驗證階

52、段.2 展望回顧了30多年來測序技術(shù)的進展以及可能產(chǎn)生的突破, 難免會產(chǎn)生這樣的問題未來幾年內(nèi)將發(fā)生什么？對于測序技術(shù)的參數(shù)有什么樣的展望？千美元人基因組(TDG和百美元人基因組(HDG技術(shù)將在何處產(chǎn)生？什么時候能產(chǎn)生？千美元人基因組以及百美元人基因組這兩個目標是要實現(xiàn)以現(xiàn)有序列為參照, 將測定一個人基因組的全部成本控制在1000美元和100美元之內(nèi). 本節(jié)將討論這些問題.2.1 技術(shù)融合現(xiàn)在不能確定哪種改變游戲規(guī)則的想法或革命性的技術(shù)最終能實現(xiàn)千美元人基因組甚至是百美元人基因組的目標, 并將人們帶到充滿希望的基因組研究新領(lǐng)域. 回顧3代測序平臺的技術(shù)進展, 發(fā)現(xiàn)有一點是非常明確的, 即固態(tài)技

53、術(shù)與生物化學的聯(lián)姻. 另外, 技術(shù)的融合將從生物化學或化學手段向物理手段發(fā)展(表2. 相信這一趨勢將持續(xù)下去. 下一代測序儀將可能根本不使用生物化學方法, 而納米技術(shù)將可能發(fā)揮更大的作用.周曉光等: 下一代測序技術(shù): 技術(shù)回顧與展望 32表2 測序技術(shù)的發(fā)展依賴于學科含量交叉增加并向微納技術(shù)傾斜關(guān)鍵技術(shù) 第1代 2.12.2代 2.3代第3代DNA 雜交 DNA 聚合酶法測序 PCR 擴增 電泳 光電子 微流體 微納米工藝 單分子檢測2.2 測序通量與序列讀長測序通量和數(shù)據(jù)讀長是測序技術(shù)相對立的兩個選擇. 從第一代到下一代測序技術(shù), 可以看到測序通量顯著改善, 但讀長也顯著縮短. 正如前面章節(jié)

54、所述, 這主要是由于同一DNA 簇中, DNA鏈的化合物延伸不同步所致. 用戶只能在低通量且具有較長的讀長(如第一代測序儀 與高通量且具有較短的讀長(如下一代測序儀 的測序平臺之間進行取舍. 這種情況在單分子測序中將得到改變. 例如Pacific Biosciences的零基波導技術(shù), 能同時實現(xiàn)超高的通量與較長的讀長. 假如沒有光學檢測能力的限制, 通量和讀長將僅受到DNA 聚合酶的合成速度和連續(xù)性的限制. 未來一代的基于納米孔的測序技術(shù), 當線性DNA 通過納米孔結(jié)構(gòu), 一個接一個的核苷酸被確定下來時, 也可以同時實現(xiàn)高通量和較長讀長. 原則上, 一個納米孔結(jié)構(gòu)單次測序讀長僅僅受到可能通過

55、納米孔結(jié)構(gòu)未經(jīng)剪切的非常長的線狀DNA 鏈的長度限制. 已經(jīng)證實長達5.4 kb的線狀DNA 可以通過固態(tài)的納米 孔37. 因此, 預計新一代的測序儀在具有超高通量的同時, 其讀長也將輕易超過Sanger 設(shè)備.2.3 測序成本與生產(chǎn)能力經(jīng)驗曲線過去30年中, 在測序成本急劇下降的同時, 測序通量(生產(chǎn)能力 呈指數(shù)提高. 前面提過, 有人將這種巨變與IT 工業(yè)相提并論. 實際上在某些方面, DNA測序的改變速度已經(jīng)遠遠超過了半導體工業(yè)的摩爾定律的描述. 圖3以對數(shù)坐標顯示了過去數(shù)年中測序成本(以美元每人類基因組為單位 以及生產(chǎn)能力(以每天每臺儀器核苷酸數(shù)目為單位 隨時間的變化. 觀察這些曲線可

56、以發(fā)現(xiàn), 正如預期, 在過去30多年, 測序成本的降低以及通量的提高均呈指數(shù)變化. 仔細觀察可見, 另一個有趣的現(xiàn)象: 兩條曲線的圖3 測序費用與產(chǎn)量的發(fā)展變化中國科學: 生命科學 2010年 第40卷 第1期 33斜率都在2005年左右出現(xiàn)拐點. 這意味著從那時開始, 測序成本降低和通量提高的改變速度從那時開始加快. 這正是下一代測序儀開始進入實驗室的時間. 拐點兩側(cè)的斜率都接近線性, 表明兩個階段有兩種不同的因素驅(qū)動測序生產(chǎn)能力的提高: 一種是世代內(nèi)的技術(shù)改進提高了生產(chǎn)能力并降低了成本, 而另一種是通過技術(shù)突破.生產(chǎn)能力和成本的關(guān)系, 可以描述為經(jīng)驗曲線(又名學習曲線 效應的模型. 這種效

57、應表明, 隨著更多得執(zhí)行某項任務, 任務的成本也隨之降低. 這一模型在20世紀30年代中期, 由Theodore Wright最早量化, 并成功應用于提高飛機產(chǎn)量和降低成本的項目中51. 從那時起, 該模型已在許多行業(yè)被用來研究生產(chǎn)能力和成本的關(guān)系. 本研究以測序成本與測序通量為坐標(在對數(shù)坐標中 繪制了從2005年以來兩者隨時間的變化, 獲得了第2代測序技術(shù)的經(jīng)驗曲線(圖4. 近乎線性的曲線呈現(xiàn)了典型的經(jīng)驗曲線效應, 當生產(chǎn)能力增加一定倍數(shù)的同時, 成本也按照一定的百分比降低. 線性的經(jīng)驗曲線偶爾可能突然中斷. 這種中斷反映了技術(shù)過時或者已被更新的技術(shù)所取代的過程. 正如前面所討論, 從20

58、05年前后第2和第2代測序技術(shù)變化中所觀察到的現(xiàn)象. 自2005年以來, 一個數(shù)量級的測序通量變化與1.8個數(shù)量級的測序成本降低相對應.2.4 千美元基因組(TDG和百美元基因組(HDG 由圖4的經(jīng)驗曲線推測可得, 第2代測序技術(shù)(包括目前正在開發(fā)的單分子測序技術(shù) 中, 千美元基因組與百美元基因組的目標將分別在每天每臺測序儀測序通量達到20 G與70 G時實現(xiàn). 如果這一趨勢保持下去, 千美元基因組可能相當快, 在12年內(nèi)實圖4 第2代測序技術(shù)費用和產(chǎn)量發(fā)展經(jīng)驗曲線現(xiàn). 基于相同的模型, 百美元基因組可能在23年內(nèi)實現(xiàn).當然, 這些預測都是基于本研究的經(jīng)驗曲線模型. 同時存在一些經(jīng)驗曲線所無法預測的其他因素, 例如革命性技術(shù)突破或缺少突破. 如果現(xiàn)有的技術(shù)在達到目標之前就宣告失敗, 那么所有的預測都將是錯誤的. 必須建立新的替