MCAO模型的制備

1、實驗前準備實驗器材：干棉球、酒精棉球、75%酒精、生理鹽水、注射器(1ml、2ml)、黑 色記號筆、固定大鼠用粗線繩、大鼠板、 染色小燒杯、標本瓶 手術器械：備皮剪子 1、眼科剪 1、大直鑷 1 只、小彎鑷 1 對、(動脈夾 2)、 止血鉗 2-3、縫合線、縫合針、持針器 麻醉劑： 10%水合氯醛( 400mg/kg)保溫：60W白熾燈，于37cm高處直接照射能使肛溫保持在 37C栓線：直徑0.24mm,頭端光滑圓鈍；在栓線18mm的位置用黑色記號筆標記； 75%酒精清潔后置 1: 2500 單位肝素化生理鹽水中備用。體重與栓線直徑：直徑0.24mm的栓線適用于體重220-280g的SD大鼠。

2、TTC的配制：用0.2mol/L磷酸緩沖液(PBS)配成2%TTC溶液(pH7.4),避 光保存。藥物配制：無論生理鹽水還是受試藥物標簽均采用代號， 給藥及評分均采用單盲。儀器激光多普勒血流儀(Laser Doppler Flowmetry, LDF)系統(tǒng)，包括：PeriFlux 5001 Ma in Unit，PF5010 LDPM Unit (激光多普勒微血流灌注量檢測單元)，LD Probe407-1 ( Perimed Co., Jarfalla, Sweden ;大鼠腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命 科技有限公司)；牙科手鉆(Stron g 90#, Korea);大鼠腦切片模具；熒光

3、正置 顯微鏡(NIKON ECLIPSE 80i, X400)及成像系統(tǒng)( ACT-2U NIKON Imaging System)。大腦中動脈栓塞( MCAO )模型的制備參照Zea Lon ga等2建立的大鼠大腦中動脈內栓線阻斷方法，作適當改進。10 %水合氯醛溶液400mg/kg，腹腔注射麻醉動物。大鼠仰臥位固定，頸部正 中切開皮膚，鈍性分離各層組織，暴露右側頸總動脈 (CCA) 。分離至頸內動脈(internal carotid artery， ICA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)分叉 后一段，仔細分離避免損傷迷走神經和氣管，置線備用。于頸內、

4、頸總動脈處用動脈夾夾閉， 頸外動脈近心端及遠心端結扎， 中間剪 斷。將頸外動脈游離端拉至與頸內動脈成一條直線，將尼龍線由頸外動脈插入， 插入后用 0號絲線結扎，以防止出血，打開頸內動脈處動脈夾，將尼龍線插入頸 內動脈，繼續(xù)插入至顱內，插入深度約18.5 ±.5mm至微感阻力，使尼龍線頭端通 過MCA起始處，到達較細的大腦前動脈，此時即實現右側大腦中動脈的血流阻 塞，結扎ICA以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合，尼龍線殘端留I cm長于皮外。假手術組只進行術前麻醉和血管分離術， 不結扎及導入線栓。 手術過程中室 溫保持在24-25C，生物機能實驗系統(tǒng)進行動物呼吸及心電監(jiān)測。3局部腦血流量

5、測定大鼠俯臥位固定于立體定位儀上， 開顱窗并清理手術視野， 以前囟為坐標原 點，選取前囟后1-2mm、右側2-4mm為測定點9，周圍直徑約2-3mm區(qū)域用牙科 鉆打薄，保持硬腦膜的完整并避開較大的血管，定位并固定好探頭座。將動物從定位儀取下并使其仰臥位于手術臺上，進行 MCAO 手術，當線插 入 ICA 后先不插入顱內，穩(wěn)定 LDF 讀數后，記錄 5min 內血流值，以其平均值 作為腦血流的基礎值（baseline value。把線插入顱內，當血流值突然下降至基 礎值的 10%-20 % 時，提示中腦動脈血流已被阻斷。每組 MCAO 前的血流值為 本組的基礎值（ 100），手術后血流值均以此基

6、礎值的百分率表示。4神經行為學檢查Bederson '評分動物于給藥前及處死前進行神經行為學觀察，參照 Zea Longa的方法，提鼠 尾離開地面約 1 尺，觀察兩前肢狀況；將大鼠置于水平地面，推動其雙肩，觀察 兩側抵抗力有無差異；大鼠置于地面，觀察其行走情況。采用四級評分法（ 0-5 分），分數越高，說明其神經行為損傷越嚴重。（1）行為完全正常者，記 0分；（2）提起鼠尾離開地面，手術對側前肢內旋、內收者，記 1分；（3） 大鼠至地面，用手擠壓兩側檢查其抗力，手術對側抗力下降者，記2分； （ 4）大鼠至地面，觀察其行走，圍繞手術對側轉圈者，記 3分；（ 5）損傷極其嚴重，已無法自主活動者，記 4分。5腦梗死體積的測定：評分后大鼠斷頭處死，迅速將取出的腦組織置于 -20 °C冰箱，10mi n后置室 溫環(huán)境，將腦置于大鼠腦切片模具中， 切除嗅球、 小腦和低位腦干后按圖譜所示 間隔2mm冠狀切五刀，切成6個大腦連續(xù)冠狀粗切片。然后迅速將腦片置于 5ml 含2%TTC的溶液中，37C恒溫、避光孵育30min,期間每隔5min將腦片翻動一次。 經 TTC 染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織未被染色而呈白色。將每組腦片 排列整齊， 拍照保