輔酶Q10的發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)

1、目錄前言.11 菌種的選育.2 1.1 菌種的選育及制備.2 1.2 誘變育種.3 1.3 菌種的保藏.52 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及滅菌.6 2.1 培養(yǎng)基的類型及功能.6 2.2 培養(yǎng)基的成分.6 2.3 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及優(yōu)化 .7 2.4 培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí)注意的問題.8 2.5 培養(yǎng)基滅菌.83 空氣滅菌.9 3.1 過濾除菌流程及設(shè)備.9 3.2 無菌空氣的檢查.11 3.3 發(fā)酵罐滅菌.114 種子的擴(kuò)大培養(yǎng).12 4.1 實(shí)驗(yàn)室種子制備.12 4.2 生產(chǎn)車間種子制備.125 發(fā)酵過程的參數(shù)控制.13 5.1 發(fā)酵過程的補(bǔ)料策略.13 5.2 發(fā)酵過程pH值的控制.13 5.3 發(fā)酵過程溫度的控制

2、.13 5.4 溶氧的控制.14 5.5 最佳接種量.14 5.6 泡沫的影響及控制.14 5.7 染菌的控制.146 下游加工.15 6.1發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離.15 6.2細(xì)胞破碎及其碎片的分離.15 6.3輔酶Q10的提取與純化.157物料衡算.168發(fā)酵罐的設(shè)計(jì).17 8.1發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu).17 8.2發(fā)酵罐的工藝尺寸.17 8.3通用式發(fā)酵罐的選擇.189工藝流程圖.20參考文獻(xiàn).22 前言 輔酶Q10又名泛醌10，是一種脂溶性醌,其結(jié)構(gòu)類似于維生素K，因其母核六位上的側(cè)鏈聚異戊烯基的聚合度為10而得名，是一種醌環(huán)類化合物?；瘜W(xué)名 2-(3,7,11,15,19,23,27,31,

3、35,39-癸甲基-2,6,10,14,18,22,26,30,34,38-四十癸烯基)-5,6二甲氧基-3-甲基-p-苯醌 結(jié)構(gòu)式 輔酶Q10分子結(jié)構(gòu)分子式 C59H90O4 分子量 863.36輔酶Q10受光照易分解，而受溫度、濕度影響則較小。在室溫下呈橙黃色結(jié)晶物，是呼吸鏈上的一種遞氫體，在自然界分布廣泛。主要功能有自由基清除劑、抗腫瘤藥物、增強(qiáng)免疫力、代謝激活劑，在細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換中具有重要作用、抗氧化作用、增強(qiáng)心臟對缺氧的忍耐力。輔酶Q10的生產(chǎn)方法有動植物組織提取法，化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，化學(xué)合成法合成條件苛刻，步驟繁多；另外化學(xué)合成的輔酶Q10的異戊二烯單體大多為順式結(jié)構(gòu)，生物活

4、性不好，且副產(chǎn)物含量多，提純成本高。動植物組織提取法主要是從提取細(xì)胞色素C后的豬心殘?jiān)崛?。動物組織中輔酶Q10含量低，每公斤新鮮豬心的收率僅為75mg，并受原材料和來源限制，規(guī)?；a(chǎn)受到一定制約。微生物發(fā)酵法是目前認(rèn)為最具發(fā)展前景的輔酶Q10生產(chǎn)方法。該方法生產(chǎn)的輔酶Q10產(chǎn)物活性好，可通過規(guī)模放大生產(chǎn)能力。 其技術(shù)關(guān)鍵是輔酶Q10產(chǎn)生菌的生產(chǎn)能力及分離純化方法。由于受菌種、發(fā)酵工藝以及下游提取的工藝的限制，微生物法生產(chǎn)得到的輔酶Q10的產(chǎn)量不高，目前還無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。 通過誘變育種、構(gòu)建工程菌、優(yōu)化發(fā)酵工藝、優(yōu)化提取純化工藝等策略，能最大限度地提高輔酶Q10的產(chǎn)量，有望實(shí)現(xiàn)輔酶

5、Q10的工業(yè)化生產(chǎn)。1.菌種的選育1.1菌種的選育及制備 優(yōu)良的微生物菌種是發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，要使發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的種類、產(chǎn)量和質(zhì)量有較大改善，首先必須選育性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。 輔酶Q10產(chǎn)生菌及其細(xì)胞內(nèi)含量 輔酶Q10產(chǎn)生菌 含量（mg/g 干細(xì)胞）深紅紅螺菌 5.4 沼澤紅假單胞菌 3.9嗜硫小紅卵菌 3.6類球紅細(xì)菌 2.7莢膜紅假單胞菌 1.4黑粉菌 0.2銅綠假單胞菌 0.6擲胞酵母 0.4新生隱球菌 0.2從上表可以看出，光合細(xì)菌菌體中輔酶Q10的含量普遍較高。在分類地位上，光合細(xì)菌屬于原核生物界細(xì)菌門真細(xì)菌綱紅螺菌目，該目分為紅螺菌和綠硫菌亞目，前者分為紅硫菌科和紅螺菌科。上述高

6、產(chǎn)菌種大都屬紅螺菌科，因此紅螺菌科細(xì)菌是產(chǎn)CoQ10菌種理想選擇之一。紅螺菌屬細(xì)胞進(jìn)行二分裂，革蘭氏染色陰性。光和色素為細(xì)菌葉綠素a和螺菌黃素類類胡蘿卜素。淡水菌種，生長不需要氯化鈉，喜在光照厭氧條件下光異養(yǎng)生長，但也可在黑暗條件下微好氧或好氧生長，生長需要生長因子。本實(shí)驗(yàn)選擇深紅紅螺菌作為生產(chǎn)用菌種，培養(yǎng)條件須為厭氧光照，有CO的存在。菌種選育的一般步驟為：含微生物材料的選擇材料的預(yù)處理所需菌種的分離菌種的培養(yǎng)菌落的選擇菌種初篩菌種復(fù)篩野生菌株菌株保藏。1.1.1含微生物材料的選擇 由于紅螺菌能進(jìn)行光合作用，適宜生長在缺氧，光照充足的地方。廣泛分布于江河、湖泊、海洋等水域環(huán)境中，尤其在有機(jī)物

7、污染的積水處數(shù)量較多，故所取生物材料為污水處理廠的活性污泥。選好4到5處取樣點(diǎn)，每處取10g污泥樣品，并混合放置在預(yù)先滅菌的容器中，記錄好時(shí)間，地點(diǎn)和環(huán)境等情況，以備查考。1.1.2材料的預(yù)處理 將取得的樣品放在缺氧、不含氯化鈉、富含有機(jī)物的的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并控制PH在接近中性的范圍類，在厭氧條件下能進(jìn)行光能異養(yǎng)生長的紅螺菌科將逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位，其他雜菌的生長將受到抑制。1.1.3所需菌種的分離可利用選擇培養(yǎng)基對預(yù)處理后的材料進(jìn)行富集液體培養(yǎng)，施加選擇壓力 ，在培養(yǎng)基中可以加入較多有機(jī)物，并且把葡萄糖作為碳源，在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)控制PH值在6.5與7.5之間，放置在光照充足的地方

8、。這樣紅螺菌屬將取得生長優(yōu)勢地位。然后可以用平板劃線法進(jìn)行菌種分離。方法如下：用接種管蘸取少量經(jīng)增殖培養(yǎng)后的菌液，在含無菌固體培養(yǎng)基的平板表面上進(jìn)行規(guī)則劃線，操作時(shí)由右向左輕輕劃線，劃線時(shí)平板面與接種環(huán)成30°40°，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線，線條要平行密集，使兩線不能重疊，充分利用表面積，劃線時(shí)接種環(huán)不要嵌入板內(nèi)劃破培養(yǎng)基，密集的含菌樣品，經(jīng)過多劃線稀釋，使菌體在平板培養(yǎng)基上逐漸分離成單個(gè)菌株，經(jīng)培養(yǎng)繁殖成單個(gè)菌落，反復(fù)進(jìn)行幾次平板劃線分離，可得紅螺菌野生菌株。1.1.4菌種的培養(yǎng) 將獲得的菌株接種到半固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基的配方為：1L蒸餾水，30g葡萄糖

9、，10g蛋白胨，20g瓊脂，20gNaHCO，0.5gMgSO·7HO，5gNaCl，1gNHCl；0.5g酵母膏，生長因子1ml，微量元素溶液1ml，pH值為7.0。培養(yǎng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)基上將出現(xiàn)大小不一的特征菌落。1.1.5菌落的選擇 培養(yǎng)48h后，挑取比較大的淺紅色菌落，常用的方法有鋪菌法、復(fù)印平板法。菌落的篩選時(shí)選育過程中最耗時(shí)和最困難的步驟，所以應(yīng)該采用合適的方法，減輕工作量。1.2誘變育種 由于野生型菌株生產(chǎn)性能較差，因此通常會對出發(fā)菌種進(jìn)行誘變處理，從而選育出高產(chǎn)菌種。誘變育種可以利用物理、化學(xué)因素誘導(dǎo)遺傳特性發(fā)生變異，再從變異群體中選擇符合要求的個(gè)體，進(jìn)而培育成新的品

10、種。誘變劑包括物理、化學(xué)、生物誘變，在微生物誘變育種中，可用物理化學(xué)復(fù)合誘變因素處理菌種，擴(kuò)大突變的位點(diǎn)范圍，使獲得正突變的菌株的可能性增大。因?yàn)椴煌N類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前一般先做誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。高劑量會造成菌體致死率90%99.9%，可以獲得較高的正突變；而低劑量致死率在70%80%，甚至更低時(shí)，能夠提高正突變率，但工作量大大增加。本設(shè)計(jì)中依據(jù)高劑量，高致死率標(biāo)準(zhǔn)，減輕工作量。誘變育種操作程序如下：出發(fā)菌株純化培養(yǎng)液細(xì)胞或孢子懸液誘變劑處理中間培養(yǎng)平板分離初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能實(shí)驗(yàn)菌種保藏。1.2.1出發(fā)菌株的選擇

11、 用來育種處理的起始菌株稱為出發(fā)菌株。一般選擇自然界分離的野生菌株、經(jīng)歷生產(chǎn)條件考驗(yàn)的菌株和經(jīng)歷多吃育種處理的菌株；其中經(jīng)歷生產(chǎn)考驗(yàn)的最好。本設(shè)計(jì)中選用分離到的野生菌株作為出發(fā)菌株。1.2.2深紅紅螺菌菌懸液的制備在制備細(xì)菌懸液時(shí)通常選取處于對數(shù)生長期的細(xì)菌作為出發(fā)菌種，這類菌種對生產(chǎn)環(huán)境有較好的適應(yīng)性，正突變的可能性也很大，所以要提前進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，使細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期。將菌株培養(yǎng)液用玻璃珠振蕩以打散細(xì)胞團(tuán)，再用脫脂棉花過濾，得到分散的菌體；本設(shè)計(jì)選用的深紅紅螺菌的菌懸液濃度應(yīng)控制在108個(gè)/ml，菌懸液用生理鹽水進(jìn)行稀釋，這樣就得到了適宜進(jìn)行誘變處理的菌懸液。1.2.2對菌種的誘變處理取菌濃

12、度為108個(gè)/ml的菌懸液5ml于直徑6厘米的無菌培養(yǎng)皿中，磁力攪拌均勻，在功率15W的紫外光線下，距離30cm處進(jìn)行紫外照射（經(jīng)查找資料可知最佳照射時(shí)間為130S，致死率為95.9%，正突變率較高）。接著進(jìn)行化學(xué)試劑誘變處理，本設(shè)計(jì)所采用的誘變劑為亞硝基胍。將存活下來的菌株活化培養(yǎng)后，取2ml培養(yǎng)液與亞硝基胍溶液混合制成一定菌濃的菌懸液，注意應(yīng)加少量的磷酸，調(diào)節(jié)PH值接近中性，然后再將離心管放在搖床上振蕩處理一段時(shí)間（經(jīng)查找資料可知亞硝基胍處理的最佳濃度為0.2mg/ml，最佳處理時(shí)間為40min，致死率為96.94%）。40min后停止振蕩，取下離心管用手充分振蕩后，然后各吸取0.5ml的

13、菌液依次進(jìn)行涂布，注意應(yīng)涂抹均勻。將涂布平板放置在32的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。1.2.3挑選高產(chǎn)菌株并保種經(jīng)培養(yǎng)后有菌落出現(xiàn)，每個(gè)菌落挑取少量菌體在250ml的三角瓶中分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，三角瓶中加入50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間為48h。然后對輔酶Q進(jìn)行提取，制成CoQ10提取液，利用紫外分光光度法，在275nm下測定提取液的吸光度，再與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計(jì)算出每個(gè)菌落菌體的CoQ產(chǎn)量，并與野生菌株的產(chǎn)量進(jìn)行比較，挑選出高產(chǎn)菌株并保種。在測定前，應(yīng)先繪制CoQ的在275nm下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法為：取已知濃度的CoQ樣品進(jìn)行不同程度的稀釋，然后測定275nm下的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，CoQ的濃度

14、為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。 輔酶Q的提取方法為：采用酸堿皂化法進(jìn)行提取，將培養(yǎng)液在離心機(jī)中離心15min，轉(zhuǎn)速為5000r/min，收集菌體，用生理鹽水洗滌2次，然后放在干燥箱中干燥1h，可測得菌體重量。然后將菌體與乙醇、氫氧化鈉、焦性沒食子酸溶液混合制成皂化液，皂化液再與石油醚混合進(jìn)行萃取，再在低溫減壓條件下進(jìn)行濃縮，濃縮液與乙醚、石油醚混合進(jìn)行吸附洗脫，洗脫液與無水乙醇混合溶解，制成CoQ的粗提品。在與無水乙醇混合時(shí)每組應(yīng)加入相同體積的乙醇。1.2.4高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性試驗(yàn)和菌種特性考察 將所獲得的高產(chǎn)菌株連續(xù)傳代5次，并分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定其CoQ的產(chǎn)量，觀察其遺傳穩(wěn)定性，將具有穩(wěn)定

15、遺傳特性的突變高產(chǎn)菌株保藏起來。1.3菌種的保藏菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平、缺氧狀態(tài)、干燥和低溫，使菌種處于“休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。在這里我們采用石蠟油封存法 將菌種接種到固體斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36h后，然后緩緩注入一定量的滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面1cm，然后保存在4的冰箱中，保存期一年左右。2培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及滅菌2.1培養(yǎng)基的類型及功能培養(yǎng)基的種類很多，可以根據(jù)組成、狀態(tài)和用途等進(jìn)行分類，按照用途可以分成孢子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物大規(guī)模發(fā)酵設(shè)計(jì)主要用到孢

16、子,種子和發(fā)酵培養(yǎng)基這三種類型。孢子培養(yǎng)基配制的目的是供菌體繁殖孢子的，常采用的是固體培養(yǎng)基，對這類培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長快速，產(chǎn)生數(shù)量多而優(yōu)質(zhì)的孢子，并且不會引起菌體變異。種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯成為活力強(qiáng)的種子。發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌體生長、繁殖、和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長，達(dá)到一定的菌絲濃度，又可以迅速合成所需產(chǎn)物。2.2培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基的成分大致分為碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素、生長因子、促進(jìn)劑和抑制劑、前體和水等幾大類。對不同的微生物，微生物不同的生長階段，不同的發(fā)酵產(chǎn)物以及不同發(fā)酵工藝條件等，所使用的培養(yǎng)基都是不同的，這些也

17、都是培養(yǎng)基配制需要考慮的因素。2.2.1碳源 碳源主要為微生物細(xì)胞的生長繁殖提供能源、為合成菌體和產(chǎn)物提供所必需的碳成分。常用的碳源有糖類、油脂、有機(jī)酸和低碳酸。本設(shè)計(jì)通過測定葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉分別作為培養(yǎng)基碳源，其他成分不變時(shí)，深紅紅螺菌CoQ單位產(chǎn)量的高低，確定了最佳碳源為葡萄糖，其次為麥芽糖。2.2.2氮源氮源主要用于構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物，分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。常用的有機(jī)氮源有花生餅粉、豆餅粉、棉子餅粉、玉米漿、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉等；常用的無機(jī)氮源有銨鹽、硝酸鹽、氨水，微生物對無機(jī)氮源的吸收較有機(jī)氮源快。通過實(shí)驗(yàn)得知對于深紅紅螺菌而言，有機(jī)氮源比無機(jī)氮源

18、好，又通過比較酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、尿素、硝酸銨分別作為氮源時(shí)CoQ的單位產(chǎn)量，可確定最佳氮源為酵母膏，其次為尿素、蛋白胨。2.2.3無機(jī)鹽類及微量元素微生物在生長和繁殖生長過程中，需要某些無機(jī)鹽及微量元素如磷、鎂、硫、鉀、鈉、鈣、鐵、錳、鋅等，以其作為生理活性物質(zhì)和調(diào)節(jié)物，這些物質(zhì)一般在低濃度時(shí)有促進(jìn)作用，在高濃度時(shí)起抑制作用。本設(shè)計(jì)研究了NaHCO、MgSO·7HO、NaCl分別加入培養(yǎng)基后，CoQ產(chǎn)量的變化，均有助于產(chǎn)物的合成。2.2.4 水 水是所有培養(yǎng)基的主要成分，也是微生物機(jī)體的重要組成成分。水是良好的溶劑，又是活細(xì)胞中一切代謝反應(yīng)的媒介物，還可以維持細(xì)胞中的滲透壓，同

19、時(shí)水又是熱的良好導(dǎo)體，有利于散熱，可調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度。在CoQ的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了避免水質(zhì)變化給生產(chǎn)帶來不良影響，發(fā)酵用水采用深井水，并定期檢查水質(zhì)，要求pH 在6.57.5范圍內(nèi)。2.2.5生長因子 生長因子是微生物生長不可缺少的微量的有機(jī)物，它不是對于所有微生物都是必須的，有些微生物可以自己合成。有機(jī)氮源是生長因子的重要來源，最具代表性的是玉米漿。因子培養(yǎng)基中加入適量的玉米漿有助于產(chǎn)物產(chǎn)量的提高2.2.6前體、產(chǎn)物促進(jìn)劑和抑制劑 前提物質(zhì)可以被直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中去，而其自身沒有太大變化。通過研究輔酶Q的生物合成途徑，在培養(yǎng)基中可以加入羥基苯甲酸、煙酸、酪氨酸、維生素B1等前體 有利于產(chǎn)物合成。

20、產(chǎn)物促進(jìn)劑指那些非細(xì)胞生長所必需的營養(yǎng)物，又非前體，但可以提高產(chǎn)量的添加劑。2.3培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及優(yōu)化 2.3.1培養(yǎng)基成分選擇的原則在考慮某一菌種對培養(yǎng)基的總體要求時(shí)，選擇成分時(shí)應(yīng)注意：(1）菌體的同化能力，選取合適的碳源和氮源，（2）代謝的阻遏與誘導(dǎo)，適量加入有機(jī)氮源，（3）合適的C、N比，一般工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比為100：（0.22.0），（4）pH的要求，發(fā)酵過程中，需要適宜的生長代謝環(huán)境。要保證pH能夠滿足生產(chǎn)要求，在配置培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)加入適量的緩沖液。本設(shè)計(jì)選用NH4Cl作為緩沖液，維持pH穩(wěn)定，同時(shí)加入的NaHCO也可以作為緩沖液。2.3.2培養(yǎng)基的優(yōu)化雖然培養(yǎng)基的最優(yōu)成分已經(jīng)確定，

21、但各成分的適宜濃度往往需要通過實(shí)驗(yàn)確定，最終設(shè)計(jì)出一個(gè)合適的培養(yǎng)基。一個(gè)適宜的培養(yǎng)基必須滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟(jì)的合成，也就是原材料的利用率要高，轉(zhuǎn)化率的要高。發(fā)酵過程的轉(zhuǎn)化率一般有兩個(gè)：一為理論轉(zhuǎn)化率，二為實(shí)際轉(zhuǎn)化率。理論轉(zhuǎn)化率可以通得過反應(yīng)方程式的物料衡算得出。實(shí)際轉(zhuǎn)化率可以通過實(shí)驗(yàn)得出，培養(yǎng)基的最終成分和濃度也需要實(shí)驗(yàn)確定。一般通過單因子實(shí)驗(yàn)確定最佳成分，在前面已經(jīng)確定；而最佳濃度一般通過多因子實(shí)驗(yàn)確定。對于多因子實(shí)驗(yàn)常采用的方法有：正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、響應(yīng)面分析等。通過正交實(shí)驗(yàn)確定最適宜的碳氮源的組合，因?yàn)閱我惶嫉吹臓I養(yǎng)程度不如復(fù)合碳氮源，因此采用葡萄糖、麥芽糖為復(fù)合碳源，酵母膏、尿素為復(fù)合氮源，通

22、過正交來優(yōu)化各個(gè)參數(shù)，按4因素、3水平進(jìn)行L9（）實(shí)驗(yàn)，得到各組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果后，通過確定K、R值后，對結(jié)果進(jìn)行分析，確定最佳的碳氮源配比條件。查找資料可知最佳配比為葡萄糖20g/L、麥芽糖10g/L、酵母膏6g/L、尿素0.3g/L。然后利用相同的方法，也可以確定無機(jī)鹽的適宜濃度。查找資料可知無機(jī)鹽的最佳配比為：20g/L NaHCO、1g/L MgSO·7HO、5g/L NaCl。2.4培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí)注意的問題 為了確保培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)符合工業(yè)生產(chǎn)要求，應(yīng)該注意（1）原材料及設(shè)備的預(yù)處理，所用的原材料有些必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)念A(yù)處理。工業(yè)一般使用鐵制發(fā)酵罐，培養(yǎng)液中就無需再加入含鐵化合物也能滿足生

23、產(chǎn)要求。（2）原材料的選擇原料都應(yīng)該定點(diǎn)采購和加工（3）發(fā)酵特性的影響，應(yīng)該注意產(chǎn)物合成受培養(yǎng)基性質(zhì)的影響2.5培養(yǎng)基滅菌所謂滅菌，就是指用物理或化學(xué)方法殺滅或去除物料或設(shè)備中一切有生命物質(zhì)的過程。常用的滅菌方法有：化學(xué)滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌和過濾滅菌等。本實(shí)驗(yàn)采用濕熱滅菌，條件為在121（表壓約0.1MPa）維持30min。濕熱滅菌即利用飽和水蒸氣進(jìn)行滅菌，是工業(yè)中最重要的滅菌方法。在同樣的溫度下，濕熱的殺菌效果比干熱好。濕熱滅菌過程中蒸氣放出大量熱量，加速提高溫度。因而濕熱滅菌比干熱所要溫度低。如在同一溫度下，則濕熱滅菌所需時(shí)間比干熱短；而且蒸汽的穿透力大，使深部也能達(dá)到滅菌溫

24、度，故濕熱比干熱收效好。 滅菌原理，對數(shù)殘留定律：經(jīng)濕熱滅菌，微生物死亡速度和殘存的微生物數(shù)量成正比。即,N為培養(yǎng)基中微生物的個(gè)數(shù)，是微生物受熱時(shí)間，s；k為比死亡速率，. 積分可得：，N為經(jīng)時(shí)間滅菌后培養(yǎng)基中微生物數(shù)。為培養(yǎng)基中滅菌前中微生物數(shù)。一般取對熱抵抗力較大的芽孢桿菌的k進(jìn)行計(jì)算，經(jīng)驗(yàn)公式為：或，為滅菌結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基中活微生物數(shù)，一般取0.001個(gè)，一般取個(gè)/ml。通過以上過程即可算出培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間。3空氣滅菌由于深紅紅螺菌喜好在厭氧光照條件下生長，輔酶Q10產(chǎn)量較高，氧氣存在時(shí)深紅紅螺菌也能夠生長，但產(chǎn)物產(chǎn)量會略微下降，考慮到生產(chǎn)成本，若除去氧氣會增加成本，所以采用有氧發(fā)酵發(fā)酵。-

25、獲得無菌空氣的方法有：輻射滅菌、化學(xué)滅菌、加熱滅菌、靜電除菌、過濾介質(zhì)除菌等。過濾介質(zhì)除菌是目前發(fā)酵工業(yè)中空氣除菌的主要手段，其介質(zhì)有棉花過濾器、超細(xì)玻璃纖維紙、石棉濾板、金屬燒結(jié)管等。3.1 過濾除菌流程及設(shè)備空氣凈化流程如下：采風(fēng)塔粗過濾器空氣壓縮機(jī)空氣貯罐冷卻器旋風(fēng)分離器冷卻器絲網(wǎng)除沫器空氣加熱器空氣過濾器。設(shè)備如下：1.采風(fēng)塔：采風(fēng)塔建在工廠的上風(fēng)頭，遠(yuǎn)離煙囪，高至少10 m,氣流速度8 m/s左右，也可做成采風(fēng)室。2.粗過濾器：主要作用是攔截空氣中較大的灰塵以保護(hù)空氣壓縮機(jī)，同時(shí)起一定的除菌作用，減輕總過濾器的負(fù)擔(dān)。過濾介質(zhì)可選用泡沫塑料或無紡布，設(shè)計(jì)流速為0.10.5m/s。3.空

26、氣壓縮機(jī)：作用是提供動力，以克服隨后各設(shè)備的阻力。4.空氣儲罐：作用是消除壓縮空氣的脈動。要求：H/D=22.5 =（0.10.2）V1 其中，H為罐高；D為罐直徑；V1為空壓機(jī)每分鐘排氣量（20，1×105Pa狀況下）。5. 旋風(fēng)分離器：是利用離心力進(jìn)行氣-固或氣-液沉降分離的設(shè)備。作用是分離空氣中被冷卻成霧狀的較大的水霧和油霧粒子,對10左右的粒子分離效率為：60%70%。 分離器入口的設(shè)計(jì)流速為1525m/s，主要尺寸為：直徑, ； 若D大于0.8時(shí)，應(yīng)采用多個(gè)分離器并聯(lián)6.冷卻器：空壓機(jī)出口溫度氣溫在120左右，必須冷卻。另外在潮濕的地域和季節(jié)還可以達(dá)到降濕的目的。一般采用列

27、管式熱交換器?？紤]到熱的損失，選用換熱器時(shí)，可將換熱面積放大15%20%。換熱面積為。7.絲網(wǎng)除沫器：分離效率更高，可以出去1µm以上的霧滴，一般采用規(guī)格為直徑0.25×40孔且高度為100150的不銹鋼絲網(wǎng)。本設(shè)備設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是氣體流速的選擇和絲網(wǎng)虛密度的確定。氣體流速為，分別為液體、固體的密度；k一般取0.1078.空氣加熱器：一般用列管式換熱器，列管內(nèi)走空氣，管外走蒸汽?？蓪⒖諝鉂穸扔?00%降低到70%以下。9.總過濾器：本設(shè)計(jì)采用纖維及顆粒狀介質(zhì)過濾器，填充物按下面順序安裝：孔板鐵絲網(wǎng)麻布織品棉花麻布織品活性炭麻布織品棉花麻布織品鐵絲網(wǎng)孔板。介質(zhì)要緊密均勻，壓緊一致

28、，上下棉花層厚度為總過濾層厚度的1/2，中間活性炭層為1/2，一般棉花的填充密度為150200，活性炭為40450。通過過濾器的氣體流速一般為0.20.3m/s.過濾器應(yīng)預(yù)先滅菌，自上而下通入0.20.4MPa的蒸汽，滅菌45min左右后用壓縮空氣吹干備用。3.2無菌空氣的檢查現(xiàn)在采用的無菌檢查實(shí)驗(yàn)方法有肉湯培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法。這里采用肉湯法，用裝有酚紅肉湯的無菌試管取樣，37培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色的變化，確認(rèn)是否染菌。3.3發(fā)酵罐滅菌發(fā)酵罐的滅菌可采用空罐滅菌和實(shí)罐滅菌，此處采用空罐滅菌，即把培養(yǎng)基與發(fā)酵罐分別滅菌。空罐滅菌是：關(guān)好空氣閥門，蒸汽上進(jìn)下出，沖蒸氣，壓力大于2 kg/

29、cm2（120），最好是45 kg/cm2（160）。當(dāng)罐內(nèi)溫度>80，進(jìn)蒸汽口（蒸氣閥）關(guān)掉，出蒸汽口（排氣閥）關(guān)小。打開空氣閥門，蒸汽直接進(jìn)罐，121，2030min。從80100上升很快，大于100后溫度上升很慢，到118時(shí)就開始計(jì)時(shí)，到計(jì)時(shí)25min時(shí)立即關(guān)掉蒸汽閥。關(guān)掉蒸汽閥后通入無菌空氣，使罐內(nèi)一直保持正壓（高于大氣壓，空氣不會倒灌入罐內(nèi)）。加自來水冷卻，從下向上，使溫度盡快降到55左右，到3738時(shí)關(guān)掉水，也有緩沖性。由于此次設(shè)計(jì)產(chǎn)量是50噸，所以冷卻系統(tǒng)應(yīng)采用冷卻管系統(tǒng)，如列管換熱器。4種子的擴(kuò)大培養(yǎng) 本發(fā)酵屬于二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，三級發(fā)酵。設(shè)計(jì)流程如下： 孢子錐形瓶種子

30、罐種子罐發(fā)酵罐4.1實(shí)驗(yàn)室種子制備將保藏在石蠟油中的菌種經(jīng)無菌手續(xù)接入適合菌種生長的斜面培養(yǎng)基中。斜面培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖20g/L、麥芽糖10g/L、酵母膏6g/L、尿素0.3g/L、20g/L NaHCO、1g/L MgSO·7HO、5g/L NaCl、1g/L NHCl，另外需加入適量的生長因子，pH在6.57.5之間，培養(yǎng)溫度控制在32度，培養(yǎng)48h，光照充足。 斜面培養(yǎng)結(jié)束后，挑取菌落較大的菌體利用微孔接種法，接種到含液體培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。搖瓶裝液量為50ml/250ml，液體培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖1g、麥芽糖0.5g、酵母膏0.3g、尿素

31、0.015g、1gNaHCO、0.05g MgSO·7HO、0.25g NaCl、0.05g NHCl，0.05ml的生長因子，pH為7左右，培養(yǎng)溫度為32度，培養(yǎng)時(shí)間為24h，光照充足。4.2生產(chǎn)車間種子制備一級中種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)；將搖瓶發(fā)酵的菌絲體利用火焰接種法，移種至種子罐繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。32條件下，培養(yǎng)時(shí)間為16h。此時(shí)菌體處于生長旺盛的對數(shù)生長期。二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)；將一級種子罐的菌液用壓差法，移至含有新鮮培養(yǎng)液的二級種子罐，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，接種齡應(yīng)為生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，根據(jù)資料可知最佳接種量為10%，在32下培養(yǎng)10h，菌絲迅速繁殖，此菌絲即可移種到發(fā)酵罐作為種子。發(fā)酵罐培

32、養(yǎng)；將經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)的二級種子罐菌體接種到發(fā)酵罐中，方法為壓差法，接種量為10%，發(fā)酵溫度為32，培養(yǎng)時(shí)間為72h，光照充足，發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖1.4%、麥芽糖0.7%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.8%、尿素0.04%、0.3% NaHCO、0.04% MgSO·7HO、0.2% NaCl、0.05% NHCl，調(diào)節(jié)pH至 6.57.5。5發(fā)酵過程的參數(shù)控制5.1 發(fā)酵過程的補(bǔ)料策略經(jīng)過研究證明，對于輔酶Q而言，補(bǔ)料發(fā)酵比分批發(fā)酵的產(chǎn)率更高，產(chǎn)率提高近一倍。考慮到輔酶Q的產(chǎn)量較低，且其產(chǎn)量與菌體生長為半偶聯(lián)過程，產(chǎn)物形成速率與菌量有關(guān)，與菌的生長速率無關(guān)，故采用補(bǔ)料分批發(fā)酵方式

33、。在發(fā)酵過程中補(bǔ)充某些營養(yǎng)物料、水或產(chǎn)酶促進(jìn)劑，以滿足微生物的代謝活動和產(chǎn)酶的需要。最佳補(bǔ)料時(shí)間為發(fā)酵開始36h后，最佳補(bǔ)料方式為少量多次，每4h一次，以低濃度的碳源，高濃度的前體和氮源的培養(yǎng)基補(bǔ)料。5.2 發(fā)酵過程pH值的控制 各種微生物需要在一定的pH環(huán)境中方能正常生長繁殖。培養(yǎng)基中C/N比值高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH偏低；C/N比值低，發(fā)酵液傾向于中性或堿性，pH偏高。深紅紅螺菌為淡水菌種，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明初始pH為7.0時(shí)最有利于輔酶Q的產(chǎn)生。因此，在發(fā)酵過程中，可通過添加適量的尿素或NH4Cl等來穩(wěn)定pH。5.3 發(fā)酵過程溫度的控制溫度對微生物的生長、產(chǎn)物的合成和代謝調(diào)節(jié)有重要作用。溫度變

34、化一方面影響各種酶反應(yīng)的速率和蛋白的性質(zhì)，另一方面影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。不同的菌種有著不同的最適溫度。經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)可知最佳發(fā)酵溫度為32，此溫度下產(chǎn)量最高。5.4溶氧的控制 本設(shè)計(jì)的輔酶Q發(fā)酵是需氧發(fā)酵，研究表明，輔酶Q的合成與溶氧密切相關(guān)，通氣不足會使產(chǎn)生NADPH的HMP途徑受阻而使EMP途徑增強(qiáng)，不利于輔酶Q的積累。若發(fā)酵液中氧氣不足，可通過加大通氣量，適當(dāng)降低溫度，提高罐壓，補(bǔ)水，提高攪拌速度來控制。5.5 最佳接種量 若接種量過小，會使發(fā)酵周期增長，同時(shí)會增大染菌的機(jī)會，若接種量過大，會使培養(yǎng)液黏度增加，導(dǎo)致溶氧不住，影響產(chǎn)物合成。深紅紅螺菌的最佳接種量為10%，接種齡為對數(shù)生長期

35、。5.6泡沫的影響及控制 由于通氣攪拌、發(fā)酵產(chǎn)生的CO及發(fā)酵液中糖、蛋白質(zhì)的存在，使發(fā)酵液含有一定量的泡沫。泡沫可以增加氣液接觸面積，有利于氧氣的傳遞，但大量泡沫的存在會帶來很多副作用。工業(yè)上泡沫的控制方法有機(jī)械和消泡劑兩種?？紤]到后期產(chǎn)品的提取及生產(chǎn)菌種對溶氧要求不是很高，本設(shè)計(jì)采用機(jī)械消泡，采用灌外法消泡。5.7 染菌的控制在工業(yè)發(fā)酵中，染菌輕則影響產(chǎn)品的質(zhì)和量、重則倒罐或停產(chǎn)、影響工廠效益。因此要嚴(yán)格無菌操作，種子滅菌要徹底，凈化空氣設(shè)備，操作要慎重，設(shè)備滅菌要徹底。若在前期染菌，應(yīng)重新滅菌；中期染菌，應(yīng)偏離雜菌生長條件；后期染菌，可提前或及時(shí)放罐。可能出現(xiàn)的異常發(fā)酵現(xiàn)象：1.培養(yǎng)基變稀

36、：可能是噬菌體污染或營養(yǎng)成分缺乏；2.培養(yǎng)基過濃：會抑制微生物的生長，考慮可能是污水污染；3.耗糖較慢：可能原因是種子生長能力降低，檢測種子是否衰退，發(fā)酵條件是否合適，以及營養(yǎng)成分是否全面，尤其注意缺磷；4.pH值不正常： 用緩沖對來調(diào)節(jié)，檢查是否染雜菌，碳氮比是否合適；5.生長緩慢：最可能的原因就是營養(yǎng)成分不足。6下游加工下游加工過程是生物工程的一個(gè)組成部分，是生物化工產(chǎn)品通過微生物發(fā)酵過程、酶反應(yīng)過程或動植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得，以上述發(fā)酵、反應(yīng)液或培養(yǎng)液分離、精制有關(guān)產(chǎn)品的過程。下游加工過程的一般工藝流程為：固體細(xì)胞破碎分離發(fā)酵液預(yù)處理固液分離液體初步純化高度純化最后純化成品加工6.1發(fā)酵液

37、的預(yù)處理和固液分離這一步主要目的在于改變發(fā)酵液的性質(zhì)，以利于固液分離。方法有酸化、加熱和加入絮凝劑。固液分離中，傳統(tǒng)方法有板框壓濾機(jī)和鼓式真空過濾機(jī)。通常的方法是：在鼓式真空過濾機(jī)轉(zhuǎn)鼓的表面預(yù)先鋪一層210cm厚的助濾劑層，過濾時(shí)形成的濾餅不斷地緩慢前進(jìn)的刮刀，連同極薄的一層助濾劑一起刮去。6.2細(xì)胞破碎及其碎片的分離 細(xì)胞破碎的方法有機(jī)械、生物、化學(xué)等方法。大規(guī)模生產(chǎn)常采用高壓勻漿器和球磨機(jī)，兩者課題可以補(bǔ)充。 細(xì)胞碎片的分離通常用離心分離的方法，比較困難，新方法用兩水相萃取法，選擇適當(dāng)?shù)臈l件，使細(xì)胞碎片集中在下相。6.3輔酶Q10的提取與純化根據(jù)輔酶Q的化學(xué)性質(zhì)，選用有機(jī)溶劑萃取法，即用醇

38、醚混合液萃取法進(jìn)行初步純化，主要是乙醇、石油醚。經(jīng)過初步處理后，體積已大大縮小，需要進(jìn)一步純化。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，采用高速逆流色譜法，效果較好。色譜純度達(dá)到了99.2%，產(chǎn)物純度達(dá)到了97.8%，回收率為88%。經(jīng)過高度純化后，最后采用凝膠過濾法得到純品。就是以特定的凝膠物質(zhì)為分子篩裝入層析柱，再通過分離溶液時(shí)大于凝膠孔徑的分子會被排阻在膠粒外，因此它們將“繞道通過”；小于該孔徑的分子，由于可以自由出入膠粒內(nèi)外，因此將沿著膠粒縫隙而直接流出。通過一段程度的凝膠層析柱后，大小分子將依次先后流出。7物料衡算已知發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖1.4%、麥芽糖0.7%、酵母膏0.5%、蛋白胨0.8%、尿素0

39、.04%、0.3% NaHCO、0.04% MgSO·7H2O、0.2% NaCl、0.05% NHCl。產(chǎn)物目標(biāo)產(chǎn)量為50t，生產(chǎn)菌種的單位產(chǎn)量為805.4mg/L，所以所需的發(fā)酵液量為：, 因?yàn)榕囵B(yǎng)液中營養(yǎng)成分只占4.03%，所以密度接近水的密度，取，所以所用發(fā)酵液的質(zhì)量為：所以用水量為：培養(yǎng)基成分總用量為：由于發(fā)酵方式采用補(bǔ)料發(fā)酵，補(bǔ)料培養(yǎng)基用量為初始裝液量的1/4，所以補(bǔ)料 所用培養(yǎng)基質(zhì)量為：發(fā)酵罐初始裝液量為： 由各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可算出各組分的發(fā)酵用量 組分 總用量/t 初始用量/t 葡萄糖 1078 2.695 麥芽糖 539 1.348 酵母膏 385 0.963 蛋白

40、胨 616 1.54 尿素 30.8 0.077 NaHCO 231 0.578 MgSO·7HO 30.8 0.077 NaCl 154 0.385 NHCl 38.5 0.0968發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)8.1發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)通用發(fā)酵罐的主要組成部件有：1.罐體：是發(fā)酵罐的主要結(jié)構(gòu)，其內(nèi)壁有擋板，作用是防止液內(nèi)中心產(chǎn)生漩渦，一般用35塊擋板。2.攪拌裝置：主要功能是使罐內(nèi)物料混合均勻，攪拌器葉輪多采用攪拌渦輪式，攪拌軸要與罐體密封嚴(yán)實(shí)，防止漏液和染菌。攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min.3.傳熱裝置：有夾套，列管等，這里采用外夾套。4.通氣部分：通過空氣分布器將通入的無菌空氣均勻分布到發(fā)酵液中，發(fā)酵罐通

41、風(fēng)量012 h為1：0.67vvm ,12 h至發(fā)酵結(jié)束通風(fēng)量為1：（1.01.33）vvm 。分布器有單管式和環(huán)形管式。5.消泡裝置：用于消除產(chǎn)生的泡沫，最簡單實(shí)用的消泡裝置是耙式消泡器，直接裝在攪拌軸上。6.進(jìn)出料口：罐頂設(shè)有進(jìn)料口，罐底有出料口。其他附屬設(shè)備還包括試鏡、人孔（手孔）、取樣管等，用以觀測和檢修。8.2發(fā)酵罐的工藝尺寸 常用的機(jī)械通風(fēng)發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)和主要幾何尺寸標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)（見附圖）其幾何尺寸比例如下： H0/D=1.73.5 H/D=2.54 d/D=1/31/2 W/D=1/121/8 B/D=0.81.0 S/d=12 h/D=1/4 單位全部為m發(fā)酵罐大小用公稱體積表示，V0=D2×H/4+0.15D3 其中：H0-發(fā)酵罐圓柱形筒身高度 D-發(fā)酵罐內(nèi)徑 H-罐頂?shù)焦薜椎母叨?d-攪拌器直徑 W-擋板寬度 B-下攪拌器距罐底的距離 S-攪拌器間距 h-底封頭或頂封頭高度 已知年產(chǎn)量為50噸，中性淀粉酶產(chǎn)量為805.4mg/L,一年有300個(gè)工作日，發(fā)酵周期為72h，清理發(fā)酵罐1天，預(yù)處理收率92%，提取率為88%，發(fā)酵罐個(gè)數(shù)為4個(gè)，裝料系數(shù)為0.75，V0是公稱容積，指筒身容積與底封頭容積之和，則：發(fā)酵罐體