二液相色譜實(shí)驗(yàn)步驟與方法開發(fā)

1、二液相色譜實(shí)驗(yàn)步驟與方法開發(fā)l一.HPLC的廣泛應(yīng)用l二.方法開發(fā)過程 一）選擇HPLC檢測器 二）分配色譜及選擇流動相 三）方法開發(fā)的具體步驟 四）梯度洗脫方法碳水化合物類脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機(jī)酸蛋白、肽、氨基酸酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素維生素霉菌（黃曲霉毒素農(nóng)藥殘留和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHS和亞硝酸 在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用 藥物分析有藥物分析有USP、BP、CP等標(biāo)準(zhǔn)等標(biāo)準(zhǔn) 常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類消炎藥等。甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗

2、菌素類藥物研究中的應(yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))醫(yī)療藥物的檢測、新藥研究、藥物代謝、藥代動力學(xué)研究。v 在獸藥研究中分析應(yīng)用在獸藥研究中分析應(yīng)用 在無機(jī)離子分析中應(yīng)用在無機(jī)離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽離子分析 Adapted from: Snyder, L.R.; Kirkland, J.J.; Glajch, J.L; Practical HPLC Metho

3、d Development 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1997, p. 2l想辦法得到各種信息向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法查文獻(xiàn)和方法，如CA,AA,AOAC,EPA-儀器制造商的文獻(xiàn)，如Dionex,Watersl對色譜柱有足夠的了解掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法l充分了解您自己的樣品l靈敏度的要求有多高? l樣品的本底是否很復(fù)雜? l有多少組份要分析? l對分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求? l是否因是日常檢驗(yàn)，而要求方法容易使用? l要分離（即制備）的樣品量有多大? l要分離的組份在樣品中的含量很高? 還是微量? l

4、是否需要保持生物活性? l對分離產(chǎn)物純度的要求有多高? l純度或活性的鑒定如何完成?l色譜柱填料的種類、品牌是否相同?l注意文獻(xiàn)方法的流動相是否損害色譜柱?如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動相l(xiāng)注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量l注意梯度條件l了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）l對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號l應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計(jì)的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系但是：但是：l由于受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響會產(chǎn)生響應(yīng)與濃度之間關(guān)系的與線性偏離現(xiàn)象l并不是所有的檢測器是線性的l受HPLC系統(tǒng)其他部件的影響，檢測器的表現(xiàn)可能與其最佳水平有較大的差距l(xiāng)沒有任何一種單

5、獨(dú)的檢測器可以適應(yīng)所有的液相色譜分離！HPLC檢測器可以分為：檢測器可以分為：l溶質(zhì)性質(zhì)檢測器（選擇型）對溶質(zhì)的物理或化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，一般不反應(yīng)流動相的變化（選擇型）l整體性質(zhì)檢測器（通用型） 不管是否有溶質(zhì)，對流動相任何物理性質(zhì)的變化作出響應(yīng)（通用型）l高靈敏度；可忽略的基線噪音l寬的線性范圍l獨(dú)立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感l(wèi)長時間操作的穩(wěn)定性l低死體積l非破壞性l選擇性l靈敏度是信號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）l檢測限（LOD）：S/N = 3l定量限（LOQ）：S/N = 10l好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/

6、均一性6:1NS要考慮的因素：要考慮的因素： l你要分離的化合物/樣品的化學(xué)特性化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量及紫外光譜等等l流動相的影響（溶劑、緩沖鹽改性劑等）l梯度還是等度l靈敏度需求l是否有雙檢測的需求通用檢測器通用檢測器 RI ELSDMS靈敏度ugngpg線性范圍104否103流速敏感是否是溫度敏感是否否破壞性否是是選擇性檢測器選擇性檢測器 ABSFLEC Cond MS靈敏度ngpgfgpgpg線性范圍105103106105103流速敏感否否是是是溫度敏感否否是是是破壞性否否是否是原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：比耳定律

7、，定量基礎(chǔ)：比耳定律，AKCL優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1）對溫度和流速不敏感）對溫度和流速不敏感 2）可用于梯度洗脫）可用于梯度洗脫 3） 靈敏度較高，靈敏度較高，ng級檢測級檢測缺點(diǎn)：選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)缺點(diǎn)：選擇性檢測器，僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度，可以測大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度，可以測定大多數(shù)的化合物，是目前實(shí)驗(yàn)室中使用最多的定大多數(shù)的化合物，是目前實(shí)驗(yàn)室中使用最多的檢測器檢測器 -多數(shù)公司售出的檢測器中多數(shù)公司售出的檢測器中75%以上是吸以上是吸光度檢測器（其中光度檢測器（其中50%以上是紫外以上是紫外/可見檢可見檢測器，測器，2

8、5%是是PDA）實(shí)際濃度理想10吸光度210光電二極管矩陣檢測器（ PDA ）的特點(diǎn)和用途 一種三維水平的吸光度檢測器-采集三維譜圖 兼顧紫外檢測器及可見分光光度計(jì)的信息在收集色譜圖的同時，得到光譜圖 提供許多有用的功能 -色譜峰的純度鑒定，色譜峰的確認(rèn) -可以發(fā)現(xiàn)單波長檢測時未測到的峰 -任意波長的色譜再處理 -光譜信息-光譜庫的建立檢索和擬合 原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS）使其分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光優(yōu)點(diǎn)：熒光檢測器靈敏度高, pg級檢測缺點(diǎn)：不是所有化合物都有熒光，必要時需要衍生 環(huán)境中的污染物多環(huán)芳烴(PAH)，多酚，氨基甲酸酯等 食品、飲料食品中

9、的毒素；例如：黃曲霉毒素染料維生素及衍生氨基酸 生物技術(shù)及制藥氨基甲酸酯類殺蟲劑OOOOOOCH3黃曲霉毒素多環(huán)芳烴（PAH）OHCH3CH3CH3CH3CH3維生素OOONHCH3CH3CH3l示差折光檢測器（RI）是第一個商品化的液相色譜檢測器（上世紀(jì)六十年代末、七十年代初）通常被認(rèn)為是一種通用檢測器檢測溶液中所有被溶解的溶質(zhì) 非特異性l任何光學(xué)介質(zhì)的折光率都被定義為光在該介質(zhì)中與真空中的速度之比值原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率來測定試樣 各組分濃度。各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測器優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測器缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 1）對溫度變化敏感）對溫度變化敏感

10、 2）不能用于梯度檢測）不能用于梯度檢測 3）靈敏度低，）靈敏度低，ug級檢測級檢測返回示差折光檢測器是通用型檢測器,如果選擇合適的溶劑，幾乎所有的物質(zhì)都可以檢測特別適用于檢測沒有紫外吸收的化合物,例如糖類,醇類,酯類以及脂肪酸等高分子化合物GPC,GFC分析以及復(fù)雜樣品純化l用氮?dú)獍蚜鲃酉啻党杉?xì)霧狀l流動相的液滴通過一個預(yù)加熱的腔體后被蒸發(fā)掉l蒸發(fā)的溶劑被從檢測器中除去l溶質(zhì)的揮發(fā)性小于流動相，因此產(chǎn)生顆粒束與光束相交l被顆粒散射的光由光電倍增管（PMT）收集lPMT的輸出與溶質(zhì)的存在量呈比例關(guān)系l通用型 比流動相揮發(fā)性小的物質(zhì)都能被檢測可以作梯度實(shí)驗(yàn)；檢測下限可到納克級水平對環(huán)境條件不敏感

11、；可以使用有強(qiáng)紫外吸收的溶劑作流動相l(xiāng)應(yīng)用領(lǐng)域：碳水化合物油脂及脂肪酸未衍生的氨基酸制藥行業(yè)表面活性劑天然產(chǎn)物l不能使用不揮發(fā)性的流動相（例如：磷酸鹽）l要求使用霧化氣源（典型的是氮?dú)饣蚩諝猓﹍不同的色譜條件下霧化及除溶劑的參數(shù)需要重新優(yōu)化l破壞性技術(shù)l蒸發(fā)出的溶劑要引到戶外或通風(fēng)櫥里l對揮發(fā)性化合物的檢測不理想l一般得到的是非線性校正曲線l某些化合物的檢測靈敏度不如其他檢測器l色譜基本分類：色譜基本分類： 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以分按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以分為：為： 1.分配色譜分配色譜分配系數(shù)分配系數(shù) * 2.親和色譜親和色譜親和力親和力 3.吸

12、附色譜吸附色譜-吸附力吸附力 4.離子交換色譜離子交換色譜離子交換能力離子交換能力 5.凝膠色譜（體積排阻色譜）凝膠色譜（體積排阻色譜）-分子大小引起的體積排分子大小引起的體積排阻阻分配色譜分為：分配色譜分為： 正相色譜：固定相（填料）為極性，流動相為非極性正相色譜：固定相（填料）為極性，流動相為非極性 反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動相為極性。反相色譜：固定相（填料）為非極性，流動相為極性。 用得最多，約占用得最多，約占60-70%相對應(yīng)的色譜柱：相對應(yīng)的色譜柱： 反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如反相柱：烷基硅烷鍵合硅膠填料，如C18（ODS） C8,C4,C3，苯基等，苯基等 正相柱

13、：典型的為硅膠柱，其它官能團(tuán)為正相柱：典型的為硅膠柱，其它官能團(tuán)為-CN氰基，氰基， -NH2氨基等氨基等l反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離l洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫反相色譜最常用的流動相及其洗脫強(qiáng)度： 水 甲醇乙腈 乙醇丙醇異丙醇四氫呋喃 最常用的流動相組成“甲醇-水；乙腈-水”正相色譜最常用的流動相及其洗脫強(qiáng)度： 正己烷乙醚乙酸乙酯異丙醇 *應(yīng)用添加劑，成為離子對、離子抑制方法l樣品易溶，且溶解度盡可能大l化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子l不妨礙檢測器檢測，所選波長處無吸收 *l黏度低，流動性好 *l無毒或低毒，易于操作l易于從其中回收樣品l易于制成高純度，即色譜純l廢液易處

14、理，不污染環(huán)境l先用一根短的色譜柱l用相對較高的流速l使用盡可能純度高的標(biāo)準(zhǔn)品l先用高強(qiáng)度的洗脫液l調(diào)節(jié)k 值改變保留值l調(diào)節(jié)a值改變選擇性l通過改變流動相的pH值，使樣品成中性l加入“對離子”，使樣品呈中性l調(diào)節(jié)柱長度改變柱效及分離速度請記住請記住 每次改變一個參數(shù) 每次改變一個參數(shù)l開發(fā)過程實(shí)例色譜條件l色譜柱：C18，4.6mm15mml流動相：乙腈/水，乙腈從100%逐漸降低（或走梯度） 舉例中用不同的溶劑強(qiáng)度，60/40、50/50、40/60，由強(qiáng)漸弱l流速：1ml/min樣品： 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對

15、羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)60/4050/5040/60譜圖l同樣強(qiáng)度的不同溶劑，改變了流動相值l改變色譜柱62:38 / 42:58 / 72:28 / 2322OHCNCHOHMeOHOHTHFl離子型化合物的分離方式多數(shù)化合物是離子型的！l使用離子交換柱：離子交換法主要用于“強(qiáng)”陰、陽離子l使用反相柱離子抑制色譜法：通過改變流動相的pH值，使樣品成中性離子對色譜法：加入“對離子”，使樣品呈中性l離子型化合物在反相色譜柱上不保留l改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離使樣品成中性l適用于弱酸性化合物的分離加入TFA,磷酸鹽等降低流動相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)

16、C18填料l使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內(nèi)l而在乙腈/水并且pH=7時，多數(shù)組份保留時間很短，無法完全分離。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234l下列情況下不能使用離子抑制方法，如果：一些酸在pH低于2時還保持離子化一些堿在pH高于7時還保持離子化l可以有以下的選擇離子交換色譜使用聚合物或其他耐堿性流動相的反相柱，在pH高于7時用離子抑制法使用“離子對色譜法”l在反相色譜流動相內(nèi)加入“離子對”試劑與樣品中可電離的組份形成“對離子”在反相色譜柱上分離離子型化合物l離子對試劑的類型季銨鹽、叔胺鹽 （正離子），適用于弱酸烷基磺酸鹽、高氯酸鹽

17、（負(fù)離子），適用于弱堿l烷基長度不同，形成對離子的能力不同 抗組胺及減充血劑藥物的分析抗組胺及減充血劑藥物的分析NC O N H2NH3CH OC H2O HC H2O HNNNNH3CH3COOC H2C HC HC HH OH OH OC H2O HNNH3CN H2C H2NSC H2C H2O HC H3 Cl-+1 . N ia c in a m id e 煙 酰 胺2 . P y r id o x in e 吡 哆 素 ， V B 63 . R ib o f la v in 核 黃 素 ， V B 24 . T h ia m in e 硫 胺 素 ， V B 1l流速對柱效的影響不

18、同內(nèi)徑的色譜柱有自己的最佳流速l樣品的進(jìn)樣量(濃度)對柱效的影響l樣品的進(jìn)樣體積對柱效的影響l溶劑粘度對柱效的影響以上因素均影響分離度l如果沒有與文獻(xiàn)或要求相近的色譜柱轉(zhuǎn)換進(jìn)樣量轉(zhuǎn)換流速長度=內(nèi)徑，L=DL)(DL)(DLoad=進(jìn)樣量(Load)初始2初始現(xiàn)在2現(xiàn)在初始內(nèi)徑=D)(D)(DF=流速(F)2初始2現(xiàn)在初始l l 梯度洗脫方法l關(guān)于梯度洗脫過程及其優(yōu)點(diǎn).l如何優(yōu)化梯度分離.l有關(guān)梯度分離的一些實(shí)用考慮.l穩(wěn)定平滑并且重現(xiàn)性好的流速l可靠且充分的溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的自動溶劑混合準(zhǔn)確及重現(xiàn)的梯度形成l有效的流速范圍制備色譜或微柱、窄柱色譜要考慮l滯后體積梯度分析更為關(guān)注目的：在任何情

19、況下保持最高精度目的：在任何情況下保持最高精度l高壓梯度及低壓梯度溶劑 A溶劑 B泵 A泵 B混合器A 高壓梯度溶劑 A泵溶劑 B比例閥（溶劑混合點(diǎn)）混合器B 低壓梯度（溶劑混合點(diǎn)）死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意注意 滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例閥檢測器進(jìn)樣器ABCD色譜柱色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度 阻尼器 混合器l滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為，流速l實(shí)際梯度會比設(shè)置值晚 2 分鐘響應(yīng)，沒有

20、問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速l實(shí)際梯度會比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受l滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好l普通分析型液相色譜的滯后體積為14ml（戴安的4元泵700l，高壓泵400l ）l設(shè)計(jì)不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化l滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好l用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)P680A LPG without pulse

21、 damperBack-pressure:60 bar, 85 bar and 105 barVariation: 2%Acclaim 120, C18, 5 m, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25C; 5 L injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L eachl優(yōu)點(diǎn)縮短分析

22、時間增加分離能力檢測靈敏度提高l缺點(diǎn)儀器設(shè)備要求高不適合某些檢測方式(RI)柱需再生平衡定量分析的重復(fù)性較低？n早流出峰的分離度差.n遲流出峰的峰寬增加而峰高降低.n由于k范圍寬，所以分析時間長.n強(qiáng)保留組分造成柱污染.等梯度洗脫等梯度洗脫 - 在洗脫樣品的整個過程中，流動相的組成保持不變.優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 改善分離度 提高檢測性能 能夠分離復(fù)雜樣品 縮短分析時間 降低由于強(qiáng)保留組分而使色譜 柱性能變差的可能性其他應(yīng)用其他應(yīng)用 柱清洗 方法開發(fā)中的嘗試運(yùn)行 梯度洗脫梯度洗脫 - 在分離過程中改變流動相組成.% Org02550751000102030Time (min)k增加有機(jī)改性劑的含量增加有機(jī)改性劑的含量分配轉(zhuǎn)移到流動相分配轉(zhuǎn)移到流動相增加化合物的流速增加化合物的流速5%有機(jī)相100%有機(jī)相從嘗試運(yùn)行開始 - 一個平緩的梯度您必須確定: 有機(jī)溶劑 初始組成 梯度時間 梯度陡度 梯度形狀 流速 柱長 柱重新平衡時間010203040min.100% B100% B0% B0% BtG = 40tG =