陣列叉指式芯片研究細(xì)胞介電電泳富集過程

1、陣列叉指式芯片研究細(xì)胞介電電泳富集過程         11-04-23 13:21:00     編輯：studa20              作者：郝敦玲 徐溢 曾雪 曹強(qiáng) 溫志渝 【摘要】  采用陣列叉指電極介電電泳(Dielectrophoresis，DEP)芯片，構(gòu)建了集成DEP芯片分析和操控系統(tǒng)，應(yīng)用Covento

2、rware有限元分析軟件模擬分析了芯片表面的電場分布情況;以紅細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞樣品為分析對象，實(shí)現(xiàn)了兩種細(xì)胞樣品在芯片上的正負(fù)介電電泳定位富集。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，交流信號幅值Vpp是決定DEP富集效率的主因，交流信號頻率f和緩沖溶液是改變細(xì)胞介電電泳類型的參量;在0.9% NaCl中，施加頻率為10和3 MHz、電壓5 V的交流頻率，結(jié)腸癌細(xì)胞的正介電電泳(Positivedielectrophoresis, pDEP)和負(fù)介電電泳(Nagetivedielectrophoresis, nDEP)富集效率分別為87.2%和84.8%。 【關(guān)鍵詞】  芯片介電電泳，細(xì)胞富集，陣列叉指電極1 引

3、 言芯片介電電泳(Microchip dielectrophoresis)是以介電電泳分離原理和微機(jī)電加工技術(shù)為基礎(chǔ)的新型分析技術(shù)，在生化樣品分析方面明顯優(yōu)于常規(guī)檢測方法。近年來，芯片介電電泳已從最初的對中性粒子的簡單富集操作，擴(kuò)展到對細(xì)菌、細(xì)胞、病毒、納米材料和金屬顆粒等物質(zhì)的富集、分離和操控等方面14。介電電泳(Dielectrophoresis，DEP)與流體力5、電場力6、激光鑷子7等模式耦合的研究已有報道，同時將芯片介電電泳技術(shù)與其它分析方法耦合也是新的研究方向。芯片介電電泳分析系統(tǒng)的微電極結(jié)構(gòu)是決定其分析性能的關(guān)鍵，因此設(shè)計出分離性能更高、結(jié)構(gòu)更合理的微電極備受關(guān)注。近年來，DEP

4、芯片電極構(gòu)型已由傳統(tǒng)的平面式電極發(fā)展為三維式電極，出現(xiàn)了夾板式電極、籠式電極和絕緣柱式電極等多種結(jié)構(gòu)8，9。本研究以陣列叉指電極式DEP芯片為核心單元構(gòu)建DEP芯片分析系統(tǒng)，在對叉指電極表面的電場分布情況和介電電泳力作用范圍進(jìn)行計算模擬的基礎(chǔ)上，以紅細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用構(gòu)建的DEP芯片分析系統(tǒng)對細(xì)胞樣品的介電電泳富集過程進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為快速高效檢測復(fù)雜體系中細(xì)胞樣品奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 儀器與試劑Agilent 33220A型任意函數(shù)信號發(fā)生器(安捷侖公司); IX71奧林巴斯熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司); Alpha Innotech型微泵(美國

5、Alpha公司); Qcapture pro.圖像采集處理軟件， Camtasia Studio屏幕錄制軟件。Sylgard184有機(jī)硅彈性體即聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS;美國道康寧公司)，用于澆注PDMS蓋片。緩沖液配制： 分別精確稱取4.000 g NaCl， 0.100 g KCl， 1.744 g Na2HPO4·12H2O和0.100 g KH2PO4， 溶解并定容至500 mL容量瓶中，配制成磷酸鹽緩沖液(PBS)。抗凝劑配制：稱取EDTA2Na 4.0 g溶解定容于100 mL容量瓶中。0.9%NaCl醫(yī)用生理鹽。以上試劑均用0

6、.22 m高溫滅菌后的微孔濾膜過濾后備用。樣品：紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)形狀呈雙面凹陷的圓盤狀，直徑約7.5 m;116型結(jié)腸癌細(xì)胞(colon cancer cell)呈圓球形，直徑約15 m。所有細(xì)胞樣品均由重慶第三軍醫(yī)大西南醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科提供。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1 陣列叉指電極DEP芯片制作及分析系統(tǒng)搭建 DEP芯片的底片為鍵合有Au電極的玻璃片，陣列叉指電極寬度和間距均為30 m，玻璃底片尺寸為25 mm×17 mm×2 mm，由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所外協(xié)制作。采用PDMS制作DEP芯片的蓋片。將PDMS預(yù)聚體和固化劑按質(zhì)量比10

7、:1混合均勻，澆注于硅烷化處理后的SU8管道陽膜上，脫氣后于60 恒溫干燥箱中固化4 h，室溫冷卻后小心剝離PDMS蓋片，用孔徑為3 mm的打孔器在PDMS蓋片上打孔備用，形成的微管道寬150 m，深30 m，長10 mm。將帶有微管道的PDMS蓋片依次用乙醇、二次蒸餾水、乙醇清洗后風(fēng)干備用。鍵合Au電極的玻璃底片用丙酮輕輕擦洗并風(fēng)干，備用。最后將玻璃底片與PDMS蓋片密合，抽負(fù)壓吹干，即完成陣列叉指電極式DEP復(fù)合式結(jié)構(gòu)芯片的制作，芯片實(shí)物和電極構(gòu)型如圖1所示，芯片分析系統(tǒng)構(gòu)建如圖2所示。a. 進(jìn)樣口(Inlet); b. 廢液池(Outlet); c. 注射微泵(Injection mic

8、ropump); d. 注射器(Injection syring); e. 信號發(fā)生器(Signal generator); f. 示波器(Digital oscilloscope); g. 電源控制器(Power controller). 分 析 化 學(xué)第37卷第9期郝敦玲等：陣列叉指式芯片研究細(xì)胞介電電泳富集過程 2.2.2 影響細(xì)胞DEP富集的因素 (1)緩沖介質(zhì)固定交流信號幅值Vpp為5 V，在不同頻率f下，考察紅細(xì)胞在PBS和0.9%NaCl兩種緩沖溶液中的介電電泳富集過程; (2)交流信號幅值Vpp 選擇0.9%NaCl醫(yī)用生理鹽水為緩沖溶液，固定交流信號頻率為10 MHz，考察V

9、pp在110 V范圍逐步變化時，紅細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的富集過程; (3)頻率f 選擇0.9%NaCl醫(yī)用生理鹽水為緩沖溶液，固定交流信號幅值Vpp為5 V，考察f在120 MHz范圍逐步變化時，紅細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的富集過程。2.2.3 結(jié)腸癌細(xì)胞介電電泳富集 以116型結(jié)腸癌細(xì)胞作為分析對象，緩沖溶液選用0.9% NaCl，細(xì)胞濃度為103104 cell/mL，Vpp=5 V，分別在10 MHz和3 MHz條件下，對結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行DEP富集實(shí)驗(yàn)。3 結(jié)果與討論3.1 陣列叉指電極式DEP芯片上電場分布模擬依據(jù)芯片介電電泳原理，通過有限元方法數(shù)字化程序，在建立合適的二維模型基礎(chǔ)之上，模擬不同的幾

10、何結(jié)構(gòu)電極的電場分布，在給定的邊界條件和參數(shù)下，預(yù)測電場梯度的變化。這不僅有利于確定最優(yōu)的電極結(jié)構(gòu)，還能確定介電電泳的有效作用區(qū)域10。本實(shí)驗(yàn)采用Coventorware有限元分析軟件對DEP芯片管道內(nèi)的電場分布進(jìn)行了模擬。在2 V 1 MHz的交流信號下，電極寬度和間距與芯片實(shí)際尺寸相同均為30 m，陣列叉指電極表面不同高度處的E分布情況如圖3所示。當(dāng)叉指電極寬度和間距為30 m時，電極表面電場梯度分布差異明顯，電場梯度最大的位置出現(xiàn)在叉指電極的邊緣，為細(xì)胞受正介電電泳(Positivedielectrophoresis, pDEP)時的富集位置;電場梯度最小的位置出現(xiàn)在兩電極之間，為細(xì)胞受

11、負(fù)介電電泳(Nagetivedielectrophoresis, nDEP)時的富集位置，故而在此芯片上可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞樣品在不同位置的DEP富集。從圖3還可以看到，隨著距電極表面距離的增加，E顯著降低，DEP作用力明顯下降。當(dāng)距離達(dá)到30 m時，E接近于零，介電作用力幾乎消失。因此，可確認(rèn)30 m是DEP力的有效作用范圍，將其作為DEP芯片管道高度可實(shí)現(xiàn)對樣品對象的有效DEP操控。3.2 影響細(xì)胞介電電泳富集的因素根據(jù)介電電泳原理，細(xì)胞所受的介電電泳力F=20mr3RefCM|Erms|2, 其中0和m分別為真空介電常數(shù)和介質(zhì)介電常數(shù)，|Erms|2為電場強(qiáng)度絕對值的拉普拉斯算符， RefCM為

12、ClausiusMossotti因數(shù)，其中fCM=*p-*m*p+2*m, *p和*m分別代表細(xì)胞和緩沖液的綜合介電常數(shù)，*=-i/，其中是介電常數(shù)，i代表-1，是電導(dǎo)率，為外加電場的角頻率。因此，在實(shí)驗(yàn)中可以通過改變緩沖介質(zhì)配比、外加電場電壓和頻率等參數(shù)來實(shí)現(xiàn)粒子的定向操控和分離分析等目的。3.2.1 交流信號幅值Vpp對細(xì)胞DEP富集的影響 細(xì)胞所受介電電泳力除與電場強(qiáng)度E2成正比外，還與細(xì)胞半徑r3成正比。因此，當(dāng)Vpp相同時，結(jié)腸癌細(xì)胞的富集速度要明顯快于紅細(xì)胞的富集速度。實(shí)驗(yàn)選擇0.9% NaCl醫(yī)用生理鹽水為緩沖溶液，固定交流信號輸出頻率為10 MHz，實(shí)驗(yàn)考察了不同Vpp時兩種細(xì)胞富集的情況。 圖4 紅細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞在不同電壓下的富集時間1. 紅細(xì)胞(Red blood cell, RBC ); 2. 結(jié)腸癌細(xì)胞(Colon cancer cell)。首先界定從開始施加交流信號到細(xì)胞DEP富集過程完成細(xì)胞不再運(yùn)動為止的時間為細(xì)胞的富集時間t，實(shí)驗(yàn)測得細(xì)胞富集時間t隨Vpp的增加而減小，且同一電壓下結(jié)腸癌細(xì)胞的富集時間明顯小于紅細(xì)胞(如圖4)。當(dāng)Vpp<3 V時，D