硫酸亞鐵對潰瘍性結腸炎模型大鼠氧化應激狀態(tài)的影響

1、    硫酸亞鐵對潰瘍性結腸炎模型大鼠氧化應激狀態(tài)的影響            作者：時間：2007-11-22 11:02:00                          

2、0;           作者：張道權，吳正祥，吳強 ，楊楓，吳正升 【摘要】  目的 考察口服硫酸亞鐵（FeSO4 ）對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的潰瘍性結腸炎（UC）模型大鼠氧化應激狀態(tài) 的影響。方法 采用TNBS乙醇溶液復制UC大鼠模型，雄性SD大鼠60只，隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、FeSO 4對照組（100 mg·kg-1·d-1）和FeSO4 低劑量組（50 mg ·kg-1·d-1）、中劑量組（100

3、mg · kg-1·d-1 ）和高劑量組（300 mg · kg -1·d-1），給藥2周后分別觀察大鼠的一般狀態(tài)、組織病理學變化、組織及血清超氧化物歧化酶（SOD）與丙二醛（MDA）水平。 結果 FeSO4 中、高劑量組大鼠體質(zhì)量減輕，腹瀉動物數(shù)增加，結腸組織損傷加重，血清與結腸組織SOD活性降低、MDA水平升高（P<0.05）。結論 UC模型大鼠體內(nèi)存在氧化應激，口服補充FeSO4 可能會進一步加劇其體內(nèi)氧化應激狀態(tài)及結腸組織病理學損傷。 【關鍵詞】  硫酸亞鐵;潰瘍性結腸炎;三硝基苯磺酸;氧化應激;大鼠潰瘍性結腸炎（ulcerati

4、ve colitis，UC）是一種病因  不明的直腸和結腸慢性非特異性炎癥，臨床主要表現(xiàn)為反復發(fā)作的腹痛、腹瀉及黏液膿血便，重癥或病情持  續(xù)活動的患者可出現(xiàn)缺鐵性貧血。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，給予UC患者口服鐵劑不能很好地被耐受，甚至會加重  胃腸道癥狀或促進疾病活動1。硫酸亞鐵（ferrous   sulfate，F(xiàn)eSO 4 ）是臨床最為常用的鐵劑之一，同時也是一種強氧化劑，可能會因產(chǎn)生自由基（oxygen-derived   free radicals，OFR）而加重組織損傷2。本實驗利用三  硝基苯磺酸（2，4，6

5、- trinitrobenzene sulfonic acid，TN-  BS）復制UC模型，觀察FeSO4對UC模型大鼠氧化應激狀態(tài)的影響，為臨床治療提供依據(jù)。1 材料和方法   1.1 藥物和試劑 TNBS購于Sigma公司，5%（W/V）水溶液，批號為P2297;FeSO4，上海黃浦制藥有限責任公司生產(chǎn)，批號為050606，輕輕把FeSO4片研碎，稱取一定量的粉末，加入蒸餾水配成100 mg · ml    -1的混懸液備用;丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮蘭蛋白  檢

6、測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號為20060323。   1.2 動物 雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200220 g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，普通級。  1.3 儀器 756MC紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限  公司），TGL-16H高速離心機（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司），可控式硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司），QL-901漩渦混合器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀表廠），電子分析天平（上海天平儀器廠），DIAX-900內(nèi)切式組織勻漿機（德國Heidolph公司）。 1.4 大鼠UC模型制備3健

7、康大鼠60只，隨機分為6組。留2組作正常對照組與FeSO    4 對照組，余4組均制備模型，禁食不禁水24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 ml·kg-1）使大鼠輕微麻醉后，將直徑2 mm的乳膠管經(jīng)肛門輕輕插入大鼠體內(nèi)大約8 cm處，將TNBS（125 mg·kg    -1）的50%乙醇溶液緩緩注入到大鼠腸腔內(nèi)，提起大鼠尾部，倒置30 s，使造模劑充分滲入大鼠腸腔。  1.5 分組及給藥 將正常大鼠隨機分為正常對照組與FeSO4對照組，每組10只;將造模大鼠隨機分為模型對照組，F(xiàn)

8、e-SO4給藥高、中、低劑量組，每組10只。FeSO4對照組大鼠，按照100 mg · kg-1·d-1    灌胃FeSO4混懸液;Fe-SO4高、中、低劑量組大鼠，分別按照300 mg·kg-1·d-1  、100 mg ·kg-1· d-1、50 mg·kg-1· d    -1灌胃FeSO4混懸液;正常對照組及模型對照組大鼠每天灌胃同體積生理鹽水，各組大鼠均在造模后6 h開始給藥，連續(xù)給藥2周。  1.6 癥狀觀察&#

9、160;每天對各組大鼠進行稱重，觀察體質(zhì)量變化并記錄;觀察大鼠糞便形狀，記錄大鼠發(fā)生腹瀉、血便的數(shù)量。  1.7 結腸黏膜組織損傷評分 各組大鼠給藥2周后，3%戊巴比妥鈉過量麻醉，腹主動脈取血2 ml，離心后置-80 冰箱保存?zhèn)溆?。將肛門以上10 cm腸段取出，沿腸系膜縱行切開，用冰生理鹽水沖洗，并稱量。將黏膜向上展開，觀察黏膜損傷并按照Wallace和Keenan1990年的評分標準4進行評分:0分為無炎癥和潰瘍;1分為局部充血但無潰瘍;2分為有潰瘍但無充血;3分為有1處潰瘍及炎癥; 4分為有2處或2處以上潰瘍及炎癥;5分為潰瘍延伸超過2 cm。同時取少量炎癥腸

10、組織，迅速放置液氮罐中備用。  1.8 病理組織切片觀察 取肛門以上8 cm腸段卷起，置10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋，行4m厚連續(xù)切片，HE染色觀察組織學變化。  1.9 生化指標測定 血清及結腸組織MDA、SOD均按照檢測試劑盒說明書進行操作。  1.10 統(tǒng)計學處理 計量指標以 x-±s 表示，多組間比較行方差分析，各組間兩兩比較行LSD檢驗，采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。   2 結  果    2.1 一般

11、狀態(tài)及大便性狀的變化 見表1。正常組與FeSO 4對照組大鼠活動如常，反應機警，毛發(fā)有光澤，飲食正常，體質(zhì)量增長較多，無腹瀉及便血;制模大鼠精神萎靡，毛發(fā)無光澤，飲食減少，均出現(xiàn)不同程度的腹瀉、便血。正常對照組與 FeSO4對照組大鼠體質(zhì)量增加、腹瀉及便血無顯著性差異;與正常對照組比較，模型對照組大鼠體質(zhì)量增加明顯減少（ P <0.01）;FeSO4中、高劑量組大鼠體質(zhì)量增加顯著低于模型對照組（ P <0.05），發(fā)生腹瀉、便血動物只  數(shù)明顯增多。表1 各組大鼠發(fā)生腹瀉數(shù)及體質(zhì)量變化（略）      

12、  2.2 結腸損傷評分及生化指標改變 見表2。觀察大鼠結腸外觀及黏膜表面發(fā)現(xiàn)，正常對照組與FeSO4 對照組大鼠結腸黏膜無明顯充血水腫，未見糜爛及潰瘍灶;模型對照組大鼠的結腸多數(shù)與  相鄰臟器有輕度的粘連，結腸充血水腫，在距肛門8cm  的腸段有較大的潰瘍病灶，病灶處結腸壁增厚，腸黏膜表面發(fā)生潰瘍糜爛壞死，與正常對照組大鼠相比，結腸明顯變短，結腸質(zhì)量增加;FeSO4各劑量組大鼠結腸水腫、糜爛等炎性癥狀明顯加重，潰瘍面積增大。模型組結腸病理損傷評分、結腸組織和血清MDA水平均高于正常對照組（P<0.01），結腸組織和血清SOD水平均低于正常對照組（

13、P<0.01）;與模型對照組比較，F(xiàn)e-SO4中、高劑量組結腸組織損傷評分、結腸和血清  MDA水平顯著升高（P<0.05），結腸和血清SOD水平顯著降低（ P <0.05），中、高劑量組之間無明顯差異;上述指標在FeSO4 對照組與正常對照組未見統(tǒng)計學差異（P>0.05）。表2 各組大鼠結腸損傷以及生化指標的影響（略）   2.3 結腸組織病理學變化 見圖1。正常大鼠結腸組織結構清晰，黏膜完整，腸腺豐富，排列緊密（圖1A）;TNBS造模后，大鼠結腸  組織黏膜壞死脫落，潰瘍形成，大量中性粒細胞浸潤，腺體消失（

14、圖1B）;FeSO4    對照組大鼠結腸組織粘膜結  構完整，未見潰瘍形成（圖1C）;FeSO4低、中、高劑量組大鼠結腸組織腸黏膜上皮脫落缺損加重、潰瘍區(qū)域明  顯增大，黏膜周圍上皮增生修復減慢，炎細胞增加（圖1DF）。  3 討  論       TNBS是一種半抗原，其誘導產(chǎn)生的大鼠模型除發(fā)生腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕等臨床癥狀外，還可以誘發(fā)大鼠腸道炎癥，腸黏膜發(fā)生潰瘍、水腫、糜爛、大量炎性細胞浸潤等組織病理學改變，類似于人類的UC，由于制備簡單省時而被

15、廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基在UC的發(fā)病中起重要作用，氧自由基對自身組織產(chǎn)  生攻擊作用，參與并通過脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生炎癥介質(zhì)（白三烯、前列腺素等）活化炎癥反應5。MDA是氧自由基觸發(fā)細胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應的產(chǎn)物，其含量反應了組織過氧化損傷程度，它能使腸粘膜組織損害進一步加重。MDA水平的高低又間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是重要的過氧化物分解酶，能有效清除氧自由基從    而抑制脂質(zhì)過氧化反應，并能穩(wěn)定細胞膜，SOD水平的高低間接反應了機體抗氧化能力。Aghdassi等6報道，給予UC模型大鼠腹腔注射右旋糖苷

16、鐵，可以加重  其結腸損傷，加劇其粘膜氧化應激狀態(tài)。 本研究中，F(xiàn)eSO4中、高劑量組給藥均可以惡化TN-BS造模導致大鼠的腹瀉、體質(zhì)量減輕等癥狀，加重UC模型大鼠結腸的組織學損傷，降低結腸組織及血清SOD的活力，升高結腸組織及血清MDA水平，對UC模型大鼠的氧化應激狀態(tài)表現(xiàn)出明顯的加劇作用;但在給予正常大鼠同等劑量FeSO4 時未見上述情況發(fā)生。綜上所述，UC大鼠機體抗氧化能力減弱，處于氧化應激狀態(tài);當給予口服一定劑量FeSO4 時，可能通過Fe2+作用產(chǎn)生大量氧自由基，導致機體的氧化應激進一步惡化，從而加劇機體的氧化損傷。因此，對于UC  合并貧血補鐵治療時，

17、應選擇正確的補鐵方式（如非離子鐵），合理的營養(yǎng)干預，提高機體抗氧化能力，對于預防口服補鐵引起的氧化應激，減輕氧化損傷，減少并發(fā)  癥的發(fā)生有重要意義。   【參考文獻】  1 Oldenburg B，Koningsberger J C，Van Berge Henegouwen GP，et al.Iron and inflammatory bowel diseaseJ.Aliment Pharmacol Ther，2001，15（4）:429-438. 2Aust S D，Morehouse L A，Thomas C E.Role of meta

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