石榴皮中烏索酸和齊墩果酸含量的反相高效液相色譜測定

1、石榴皮中烏索酸和齊墩果酸含量的反相高效液相色譜測定         【摘要】  目的建立反相高效液相色譜法同時測定石榴皮中烏索酸和齊墩果酸的含量，并進行方法學(xué)考察。方法色譜柱為Kromasil C18分析柱 (4.6 mm×250 mm, 5 m)，流動相為甲醇-水-磷酸(88120.1)，流速0.8 ml·min-1，光電二極管陣列檢測器（PAD），檢測波長210 nm，柱溫28 。結(jié)果在選定色譜條件下線性范圍良好，烏索酸和齊墩果酸的樣品加樣回收率分別為99.3%和98.5 %，RS

2、D為2.20%和1.78%。結(jié)論方法測定快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于石榴皮中烏索酸和齊墩果酸含量的定量分析。 【關(guān)鍵詞】  石榴皮 高效液相色譜法 烏索酸 齊墩果酸 光電二極管陣列檢測器Abstract:ObjectiveTo develop a quantitative method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Cortex Granati by RP-HPLC.MethodsHPLC with photodiode array detector (PAD) was car

3、ried out on Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 m) at 28 using methanol-water- phosphoric acid (88120.1) as mobile phase with a flow rate of 0.8 ml·min-1 and detected wavelength was at 210 nm.ResultsThe good linear relationship was obtained under the optimum conditions. The recoveries of

4、 the standards added for ursolic acid and oleanolic acid were 99.3% and 98.5%, respectively, while the relative standard deviations was 2.20 % and 1.78%. ConclusionThe method is rapid and precise.It can be used to determine the ursolic acid and oleanolic acid in Cortex Granati.Key words:Cortex Grana

5、ti;  HPLC;  Ursolic acid;  Oleanolic acid ;   Photodiode array detector石榴皮是石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮，味酸、澀，性溫，具有澀腸止瀉、止血、驅(qū)蟲之功效，可用于久瀉、久痢、便血、蟲積腹痛等的治療，為歷版中國藥典所收錄，含量測定項以鞣質(zhì)為定量標(biāo)準(zhǔn)1。石榴皮含多種化學(xué)成分，如沒食子酸、石榴皮亭A、石榴皮亭B、鞣云實精、鞣花酸、安石榴林等2。安明等3研究了石榴中烏索酸的最佳提取工藝條件，并按中國藥典1995年版部山茱萸項下方法測定了石榴中烏索酸的

6、含量，但石榴皮中烏索酸和齊墩果酸的成分鑒定研究和含量測定均未見文獻報道。本實驗采用反相高效液相色譜法同時測定了石榴皮中烏索酸和齊墩果酸的含量，并進行了定性鑒別，為藥材的質(zhì)量控制和評價提供實驗依據(jù)。1  儀器與試藥1  儀器  高效液相色譜儀（515型泵，2996光電二極管矩陣檢測器，柱溫箱，Empower中文色譜工作站，美國）； CP225D分析天平（德國Sartorius公司）；KS-1500超聲提取儀器(寧波科盛儀器廠)。2   試藥 甲醇，色譜純（上海陸忠試劑廠）；95 %乙醇，分析純（江西同盟試劑廠）；水為高純水；烏

7、索酸和齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110742-200314、110709-200304，供含量測定用)。石榴皮，市售。2  方法與結(jié)果2.1  檢測波長的選擇取對照品和石榴皮樣品溶液進樣，使用PAD檢測器在190600 nm波長范圍進行光譜掃描，流動相中烏索酸和齊墩果酸的紫外光譜吸收特征一致，最大吸收波長均為202.2 nm (見圖1)。為了消除流動相在短波長處的末端干擾，提高信噪比，提取不同波長的色譜圖進行比較，選擇210 nm為檢測波長時信噪比高，基線平穩(wěn)。2.2  色譜條件色譜柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250

8、 mm，5 m)；流動相：甲醇-水-磷酸（88:12:0.1）；檢測波長：210 nm；流速：0.8 ml/min；柱溫：28；進樣量：20 l。外標(biāo)法定量分析，烏索酸和齊墩果酸分離度為1.95，理論塔板數(shù)均大于13 000。烏索酸、齊墩果酸對照品和石榴皮樣品溶液色譜見圖2。2.3  峰純度分析采用Empower色譜軟件適應(yīng)性模塊對此波長的色譜峰進行純度分析，對照品和樣品中烏索酸和齊墩果酸色譜峰的純度角值均小于閾值，純度角線均位于自動閾值線下方，證實色譜峰為單一組分吸收率。烏索酸和齊墩果酸的色譜峰純度分析見圖3。      

9、   2.4  溶液配制分別精密稱定烏索酸、齊墩果酸對照品3.59 mg和1.74 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品混合溶液，備用。2.5   線性關(guān)系考察分別精密吸取烏索酸和齊墩果酸對照品混合溶液中1，4，8，12，16 l進樣分析，按色譜條件測定峰面積，以對照品進樣量(g)為橫坐標(biāo)，峰面積(V·s)為縱坐標(biāo)，進行線性擬合，得烏索酸線性回歸方程為：Y=6.44×105X-5.83×104（r=0.999），齊墩果酸線性回歸方程為：Y=7.54×105X-3.70

10、15;104(r=0.999)。表明當(dāng)烏索酸進樣量在0.3595.744 g，齊墩果酸進樣量在0.1742.784 g時，線性關(guān)系良好。2.6  精密度實驗 精密吸取烏索酸和齊墩果酸的對照品混合液進樣分析，平行5次，測得烏索酸峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.47%（n=5），齊墩果酸峰面積RSD為0.66 %（n=5）。表明進樣方法和儀器系統(tǒng)精密度良好。2.7  重現(xiàn)性實驗精密稱取同一批石榴皮樣品5份，制備樣品溶液，進樣分析。測得烏索酸峰面積RSD為1.49 %（n=5），齊墩果酸峰面積RSD為2.05 %(n=5)，表明重現(xiàn)性良好。2.8  加樣回收率實驗 精密稱

11、取已知烏索酸和齊墩果酸含量的石榴皮樣品6份，分高、中、低3種濃度分別加入烏索酸和齊墩果酸對照品適量，樣品同時處理，制備石榴皮樣品溶液，進樣分析，測定樣品中烏索酸和齊墩果酸的含量，計算加樣回收率。烏索酸和齊墩果酸的平均加樣回收率分別為99.3%（RSD=2.20%）和98.5%（RSD=1.78%）。2.9   樣品含量的測定取不同石榴皮樣品溶液在上述色譜條件下進樣分析，平行3次，測定峰面積，按外標(biāo)法計算烏索酸和齊墩果酸平均含量。不同石榴皮樣品中烏索酸和齊墩果酸存在較大差異，但兩者相對含量較為穩(wěn)定，烏索酸含量約為齊墩果酸的2.5倍。結(jié)果見表1。表1  石榴皮中烏索酸

12、和齊墩果酸的含量（略）3  討論采用二極管陣列檢測器掃描分離組分的紫外吸收光譜快速、簡便，可快速確定被檢測組分在色譜流動相中的最大吸收波長，提取不同波長的色譜進行比對，能在有效消除背景干擾時保證檢測的靈敏度4。HPLC法定量分析，一般采用紫外檢測器，以保留時間定性，峰面積定量。但由于色譜方法的定量能力強而定性能力弱，對于成分復(fù)雜的中藥樣品來說，往往有不同的組分在同一時間或極相近的時間出峰，甚至兩組分完全疊加，因而只用保留時間定性可能會造成分析結(jié)果產(chǎn)生意外誤差。二極管陣列檢測器可以同時在設(shè)定波長區(qū)域內(nèi)的各波長下進行立體數(shù)據(jù)采集，既可以察看各波長下的色譜圖又可以察看各時間下的光譜圖，在比

13、對保留時間的基礎(chǔ)之上，加以光譜確認，因而可以克服僅以保留時間一項指標(biāo)定性的缺點，增強了定性的確定性。此外，二極管陣列檢測器與Empower色譜工作站系統(tǒng)適應(yīng)性軟件聯(lián)用，可分析組分色譜峰峰純度，進一步增強色譜方法的定性能力5。烏索酸和齊墩果酸為同分異構(gòu)體，屬五環(huán)三萜類化合物，結(jié)構(gòu)和極性相似，紫外分光光度法和薄層色譜法均難以使2組分有效地分離，測定的結(jié)果為烏索酸和齊墩果酸的總含量。采用本文建立的HPLC法測定時烏索酸和齊墩果酸達基線分離，分離度大于1.95。經(jīng)光譜歸一化和峰純度積分分析，烏索酸和齊墩果酸色譜峰均為單一組分峰5?！緟⒖嘉墨I】  1國家藥典委員會.中國藥典，部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2005：63. 2李海霞,王 釗,劉延澤.石榴科植物化學(xué)成