胡真真—英語翻譯中文

1、萬古毒素鍵合硅膠整體柱的制備及其在毛細管電色譜中的應用董曉莉，董靖，歐俊杰，朱巖，鄒漢法固定硅膠載體是作為手性固定相，以分離對映體的中央大環(huán)抗生素萬古霉素。單片石英毛細管柱的制備是采用溶膠 - 凝膠過程在一個內(nèi)徑為50毫米的石英毛細管內(nèi)，然后在對萬古霉素作為一個手性拆分還原胺化原位的固定化。通過對映選擇性在非水極性有機或水的流動相中得到了八個對映體，其中大部分是高柱效基線分離。有人指出，極性有機流動相（甲醇/乙腈）中的有機調(diào)節(jié)劑比例控制分辨率和對映體的效率起到了重要的角色。普萘洛爾對映體的分離，在無水流動相的柱效和分辨率的可重復性相對標準偏差在1.1-2.3（N= 5）的行與行注射和7.2-9

2、.6（N= 5）。沙利度胺在水溶液中的流動相為柱與柱的測試分離的可重復性相對標準偏差分別在1.5，2.8和6.1，10.5。關鍵字：毛細管電色譜、拆分對映體、硅膠整柱、萬古毒素DOI 10.1002、elps.2006006051 前言目前，微柱技術的發(fā)展解決了常規(guī)液相技術難以解決的問題，具有低進樣量，低固定相和流動相消耗量，環(huán)保，易于和質(zhì)譜聯(lián)用等特點，因此它已 成為分離科學研究中的熱點和趨勢。在手性拆分上的應用也越來越廣泛，例如微柱液相（CLC）40, 148-150、毛細管電泳（CE）151-156和毛細管電色譜（CEC）48, 90, 157-164；其中CEC在手性分離上的應用尤為突出

3、。CEC 既具有電泳的高效性，亦具有高效液相色譜的高選擇性，成為近幾年發(fā)展最為迅速的色譜技術，逐漸成為當代色譜學發(fā)展的一個新方向。很多在液相色譜中應用的手性固定相，都已通過電色譜柱技術應用于電色譜中。毛細管電色譜柱的制備是CEC的心臟，而原位制備的毛細管整體柱（monolithiccolumn）是CEC中的熱點研究課題。這種色譜柱制備方法簡單，由于使用的聚合方法中的功能單體多樣化，因此該類柱種類豐富多彩，可根據(jù)需求不同制備出滿足條件的整體柱。此外，毛細管整體柱還可以避免制作塞子的麻煩，并克服塞子易產(chǎn)生氣泡的不足。目前已有很多手性毛細管整體柱用于CEC分離的報道50, 66, 165。作為一類重

4、要的整體柱類型，硅膠整體柱在繼承了硅膠基質(zhì)機械強度好，柱效高，壽命長，表面積大和易于化學修飾等優(yōu)點的同時，還由于具有獨立可控的通孔和中孔結構而克服了填充柱柱壓過大的不足，且其非手性特異性作用小，是手性固定相優(yōu)良的載體介質(zhì)，在手性分離中有著廣泛的應用。目前，應用在硅膠整體柱上的手性固定相包括蛋白類30, 107, 108, 166，環(huán)糊精類111，離子交換型114，配體交換型49, 50和纖維素類110, 167。大環(huán)抗生素是Armstrong等人32首次將其引入到手性固定相作為選擇試劑，它的選擇性較高，成為一類重要的且新興的手性選擇試劑。其發(fā)展極為迅速, 在高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(

5、 TLC)、毛細管電泳(CE)、毛細管電泳質(zhì)譜(CE-MS)和毛細管電色譜(CEC)等都有廣泛應用，對其分離機理的研究也逐步深入168, 169。近年來它們也成為CEC分離中具有良好應用前景的手性選擇試劑97, 170-174，其手性作用機理是：這些物質(zhì)具有多個能夠形成氫鍵的手性中心，還存在較多的芳香基團，此外其立體結構是一個大空腔結構，這些都是手性識別賴以存在的必備條件；大環(huán)抗生素能夠廣泛應用的另外一個重要因素即其溶解性好。它既具有疏水基團，又具有親水基團，因此易溶于緩沖溶液，微溶于有機溶劑，這對于其修飾到手性介質(zhì)形成CSP提供了方便。此外，它們在CEC 緩沖溶液中具有足夠的穩(wěn)定性。其中萬古

6、霉素是抗生素中手性選擇能力最強的抗生素之一97, 172-174，并且常被鍵合到硅膠顆粒表面然后填充到毛細管中用于CEC研究。填充柱雖然柱容量大，但是制備復雜，且在CEC分離中容易產(chǎn)生氣泡，因而它們的應用受到限制。Kornysova等人將鍵合萬古霉素的聚丙烯酰胺整體柱用于CEC手性藥物分離137, 175，但其手性識別能力卻不盡如人意，只有四種藥物能被拆分。而目前還沒見到過采用萬古霉素鍵合的硅膠整體柱用于CEC分離的報道。利用溶膠-凝膠（sol-gel）技術制備的硅膠整體柱具有滲透性好，表面積大，機械強度高，柱壽命長等點，并且易于改性。因此我們認為采用毛細管硅膠整體柱作為萬古霉素CSP的載體能

7、夠充分利用硅膠整體柱良好的骨架結構，進一步提高其手性選擇性及柱床穩(wěn)定性。在本章工作中，我們將萬古霉素化學鍵合到毛細管硅膠整體柱整體柱表面，并成功地將其用于CEC手性分離。2 材料與實驗2.1實驗部分2.1.1藥品與試劑試劑：正硅酸甲酯（TMOS）購自武漢大學化工廠（武漢）。聚乙二醇（PEG, Mn=10,000）購自Aldrich 公司（Milwaukee, WI, USA）。3縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷購自Sigma-Aldrich（Gillingham，Dorset，英國）；尿素購自華美生物工程公司；萬古霉素購于新昌制藥廠。甲醇及乙腈為色譜純；磷酸氫二鈉(分析純，上海新華化工廠)，磷酸二氫

8、鈉(分析純，沈陽試劑三廠)，甲醇(分析純)，乙腈(色譜純)，其它所用樣品均為分析純。所有實驗用水由Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA)超純水凈化裝置制備。安息香（benzoin），吲噠帕胺（indapamide）， 托格爾堿（Trgers base），吡喹酮（praziquantel），阿普洛爾（alprenolol）,阿替洛爾（atenolol），美托洛爾（metoprolol），特布他林（terbutaline），吲哚洛爾（pindolol），普萘洛爾（propranolol），華法令（warfarin）和酮基布洛芬（ketoprofen）購自Sigm

9、a公司（St. Louis, MO, 美國）；聯(lián)苯類化合物DDB和DDBA由劉月啟博士提供；四氫巴馬亭（tetrahydropalmatine），雷諾嗪（ranolazine），羥嗪（hydroxyzine）由中國生物樣品檢定所提供。設備：Waters 510液相色譜泵(Waters公司，USA)用于沖洗毛細管柱。恒溫水浴鍋（龍口市科學儀器公司，中國）用于加熱毛細管。氣相色譜儀(依利特公司，大連)用于加熱毛細管。顯微鏡 XSP-16A用于觀察毛細管柱。流動相為磷酸鹽緩沖溶液-乙腈。所有溶液均用超純水配制，用0.45 m濾膜過濾。材料:毛細管為50mm I.D.375mm O.D.熔融石英毛細管

10、，購于河北永年光導纖維廠。2.1.2 毛細管內(nèi)壁的預處理首先用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗石英毛細管30 min，然后用去離子水沖洗10min；接著用0.1 mol/L HCl溶液沖洗毛細管2 h，再用去離子水沖至流出液為中性；最后用甲醇沖洗10 min，并用氮氣吹干。圖2.1 對映體化合物的結構式Fig 2.1 Structures of the tested enantiomers2.1.3 毛細管硅膠整體柱的制備毛細管硅膠整體柱的制備參考文獻176的方法。具體過程是：首先將0.88克PEG、0.90克尿素溶于10 mL醋酸溶液（約0.01 mol/L）中，在冰浴中緩慢滴加4.4

11、mL正硅酸甲酯，攪拌45 min，可觀察到成均一透明的溶膠；然后將此溶膠注入預處理好的毛細管中，兩端用橡膠密封后放入40的水浴過夜；再將其置于120的氣相色譜柱溫箱中，使其中的尿素分解成氨，在氨的作用下完成整體柱中孔結構的構建，再依次用水、甲醇沖洗，在室溫下緩慢干燥；待徹底干燥后將整體柱置于氣相色譜柱溫箱中，以1/min 的速率從室溫升到110，保持90min，繼續(xù)以1/min的速率升到330保持900min，除去其中的有機成分。2.2毛細管硅膠整體柱表面鍵合萬古霉素鍵合反應過程如圖 2.2.1所示。先用0.1 mol/L HCl 溶液沖洗毛細管硅膠柱3 h，接著用去離子水沖至流出液為中性，再

12、用甲醇沖洗10 min，最后用氮氣吹干。量取20L的3縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷（3-GPTS），溶于200L的無水甲苯中，將此反應液裝入氣壓罐中，用氮氣壓力使其充滿整根硅膠整體柱，然后將此毛細管柱置于110的氣相色譜儀柱溫箱內(nèi)反應10 h，待反應完成后用甲醇沖洗30 min，通氮氣吹干。為了將環(huán)氧官能團進一步反應得到具有高反應活性的醛基，需要將其開環(huán)得到二醇，具體方法為：先用10 mM的HCl 溶液沖洗毛細管硅膠柱6 h，接著用去離子水沖至流出液為中性，然后將70 mM的高碘酸鈉溶液（溶劑為水/甲醇，4/1，v/v）充分浸潤柱床并于室溫下反應2h，反應完后用去離子水充分沖洗。至此，環(huán)氧轉化醛

13、基的過程已完成。將一定量的萬古霉素溶于50 mM的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）中，然后用注射器將此溶液注入表面已生成醛基的硅膠整體柱（長度為20 cm）中，兩端用橡膠塞密封，室溫反應6h。鍵合完成后，由于硅膠整體柱表面仍殘留大量的醛基，故進一步采用10 mM的硼氰化鈉溶液沖洗柱床2h，將殘留的醛基還原成羥基，然后用流動相充分平衡1h待CEC評價。圖2.2.1 毛細管硅膠整體柱鍵合萬古霉素的制備過程示意圖Fig 2.2.1 Schematic representation of preparation procedures of vancomycinderivatized silica mon

14、olithic column. (1) Open-tubular capillary; (2) silica monolith; (3) silanols on the surface of silica monolith; (4) glycidylation on the surface of silica monolith; (5) formation of aldehyde group on the surface of silica monolith; (6) formation of vancomycin immobilized silica monolith.在這里值得一提的是，用

15、CEC評價該固定相時發(fā)現(xiàn)被測試的對映體化合物的響應都很低，檢測靈敏度低不利于本實驗繼續(xù)進行。這是由于本法制備的鍵合萬古霉素硅膠整體柱的柱床表面存在大量的萬古霉素分子，而它是一種強紫外吸收的物質(zhì)，因此導致柱上紫外檢測時響應太低。而且硅膠基質(zhì)的整體柱在制作檢測窗口時不能采用灼燒的辦法將窗口的固定相除去。在本工作中，為了解決硅膠整體柱上檢測靈敏度低的問題，我們利用Teflon的接頭將16cm長的鍵合萬古霉素的硅膠柱與一段15cm長的空毛細管連接，然后將空毛細管有效長度處用刀片刮去毛細管外壁的聚酰亞胺涂層1-2 mm，制成電色譜柱檢測窗口(如圖2.2.2所示)。將毛細管柱裝入毛細管電泳儀的卡盒之后，按

16、分離要求切去兩端多余毛細管。Teflon tubingDetection window圖2.2.2毛細管柱檢測窗口示意圖Fig 2.2.2 Schematic representation of new prepared vancomycin monolith coupled with fused silica capillary2.3 電色譜實驗電色譜實驗在P/ACETM System MDQ (Beckman, Fullerton, CA, USA)上完成。檢測器為紫外二極管陣列檢測器（UV-PDA），色譜柱的總長為31 cm，有效長度為16 cm，通過一個Teflon的接頭與一段15cm

17、長的空管相連接，內(nèi)徑都是50m。實驗前先用流動相沖洗30 min，用電壓平衡時，在開始的10 min內(nèi)電壓緩慢地從0 V增加到10 kV，然后電壓穩(wěn)定在10 kV。選用丙酮為死時間標記物。采用電動進樣，進樣時間為1 s，進樣電壓為5 kV，檢測波長214 nm，操作電壓5-25 kV。實驗結果中的容量因子（k1，第一個流出的對映體），手性分離因子（），分離度（Rs）以及柱效（N1，plates/m）的計算公式如下：其中t1，t0分別為樣品第一個流出峰的保留時間和分離系統(tǒng)的死時間；w1，w2分別為兩個對映體峰的半峰寬；L為色譜柱長度（cm）3 結果與討論3.1整體柱的表征圖1是在內(nèi)徑為50 m毛

18、細管中制成硅膠整體柱橫截面的掃描電鏡圖。從圖中可以清楚看出硅膠整體柱具有均勻連續(xù)的網(wǎng)狀骨架結構，硅膠床層既具備大的貫穿孔（2m），提供硅膠整體柱的高滲透性；在骨架的表面還存在許多中孔，它是整體柱高比表面積的保證，而這是提高手性分離度的重要因素。此外還可以觀察到床層通過化學鍵鍵合牢牢的連接在毛細管內(nèi)壁上，這為整體柱的穩(wěn)定性提供了保證。(a)(b)圖 1 鍵合萬古霉素硅膠整體柱的電鏡掃描圖Fig 1 SEM photographs of monolithic silica inside a capillary at magnifications of (a) 1500 and (b) 5000.在

19、萬古霉素鍵合的硅膠整體柱的性能評價實驗中，首先考察了電壓對電流的影響，結果如圖2所示。在流動相為MeOH/ACN/HAc/TEA（80/20/0.1/0.1, v/v/v/v）的條件下，當電壓由1kV增大到20kV時，電流也隨之線性增大（相關系數(shù)為0.9990）。該結果表明在此電色譜條件下柱內(nèi)的焦耳熱可忽略不計，這為快速分離提供了保障。圖2 萬古霉素鍵合毛細管硅膠整體柱電流和分離電壓的關系Fig 2Dependence of applied voltage on the current. Experimental conditions: Experimental conditions: col

20、umn, a 16 cm 50 m ID monolithic silica column modified with 10 mg/mL vancomycin attached to a 15 cm 50 m ID empty fused-silica capillary via a Teflon-tubing union; mobile phase, MeOH/ACN/HAc/TEA (80/20/0.1/0.1, v/v/v/v)； applied voltage, 10 kV; injection, 5 kV 1 s.電滲流是評價一根電色譜柱的第一要素。制備的萬古霉素固定化硅膠整體柱在極

21、性有機流動相（MeOH/ACN/HAc/TEA, 80/20/0.1/0.1, v/v/v/v）的條件下，產(chǎn)生由陽極到陰極的電滲流，以丙酮作為電滲流標記物測得EOF達1.2310-4 cm2V-1s-1，在極性有機流動相的環(huán)境下該EOF可認為是較大的。連續(xù)五次進丙酮樣品考察整體柱的穩(wěn)定性，測得其保留時間的相對標準偏差（RSD）小于0.82，說明保留值重現(xiàn)性良好，萬古霉素硅膠整體柱具有可靠的穩(wěn)定性。另外，還對制備的整體柱在反相模式的流動相（含20乙腈的10 mM磷酸三乙胺緩沖液，pH6.5）條件下，測得其EOF大小為1.3810-4 cm2V-1s-1，連續(xù)五次測得的RSD為0.75，綜上所述，

22、我們制備的萬古霉素硅膠整體柱無論在極性有機模式還是反相模式下都能產(chǎn)生較高的電滲流，而且重現(xiàn)性良好，為該整體柱手性固定相能夠在CEC中進行評價提供了必要的前提。3.2 鍵合條件的優(yōu)化為了將萬古霉素固定在50 m內(nèi)徑的毛細管硅膠整體柱表面，首先在其表面先鍵合一層含環(huán)氧官能團的硅烷化試劑，然后將其酸化氧化成醛基，醛基可以和萬古霉素上的伯氨基發(fā)生還原反應，得到鍵合了萬古霉素的硅膠整體柱。為了獲得更好的穩(wěn)定性，重復性以及分離能力，我們對鍵合反應中萬古霉素的反應濃度進行了考察。分別采用5 mg/mL，10 mg/mL 和15 mg/mL的萬古霉素反應液和已衍生醛基的硅膠整體柱進行柱上反應，然后分別考察了在

23、所制備的電色譜柱上對映體化合物的拆分。圖2.6列出了propranolol和alprenolol分別在5 mg/mL，10 mg/mL和15 mg/mL萬古霉素反應液改性的電色譜柱上的分離圖。從圖中可以看出，對映體的保留時間和分離度都隨萬古霉素反應濃度的增大而增大，但是當反應濃度一再提高到15 mg/mL時，保留時間和分離度的變化甚微，說明此時萬古霉素的鍵合量已經(jīng)達到飽和。由于硅膠整體柱上的醛基位點也有限，一味提高萬古霉素的濃度來增大鍵合量反而浪費樣品量。綜上所述，利用還原胺化反應來固定萬古霉素時，反應濃度采用10 mg/mL即可。圖2.6 propranolol和alprenolol在不同電

24、色譜柱上的分離譜圖Fig 2.6 Electrochromatograms for separation of propranolol (a) and alprenolol (b) on different columns. Experimental conditions: column, 16 cm 50 m ID monolithic silica column modified with 5 mg/mL (1), 10 mg/mL (2) or 15 mg/mL (3) vancomycin solution attached to a 15 cm 50 m ID empty fused

25、-silica capillary via a Teflon-tubing union; applied voltage: 10 KV；injection, 5 kV 1 s;2.2.3 極性有機模式和反相模式拆分對映體極性有機流動相的首次應用是在HPLC的CD177和抗生素32的手性固定相上。在無水極性有機環(huán)境下，一些非手性選擇性的相互作用特別是疏水相互作用都能被大大減弱。因此，在這種模式下的手性選擇性往往比反相模式下的高，特別適用于有機聚合物基質(zhì)的手性固定相。極性有機流動相往往是以氫鍵作用較弱的乙腈為主要溶劑，另外輔以甲醇，三乙胺或醋酸為改進添加劑。據(jù)文獻報道，在大環(huán)抗生素的手性固定相上，

26、低乙腈高甲醇結合少量醋酸和三乙胺的流動相更有利于手性拆分173。另外，此種流動相和反相流動相相比會導致較低的電流，因此在CEC應用中能盡可能避免氣泡的產(chǎn)生，使得評價能夠順利進行。本實驗首先采用極性有機相模式考察萬古霉素鍵合的硅膠整體柱的手性拆分能力，所用流動相條件和結果等色譜數(shù)據(jù)列于表2.1。在所測試的八種對映體中，有六種為堿性藥物，它們是一類用于治療高血壓的受體阻滯劑。從表中可以看出制備的萬古霉素手性固定相具有較好的手性識別能力。六種堿性藥物在極性有機流動相條件下都能實現(xiàn)基線分離且達到了很高的柱效，最高可達217000塔板數(shù)/米。萬古霉素鍵合的硅膠整體柱分離-阻滯劑的典型電色譜圖如圖2.7所

27、示，它們均能夠被基線分離，而且分析速度快，6 min之內(nèi)全部完成分離。該六種堿性藥物的pKa都大于9，在現(xiàn)有流動相下都帶正電荷，它們的電泳方向和電滲流方向是一致的，因此它們的出峰都在死時間之前。這說明在該整體柱上的手性分離中，電泳機理也起著一定的作用。傳統(tǒng)的HPLC中，萬古霉素手性固定相拆分-阻滯劑也很常見150, 178，但是它存在分離時間過長，拖尾嚴重以及系統(tǒng)平衡時間過長等缺陷。而在本實驗中，六個-阻滯劑都能獲得很好的拆分，并且分離時間短，在6min之內(nèi)全部出峰，在流動相中添加了三乙胺之后拖尾現(xiàn)象也不明顯。表1 對映體化合物在極性有機相和反相模式下拆分的電色譜數(shù)據(jù)Table 1 Racem

28、ic coumpounds separated in the non-aqueous polar organic and aqueous mobile phases. CompoundsMobile phaset1(min)t2(min)N1(plates/m)N2(plates/m)RsPropranolola4.114.31116 300111 4002.01Pindolola4.274.43208 700217 4001.85Metoprolola4.014.17145 000106 9001.35Atenolola5.565.85107 200 63 5001.31Terbutalin

29、ea4.664.87 83 300 53 4001.14Alprenolola3.303.45 58 750 52 0001.08Thalidomideb8.9810.22 48 500 49 6502.93Benzoinb10.3810.58129 300 82 2000.57Experimental conditions: column, a 16 cm 50 m ID monolithic silica column modified with 10 mg/mL vancomycin attached to a 15 cm 50 m ID empty fused-silica capil

30、lary via a Teflon-tubing union; mobile phase, (a) MeOH/ACN/HAc/TEA (80/20/0.1/0.1, v/v/v/v); (b) 10 mM triethylamine phosphate buffer containing 20% ACN at pH 6.5; applied voltage, 10 kV; injection, 5 kV 1 s; .兩個中性化合物安息香和沙立度胺的拆分是在反相流動相（含20乙腈的10mM磷酸三乙胺緩沖溶液，pH 6.5）下實現(xiàn)。沙立度胺的分離度較高（Rs2.93），而安息香獲得部分分離（Rs0

31、.57）。同時也考察了反相模式下-阻滯劑的分離，但是其分離柱效較低，且拖尾嚴重，拆分未能實現(xiàn)。說明該手性固定相在極性有機環(huán)境下更有優(yōu)勢，這可能是由于極性有機流動相對消除非特異性相互作用有著重要作用。圖3 對映體化合物在極性有機相和反相模式下的電色譜拆分譜圖Fig 3 Electrochromatograms for separations of enantiomers under non-aqueous and aqueous mobile phases. Experimental conditions were the same as described in Table 2.1.參照2.1

32、.4節(jié)的鍵合萬古霉素的方法，我們也進一步考察了鍵合萬古霉素的聚(GMA-co-EDMA)毛細管電色譜整體柱在CEC手性分離中的效果，但是無論在極性有機模式還是反相模式-阻滯劑和沙立度胺都未能拆分?？赡茉驗橛袡C聚合物整體柱的比表面積小不利于手性選擇試劑鍵合量的提高，且有機基質(zhì)的強疏水性導致非手性特異性作用增大，而手性相互作用減弱136。而硅膠整體柱具有高比表面積，高柱效以及非特異性作用弱的特點，因此選擇硅膠整體柱作為萬古霉素手性固定相的基質(zhì)優(yōu)勢明顯，這與文獻114報道的極為吻合。組合化學的蓬勃發(fā)展使得人們可以在短時間內(nèi)制備出大量對映體化合物，這對手性分離提出了更高的要求，即速度快，制備容量大。

33、而CEC法的特點即分離速度快，只需提高流動相線速度即提高分離電壓便能大大縮短分離時間，但在常規(guī)的使用顆粒型填料的HPLC中，一味提高泵壓會導致柱壓的增大和峰展寬，反而降低了手性分離的效果。毛細管硅膠整體柱即能避免上述問題?；诠枘z整體柱良好的通透性，柱壓力不再是一個很大的限制；且整體柱有別于填充柱的一大特點就是其具有良好的動力學性能，即在高的線速度下仍能保持較高的柱效，為實現(xiàn)快速分離中仍能保持分離效果提供了良好的保證。圖4 propranolol的快速分離電色譜圖Fig 4 Electrochromatogram for fast separation of propranolol. Expe

34、rimental conditions: applied voltage, 20 kV; other conditions were the same as described in Table 2.1.圖4是propranolol在高電壓下進行快速分離的色譜圖，分離時間只需2.5min，且柱效也很高。這種高柱效一方面是由于EOF的塞狀流型，另外可能是由于硅膠整體柱良好的動力學性能使得對流傳質(zhì)加快，這兩方面都有助于降低峰展寬從而提高柱效。所制備的萬古霉素固定相的評價主要是在極性有機模式下進行的，因此對這種流動相中的溶劑的組成對分離的影響進行了考察，包括甲醇含量以及酸堿添加劑的含量對對映體保留時

35、間，分離度以及柱效的影響。由于propranolol能夠成功的基線分離并且具有較高的柱效，因此選擇它作為標準樣品來考察各種影響，當然考察的結果在其他一些手性樣品的拆分中也有體現(xiàn)。圖5是流動相中甲醇含量對分離的影響結果圖。隨著甲醇含量的增加，propranolol的分離度和柱效隨之增加。同時，保留時間先減小后增加，但變化不明顯。當流動相中甲醇含量占到80時，分離度達到最大值。這可能是由于流動相中添加較多甲醇時，一些非特異性的氫鍵相互作用能夠被削弱，從而提高手性分離度。該結果說明流動相中有機溶劑的比例（MeOH/ACN）對這種萬古霉素鍵合的硅膠整體柱的手性拆分能力及柱效有著重要的影響，并且當流動相

36、中含甲醇/乙腈（80/20，v/v）時，該手性固定相的分離度及柱效達到最佳值。圖 5 流動相甲醇含量對消旋體propranolol在萬古霉素鍵合硅膠整體柱上分離的影響Fig 5 Effect of MeOH concentration in the polar organic mobile phase on the (a) resolution and efficiency of propranolol and (b) retention time of the propranolol first-eluting enantiomer. All other experimental condi

37、tions were the same as described in Table 2.1.同時，也對極性有機流動相中的酸堿添加劑的比例進行了考察。保持有機溶劑比例（MeOH/ACN，80/20，v/v）不變，改變醋酸/三乙胺（HAC/TEA）的比例，分離結果如圖6所示。從圖中可以看出，酸堿比例對該電色譜柱的手性分離影響不是很大。圖6 HAc/TEA比例對propranolol分離的影響Fig 6 Influence of HAc/TEA ratio in non-aqueous mobile phas on the (a) resolution and efficiency of propr

38、anolol and (b) retention time of the propranolol first-eluting enantiomer. All other experimental conditions were the same as described in Table 2.1.重復性和穩(wěn)定性是評價一根色譜柱的重要指標?？疾炝酥苽涞娜f古霉素硅膠整體柱的重復性以及不同批次間的重復性。分別采用表2.1中有機極性流動相和反相流動相，以propranolol和thalidomide為標準樣品考察它們的色譜性能重復性。連續(xù)進樣五次，propranolol的保留時間，柱效和分離度的RSD

39、分別為0.78，1.1和2.3%，而thalidomide為0.72，1.5和2.8%。在制備的五根整體柱之間，測得propranolol和thalidomide的分離度，柱效和保留時間的RSD分別為4.3%，7.2%，9.6%和5.2%，6.1%，10.5%。說明這種整體柱的制備方法具有良好的重現(xiàn)性。我們還在極性有機和反相模式下考察了該柱的穩(wěn)定性，連續(xù)進樣五十次以上，沒有觀察到明顯的分離度或柱效下降，也沒有觀察到柱床有明顯的收縮或溶漲現(xiàn)象，表明電色譜柱在所采用的流動相模式下具備良好的穩(wěn)定性和機械強度，這再次體現(xiàn)硅膠整體柱作為CSP載體的優(yōu)勢。4 本章小結制備了萬古霉素鍵合的毛細管硅膠整體柱并

40、將其用于對映體化合物的電色譜分離。優(yōu)化條件下制備的整體柱在極性有機和反相流動相下都具有較高的電滲流，且具有較高的手性識別能力和柱效，8種對映體化合物在柱上得到了分離，其中絕大部分達到基線分離。采用高線速度實現(xiàn)了對propranolol的快速手性分離。通過對流動相組成的考察，發(fā)現(xiàn)流動相有機溶劑的比例對手性分離有著重要影響。該手性固定相的色譜重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均讓人滿意。5 參考文獻1 Lmmerhofer, M., Svec, F., Frchet, J. M. J., Lindner, W.,Trends Anal. Chem. 2000, 19, 676698.2 Wang, Y. C., Ze

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