生物醫(yī)學光子學_scy-3_共聚焦激光掃描(熒光)顯微鏡20151125

1、共聚焦顯微技術(shù)共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mm光學顯微鏡分辨率：光學顯微鏡分辨率：0.25m25mm共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18m mm電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率：0.2nm共聚焦激光掃描（熒光）顯微鏡共聚焦激光掃描（熒光）顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世紀80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品，是當今世界最先進的細胞生物學分析儀器。激光共聚焦顯微鏡利用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦的原理和裝置，

2、以及通過針孔的選擇和PMT的收集，并帶有一套對其所觀察到的對象進行數(shù)字圖像分析處理的系統(tǒng)軟件。與傳統(tǒng)光學顯微鏡相比，它具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重熒光的同時觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點。所以它問世以來在生物學的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應用。 ObjectiveArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserEmission PinholeExcitation PinholePMTEmissionFilterExcitation FilterConfocal PrincipleConfo

3、cal Principle照明針孔照明針孔探測針孔探測針孔二色鏡或分光鏡二色鏡或分光鏡激光光源激光光源共聚焦顯微鏡的優(yōu)點減少由于光散射產(chǎn)生的圖像模糊增加有效分辨率提高信噪比厚標本的清楚細查Z軸掃描可以實現(xiàn)數(shù)字放大倍率的調(diào)節(jié)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片conventional

4、confocal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別3. 增加側(cè)向分辨率增加側(cè)向分辨率d2alconventionconfocaldd激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別4. 由于點對點掃描去除了雜散光的影響由于點對點掃描去除了雜散光的影響激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點:1.點照明點照明2.具有照明具有照明pinhole和探測和探測pinhole3.照明照明pinhole和探測和探測pinh

5、ole共軛共軛(共焦共焦), 共焦點共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)具有掃描系統(tǒng) 逐點掃描成像逐點掃描成像 5.具有多個（四個）具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個熒光通道，可同時探測多個被標記物被標記物 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)技術(shù)指標（技術(shù)指標（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61 /NA （0.25 m mm ) Confocal: Rxy=0.4 /NA（0.18 m mm )2. 樣品的最大厚

6、度樣品的最大厚度: 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、物鏡的工作距離、物鏡的工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動范圍軸的最大移動范圍(166m mm、Z-wide)3. 樣品的最小光切厚度樣品的最小光切厚度: (載物臺最小移動距離為載物臺最小移動距離為40nm） 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、針孔大小、針孔大小 Z軸的最小移動步距軸的最小移動步距: 40nm Z軸的分辨率軸的分辨率: 0.35 m mm 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4. 激光器激光器 Ar激光器激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreN

7、e : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器激光器(UV): 361nm 激光器的特點激光器的特點: 1) 方向性好方向性好: 激光基本延直線傳播激光基本延直線傳播 2) 單色性好單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度高亮度: 激光方向性好激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度其在空間上的能量分布是高度 集中的。集中的。 4) 偏振性偏振性: 激光為平面偏振光激光為平面偏振光, 光纖耦合光纖耦合激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5. 四個熒光通道四個熒光通道, 一個透射光通道一個透射光通道 即除了可同時采集多標記熒光圖像外即除了可同時采集多標記熒光圖像外還可以同時采

8、集透射光圖像還可以同時采集透射光圖像,但透射光但透射光圖像為圖像為非共焦圖像非共焦圖像。 是共聚焦顯微鏡最基本的功能 可來自單標和多標樣本 往往采用固定后的組織或細胞標本；活細胞也可進行特定時間點的單張光學切片1 單張光學切片功能vestigial apterousCiD (cyanine 5). Not just the structure of a single cell, the relationship of adjacent cells at different plane can also be viewed clearly like below: 可用于活細胞或固定細胞的觀察、分

9、析2 2 細胞顯像細胞顯像CriteriaFixed CellsLiving CellsLimits of illuminationFading of fluorophorePhototoxicity and fading of dyeAntifade reagentPhenylenediamine, etc.NONE!MountantGlycerol (n = 1.51)Water (n = 1.33)Highest NA lens1.41.2Time per imageUnlimitedLimited by speed of phenomenon;light sensitivity of

10、specimenSignal averagingYesNoResolutionWave opticsPhoton statisticsHertel L.A., Stricker S.A. and Loker E.S. 2000. Calcium dynamics of hemocytes of the gastropod Biomphalaria glabrata: effects of digenetic trematodes and selected bioactive compounds. Invertebrate Biology, v. 119(#1): 27-37. 腹足綱一種淡水螺Biomphalaria gla