電子商務(wù)在現(xiàn)在食品物流中的應(yīng)用

1、編號： 江蘇大學(xué)學(xué)生科研項目申請書課題名： 核-殼型生物功能化磁性納米載體可控化構(gòu)建的新方法 申請者： 胡坤雅 所在學(xué)院： 食品與生物工程學(xué)院 年級、專業(yè)： 食品1102 指導(dǎo)老師： 孫俊 申請日期： 2013年4月20日 項目類別（在相應(yīng)的類別上打）A、自然科學(xué)類論文B、發(fā)明制作類C、社會科學(xué)類論文 江蘇大學(xué)學(xué)生科研立項管理委員會制說 明l、申報者應(yīng)在認真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細填寫。2、表內(nèi)項目填寫時一律打印，此申報書可復(fù)制。3、編號由學(xué)生科研立項管理委員會統(tǒng)一填寫。 4、申報作品有關(guān)材料請以打印件附于申請書后，申請書為A3紙雙面復(fù)印中縫裝訂，一份，（活頁部分單獨裝訂），由所在單位審

2、查簽署意見、加蓋公章后在規(guī)定時間內(nèi)統(tǒng)一報送校團委，團委不接受個人申報。 5、在前幾批大學(xué)生科研課題立項中立項，但沒有結(jié)題的同學(xué)，不得申報此次大學(xué)生科研課題。6、第十一批申報的“挑戰(zhàn)杯”重點項目不適用本申報書。7、有關(guān)其他事宜請向校團委咨詢。8、聯(lián)系人：杜明拴（88780040）申請者姓 名胡坤雅性 別女出生年月1993/8/23政治面貌共青團員所在學(xué)院食品與生物工程專業(yè)年級食品1102學(xué) 歷本科在讀聯(lián)系電話其他聯(lián)系方法無申請者曾承擔(dān)科研項目及完成情況課 題 名 稱批準(zhǔn)時間完成情況申請者本人近幾年以來的主要研究成果（注明刊物的年、期或出版社、出版日期）無合作者情況姓 名性別年齡學(xué) 歷學(xué) 院專 業(yè)

3、 班 級翁龍梅女20本科在讀食品學(xué)院11級食品科學(xué)與工程劉孟男21本科在讀食品學(xué)院11級食品科學(xué)與工程申請者所在學(xué)院分管科研的領(lǐng)導(dǎo)對該項目的基本評價 簽章： 年 月 日學(xué)院意見 簽章： 年 月 日編號： 江蘇大學(xué)學(xué)生科研項目申請書（活頁） 課題名稱： 核-殼型生物功能化磁性納米載體可控化構(gòu)建的新方法 申請年度： 2013年 江蘇大學(xué)學(xué)生科研立項管理委員會制說 明l、申報者應(yīng)在認真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細填寫。2、表內(nèi)項目填寫時一律打印，此申報書可復(fù)制。3、編號由學(xué)生科研立項管理委員會統(tǒng)一填寫。 4、申報作品有關(guān)材料請以打印件附于申請書后，申請書（活頁）為A3紙雙面復(fù)印中縫裝訂，一式三份和

4、申請書一起由所在單位在規(guī)定時間內(nèi)統(tǒng)一報送校團委，團委不接受個人申報。 5、在活頁中，一律不得出現(xiàn)申報者和指導(dǎo)教師的信息，否則取消申報資格。6、第十一批申報的“挑戰(zhàn)杯”重點項目不適用本申報書（活頁）。7、有關(guān)其他事宜請向校團委咨詢。8、聯(lián)系人：杜明拴（88780040） 研究課題名 稱核-殼型生物功能化磁性納米載體可控化構(gòu)建的新方法所屬類別（ A ）、A、自然科學(xué)類論文B、發(fā)明制作C、社會科學(xué)類論文起止時間成果形式科研論文申請經(jīng)費總 額1100其它經(jīng)費來源無1、項目的立項依據(jù)1.1 研究意義磁性納米材料由于其較小的粒徑，較大的比表面積而具有特殊的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)以及磁響應(yīng)性

5、（見圖1），使其發(fā)展、壯大成為當(dāng)今最富有發(fā)展前景的新型納米材料，已在生物醫(yī)藥、食品工業(yè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用1- 4，其中在蛋白質(zhì)領(lǐng)域（包括蛋白質(zhì)分離純化和酶固定化）的應(yīng)用逐漸成為當(dāng)前研究的熱門方向5-8。然而蘊含奇妙生物活性的蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，在與載體作用過程中，其空間構(gòu)象極易受到影響，一旦空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其生物學(xué)活性將會隨之降低或完全喪失，因此，保持吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定具有重要的科學(xué)研究意義。圖1 磁性納米材料在外界磁場作用下的磁響應(yīng)特性磁性納米材料在蛋白質(zhì)領(lǐng)域應(yīng)用的研究思路一般均是先合成一種功能性的磁性載體材料，然后探究其可應(yīng)用范圍，如此相對被動的研究思路，大大限制了磁性納

6、米材料的應(yīng)用潛能。因此，改變以往研究思路，從新的視角出發(fā)，揭示蛋白質(zhì)構(gòu)象變化規(guī)律，掌握磁性納米載體材料與蛋白質(zhì)的相互作用機理，將為設(shè)計與開發(fā)高品質(zhì)磁性納米載體材料及其在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的高效應(yīng)用提供新的思路與新的科學(xué)依據(jù)。目前，研究蛋白質(zhì)在與載體作用過程中的蛋白質(zhì)吸附行為及構(gòu)象變化依然是個挑戰(zhàn)，主要體現(xiàn)在：（1）特定形貌和粒徑的磁性納米材料的可控化構(gòu)建；（2）吸附過程中，蛋白質(zhì)構(gòu)象變化影響因素的確定；（3）蛋白質(zhì)在與載體作用過程中其構(gòu)象分析技術(shù)及分析方法的建立；（4）載體與蛋白質(zhì)的相互作用機理也尚待確定?；谏鲜龃嬖趩栴}，本課題的研究將為這一科學(xué)問題的解決提供必要的理論基礎(chǔ)，具有重要的理論研究價值。

7、1.2 國內(nèi)外研究進展研究磁性納米載體材料與蛋白質(zhì)相互作用機理的關(guān)鍵科學(xué)問題包括以下幾點：（1）功能性磁性納米載體材料的構(gòu)建磁性納米材料種類多樣，其中Fe3O4由于其制備方法簡單、易修飾、且對人體無毒副作用而受到廣泛青睞。然而Fe3O4磁性納米材料在空氣中易于氧化、團聚，化學(xué)穩(wěn)定性較差，限制了其應(yīng)用。但是Fe3O4磁性納米材料表面分布著豐富的羥基，可非常容易通過多種方式對其表面進行化學(xué)改性，來改善其在溶液中的分散狀態(tài)、生物相容性和功能性等。常用于修飾Fe3O4的殼體材料主要有天然生物高分子材料、化學(xué)合成高分子材料以及無機物材料9,10。其中天然生物高分子材料由于其良好的生物可降解性、生物相容性

8、及對人體無毒副作用，而成為首要選擇。本課題選擇殼聚糖及其衍生物作為表面殼體材料，原因主要有以下兩點：（1）殼聚糖是自然界中唯一的堿性多糖，具有可生物降解、生物相容性及無毒副作用等優(yōu)良特性11-13；（2）殼聚糖分子鏈上分布著豐富的氨基和羥基，非常容易進行化學(xué)改性。近年來，改性的殼聚糖衍生物在各個領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注，圍繞應(yīng)用所進行的殼聚糖改性的研究也取得了較大進展，各種改性方法也較為成熟14,15。因此，在前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成具有特定化學(xué)組成的殼聚糖衍生物以用于磁性納米載體修飾，賦予磁性載體材料穩(wěn)定性、生物兼容性以及功能性，對拓寬殼聚糖的應(yīng)用潛能具有重要的研究價值，引起了學(xué)者們的普

9、遍重視。此外，在實際應(yīng)用過程中，磁性納米載體材料的應(yīng)用性能與其自身的尺寸、形狀、分散程度、表面化學(xué)組成等因素有關(guān)，因此如何獲得單分散、尺寸可控、穩(wěn)定性好、形狀規(guī)整的功能性磁性納米材料就成為人們不斷追求的目標(biāo)。磁性納米載體的化學(xué)合成方法較多，其中化學(xué)共沉淀法由于其操作簡單、反應(yīng)易于控制，易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，而成為目前最為關(guān)注的制備方法。然而采用傳統(tǒng)的化學(xué)共沉淀法制備磁性納米載體時，其機械攪拌的方式使所得顆粒粒徑難以控制，粒徑分布范圍較寬，因此，輔以現(xiàn)代高新技術(shù)，對傳統(tǒng)的化學(xué)共沉淀法進行改進，揚長避短，成為目前磁性納米載體材料構(gòu)建領(lǐng)域的研究熱點。（2）蛋白質(zhì)吸附行為及構(gòu)象變化研究蛋白質(zhì)作為一種重要

10、的生物活性物質(zhì)，具有較強的表面活性，很容易在固相載體表面吸附，在吸附過程中，蛋白質(zhì)與生物載體之間存在的共價、疏水、靜電等相互作用力必然會影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。然而，之前的研究重點大都以提高載體的吸附容量為單一考核指標(biāo)，忽略了對蛋白質(zhì)構(gòu)象的考慮，而往往對于具有生物活性的蛋白質(zhì)，其活性保留則是重中之重。因此，在提高載體對蛋白質(zhì)吸附容量的同時以保證蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定成為研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，近年來學(xué)者們逐步提高了對吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性的關(guān)注。磁性納米載體在與蛋白質(zhì)作用過程中，影響載體吸附容量及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的因素一般包括以下幾種：（1）蛋白質(zhì)種類；（2）載體粒徑及形貌；（3）載體表面化學(xué)組成及含量；

11、（4）反應(yīng)溶液的性質(zhì)。然而，上述因素的內(nèi)在影響規(guī)律卻有待確定。其中就生物載體的表面結(jié)構(gòu)（表面化學(xué)組成和物理結(jié)構(gòu)）對載體吸附容量和蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響研究甚少。2004年，Bengt-Harald Jonsson等人16研究了粒徑分別為6 nm、9 nm 和15 nm 的SiO2 顆粒對脫水酶構(gòu)象的影響，研究表明：粒徑較小的SiO2 顆粒可較好地保持脫水酶的構(gòu)象穩(wěn)定性。之后也有諸多學(xué)者效仿就載體的粒徑大小對吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響進行了探討，但是均較為片面，缺少對載體表面化學(xué)組成影響的關(guān)注。隨著納米載體材料在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用，人們逐漸意識到載體表面化學(xué)組成對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象的重要性，2009年，克萊

12、姆森大學(xué)的Robert A. Latour等人17研究了表面功能基團分別為氟甲基、甲基、氨基、羧基和羥基的載體對纖維蛋白原和血清白蛋白的吸附，研究發(fā)現(xiàn)：蛋白質(zhì)與載體之間的相互作用力隨著載體表面疏水性的增強而增強，同時載體對蛋白質(zhì)吸附容量以及蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化也相應(yīng)增加。目前，采用不同的功能基團對載體表面進行化學(xué)改性引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注，然而，綜合評價載體的物理結(jié)構(gòu)及表面化學(xué)組成對載體特性及其蛋白質(zhì)吸附容量及構(gòu)象的影響還尚缺乏系統(tǒng)研究。因此，伴隨著磁性納米技術(shù)的飛速發(fā)展，借鑒前人研究思路，探究具有不同表面化學(xué)組成和物理結(jié)構(gòu)的磁性納米載體對蛋白質(zhì)吸附行為和構(gòu)象的影響必將成為目前研究的重點和難點。(

13、 3 ) 載體與蛋白質(zhì)相互作用機理研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性與其分子構(gòu)象密切相關(guān)，然而具有較為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，由于固相載體材料的存在，使得載體材料上的蛋白質(zhì)構(gòu)象研究受到很多限制，許多問題有待解決。而探究磁性納米載體與蛋白質(zhì)相互作用機理，必將要掌握作用過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化規(guī)律,因此，精確分析在吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，掌握蛋白質(zhì)構(gòu)象分析的手段和方法，成為研究載體與蛋白質(zhì)相互作用機理的關(guān)鍵技術(shù)之一，也是最困難和極具挑戰(zhàn)性的研究方向。目前，光譜檢測技術(shù)是分析蛋白質(zhì)構(gòu)象最常用也是最有效的方法18-20，然而由于單一的檢測技術(shù)在蛋白質(zhì)構(gòu)象的表征應(yīng)用中尚存在一定的缺點，因此，伴隨現(xiàn)代分析手段的不斷創(chuàng)新

14、和組合，將幾種光譜技術(shù)進行有效結(jié)合，取長補短，才能更好、更精確地分析蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。綜上，本課題針對上述關(guān)鍵科學(xué)難題，在前期研究的基礎(chǔ)上，擬選擇殼聚糖及其衍生物作為表面殼體材料，建立一種超聲輔助化學(xué)共沉淀法合成核殼型磁性納米載體的新方法；進而以牛血清白蛋白（BSA）和溶菌酶（Lyz）作為模型蛋白質(zhì)，基于分子水平，探索蛋白質(zhì)在與磁性納米載體作用過程中構(gòu)象變化的有效分析技術(shù)與分析方法，系統(tǒng)研究磁性納米載體與蛋白質(zhì)的相互作用機理，為設(shè)計與開發(fā)新型生物功能化磁性納米載體材料及其在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供新思路與新的科學(xué)依據(jù)。參考文獻1 Liu, G., Wu, H. X., Zheng, H. R.

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23、0-1313.14 馬貴平. 殼聚糖的化學(xué)改性及其作為生物醫(yī)用材料的制備和性能研究D:博士學(xué)位論文. 北京：北京化工大學(xué)，2009. 15 余敬謀. 兩種疏水改性乙二醇殼聚糖殼聚糖自聚集納米粒在藥物傳遞系統(tǒng)中的應(yīng)用研究D:博士學(xué)位論文. 杭州：浙江大學(xué)，2009. 16 Lundqvist, M., Sethson, I., Jonsson, B. H. Protein adsorption onto silica nanoparticles: Conformational changes depend on the particles' curvature and the prote

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27、try, 2006, 7: 1230-1237.1.3項目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)和擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。1.3.1 研究內(nèi)容：(1) 兩親性殼聚糖衍生物的化學(xué)合成及表征擬以羧甲基殼聚糖為研究對象，通過西弗堿還原法，制備N辛基羧甲基殼聚糖，N十二烷基羧甲基殼聚糖，N十六烷基羧甲基殼聚糖；測試三種殼聚糖衍生物的烷基取代度，并進行殼聚糖衍生物的結(jié)構(gòu)表征、溶解性及熱穩(wěn)定性測試。(2) 單分散、核殼型功能性磁性納米載體的可控構(gòu)建分別以殼聚糖、羧甲基殼聚糖及上述三種兩親性殼聚糖衍生物為表面殼體材料，建立超聲輔助化學(xué)共沉淀法制備核殼型磁性納米載體的新方法；之后對所制備的磁性納米載體的溶液分散性、熱穩(wěn)定性、pH

28、穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性進行測定，并對其表面化學(xué)組成成分進行定性、定量分析。(3) 功能性磁性納米載體與蛋白質(zhì)相互作用機理研究 研究上述功能化磁性納米載體對模型蛋白質(zhì)（BSA和Lyz）的吸附行為，探索具有不同表面化學(xué)組成和物理結(jié)構(gòu)的磁性納米載體對兩種蛋白質(zhì)的固載量和吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。采用多光譜技術(shù)動態(tài)分析蛋白質(zhì)與磁性納米載體之間的相互作用力以及蛋白質(zhì)構(gòu)象變化規(guī)律，進一步闡明磁性納米載體與蛋白質(zhì)的相互作用機理。 (4) 磁性納米載體在蛋白質(zhì)領(lǐng)域應(yīng)用平臺的初步構(gòu)建以胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶為例，依據(jù)載體與蛋白質(zhì)相互作用機理，選擇最佳磁性納米載體以用于上述蛋白酶的吸附行為研究，對其吸附、

29、解吸附過程中的構(gòu)象穩(wěn)定性及其酶學(xué)特性進行深入分析，以驗證上述機理的準(zhǔn)確性；并為磁性納米載體在蛋白質(zhì)領(lǐng)域應(yīng)用平臺的初步構(gòu)建提供理論科學(xué)依據(jù)，也為后續(xù)應(yīng)用平臺的完善奠定前期理論基礎(chǔ)。研究目標(biāo)：(1) 解決傳統(tǒng)化學(xué)共沉淀法所得磁性載體粒徑難以控制，粒徑分布范圍較寬的缺陷，建立一種超聲輔助化學(xué)共沉淀法構(gòu)建粒徑大小均一、單分散、功能化磁性納米載體的新方法，以期為高品質(zhì)磁性納米載體的構(gòu)建提供新途徑，同時豐富磁性納米載體制備方法的基礎(chǔ)理論研究內(nèi)容。(2) 研究生物功能化磁性納米載體與蛋白質(zhì)相互作用的影響因素，揭示載體對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響規(guī)律，闡明載體與蛋白質(zhì)的相互作用機理，以期為高品質(zhì)磁性納米載體的設(shè)計開

30、發(fā)及其在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的高效應(yīng)用提供新思路和新的科學(xué)依據(jù)，并初步構(gòu)建磁性納米載體在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用平臺。 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題： (1) 構(gòu)建具有不同表面化學(xué)組成和物理結(jié)構(gòu)的磁性納米載體是本課題首要解決的問題，為此需要對載體進行表面化學(xué)改性，本課題也將從這一視角來探索超聲輔助化學(xué)共沉淀法實現(xiàn)核-殼型生物功能化磁性納米載體可控化構(gòu)建的新方法。(2) 通過分析磁性納米載體對蛋白質(zhì)吸附容量和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響，闡明磁性納米載體與蛋白質(zhì)的相互作用機理，是貫穿本課題的關(guān)鍵問題之一。包括兩部分內(nèi)容，一部分是揭示載體對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響規(guī)律，確立關(guān)鍵控制因素；另一部分是建立多光譜技術(shù)動態(tài)分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的

31、分析技術(shù)及分析方法，以及對圖譜進行數(shù)據(jù)分析，包括將圖譜信息轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)信息、選擇數(shù)據(jù)處理方法、分析數(shù)據(jù)，從中探究載體與蛋白質(zhì)相互作用機理。 2、擬采取的研究方案及可行性分析（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實驗手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明）。2.1 技術(shù)路線本課題的技術(shù)路線見圖2。圖 2 本課題技術(shù)路線示意圖2.2研究方案本課題的化學(xué)反應(yīng)示意圖見圖3。圖3 本課題化學(xué)反應(yīng)示意圖(1) 兩親性殼聚糖衍生物的化學(xué)合成及表征Ø 以羧甲基殼聚糖為研究對象，采用離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)，通過西弗堿還原法，制備N辛基羧甲基殼聚糖，N十二烷基羧甲基殼聚糖，N十六烷基羧甲基殼聚糖；Ø 采用紅外光譜（FTIR）和

32、核磁共振（NMR）技術(shù)對殼聚糖衍生物的結(jié)構(gòu)進行表征分析；Ø 分析殼聚糖衍生物的溶解性質(zhì)，及熱穩(wěn)定性。(2) 單分散、核殼型磁性納米載體的可控制備新方法的建立Ø 以聚乙二醇作為分散劑，分別以殼聚糖、羧甲基殼聚糖、N辛基羧甲基殼聚糖，N十二烷基羧甲基殼聚糖，N十六烷基羧甲基殼聚糖為表面修飾材料，采用超聲波輔助的化學(xué)共沉淀法實現(xiàn)對磁性納米載體的可控制備，重點考察總鐵離子濃度，F(xiàn)e (II)與Fe (III)摩爾比，超聲波頻率、超聲波作用時間、反應(yīng)溫度和殼體材料加入比例對磁性納米載體粒徑和分散性的影響； Ø 采用FTIR技術(shù)分析磁性納米載體表面的特定官能團； Ø

33、 通過高分辨率透射電鏡（TEM）、振動樣品磁強計（VSM）、Zeta粒徑電位測定儀分析磁性納米載體的形貌、粒徑大小、粒徑分布、磁強度以及表面電位；Ø 測定磁性納米載體在水溶液中的分散性及儲藏穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等指標(biāo)；Ø 采用熱重分析儀（TGA）技術(shù)分析磁性納米載體表面生物多糖殼體材料所占整個載體的比重。(3) 磁性納米載體對模型蛋白質(zhì)吸附特性的研究Ø 選擇BSA和Lyz作為模型蛋白質(zhì)，重點考察BSA和Lyz有效作用濃度、磁性納米載體粒徑大小、反應(yīng)溶液的pH值和離子強度對于具有不同疏水性磁性納米載體對蛋白質(zhì)固載量的影響；確定磁性納米載體表面活性位點達到飽和

34、時的化學(xué)反應(yīng)條件；Ø 選擇對蛋白質(zhì)固載量最大且具有特定表面結(jié)構(gòu)的載體，之后采用超聲輔助化學(xué)共沉淀法制備一系列具有相同化學(xué)組成、不同厚度的磁性納米載體，進一步研究不同厚度的特定生物基團對載體固載量和蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響； Ø 在上面研究的基礎(chǔ)上，選擇最佳載體，進一步研究磁性納米載體對蛋白質(zhì)吸附過程中的吸附動力學(xué)模型以及等溫吸附模型，以期為后續(xù)載體在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。(4) 吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化及載體與蛋白質(zhì)相互作用機理探討Ø 采用熒光光譜（FS）、FTIR、圓二色譜（CD）以及激光拉曼光譜等多光譜技術(shù)動態(tài)分析在整個吸附過程中，磁性納米載體對模型蛋白質(zhì)構(gòu)象

35、的影響規(guī)律；Ø 分析不同反應(yīng)條件下蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，揭示吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象變化規(guī)律，進一步闡明磁性納米載體與蛋白質(zhì)相互作用機理。(5) 磁性納米載體在蛋白質(zhì)領(lǐng)域應(yīng)用平臺的構(gòu)建Ø 以胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶為例，依據(jù)載體與蛋白質(zhì)相互作用機理，選擇最佳磁性納米載體以用于上述蛋白酶的固定化研究；Ø 深入分析上述蛋白酶在與載體作用過程中其構(gòu)象及其酶學(xué)特性的變化，以驗證本項目所推斷理論的準(zhǔn)確性。2.3主要實驗方法（1）兩親性殼聚糖衍生物的物化特性表征主要采用FTIR和NMR技術(shù)對殼聚糖衍生物的結(jié)構(gòu)進行表征分析。其中，核磁測試采用氘代氯仿與重水1:1作為溶劑，四甲基硅

36、烷（TMS） 為內(nèi)標(biāo)進行測定分析。殼聚糖衍生物溶解性的測定主要是在室溫下，以水、乙酸、二甲基亞砜（DMSO）、乙醇、乙醚 為溶劑，觀察兩親性殼聚糖在上述各個溶劑中的溶解情況。（2）載體對蛋白質(zhì)固載量的計算采用紫外分光光度法在280 nm的波長下測定磁性納米載體對模型蛋白質(zhì)的固載量，根據(jù)以下公式進行計算： (式1）式中：q 磁性納米顆粒對模型蛋白質(zhì)的固載量，mg/g；Co模型蛋白質(zhì)溶液的初始濃度，mg/ mL；Ce吸附后上清液中的模型蛋白質(zhì)濃度，mg/ mL；V模型蛋白質(zhì)溶液的體積，mL； m磁性納米載體的質(zhì)量，g。（3）多光譜技術(shù)動態(tài)分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化采用FTIR、CD、FS、激光拉曼光譜動態(tài)

37、分析吸附過程中蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。其中，CD定性分析蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化的數(shù)據(jù)處理方法：利用208 nm處的摩爾橢圓度來計算蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中螺旋結(jié)構(gòu)的含量，計算公式如下所示： （式2）式中：mrd 蛋白質(zhì)在 208 nm 下的摩爾橢圓度，deg cm2/dmol； d 單位橢圓度，mdeg；M 蛋白質(zhì)的分子量，Dalton；C 蛋白質(zhì)的濃度，mg/mL；L 路徑，0.1 cm；Nr 蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基數(shù)量。FTIR定量分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的圖譜處理：首先采用OMNIC 6.0數(shù)據(jù)處理軟件將原FTIR光譜圖轉(zhuǎn)化為以吸光值為縱坐標(biāo)的曲線圖，選取16001700 cm-1范圍內(nèi)的譜帶，然后用Peakfit

38、 4.12軟件進一步處理、分析；進一步選擇Gausse峰型，基線調(diào)零，曲線擬合，使最終殘差（r2）大于0.999；根據(jù)各子峰的積分面積計算其相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量；各子峰與二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系如下：16001639 cm-1 為 折疊，16401650 cm-1 為 無規(guī)則卷曲，16511660 cm-1 為 螺旋，16611700 cm-1 為 T 轉(zhuǎn)角；熒光光譜主要是通過對在變性劑尿素的作用下蛋白質(zhì)展開實驗定性表征蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。2.4 可行性分析（1）理論研究可行性項目申請人前期對核-殼型超順磁性納米顆粒的制備、化學(xué)改性、表征及其在蛋白質(zhì)分離純化及酶固定化中的應(yīng)用進行了較為深入、系統(tǒng)的

39、研究。本課題組在前期的研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)在磁性納米載體與生物酶的相互作用過程中，載體的表面結(jié)構(gòu)對酶的構(gòu)象穩(wěn)定起到了關(guān)鍵作用，而構(gòu)建具有不同表面結(jié)構(gòu)的磁性納米載體，并系統(tǒng)研究載體與蛋白質(zhì)相互作用，可為磁性納米載體的設(shè)計及其在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，因此，本課題的研究思路以及研究路線為可行的。（2）實驗技術(shù)及方法可行性 本課題的第一個任務(wù)是兩親性殼聚糖衍生物的合成及其核殼型磁性納米載體的制備。課題組成員，有著長期從事生物多糖的分離純化、化學(xué)修飾、結(jié)構(gòu)表征等方面的經(jīng)驗，對多糖的化學(xué)改性實驗及技術(shù)都非常熟悉，完全可以勝任本課題中對殼聚糖的衍生化反應(yīng)任務(wù)；同時，關(guān)于磁性納米載體的可控構(gòu)建研究

40、，申請者前期采用化學(xué)共沉淀法已成功合成了粒徑在15 nm左右的核-殼型磁性納米顆粒，制備方法已發(fā)表在Journal of Chromatography B，目前已掌握了與磁性納米載體制備相關(guān)的實驗技術(shù)及手段。 本課題的第二個任務(wù)是磁性納米載體與蛋白質(zhì)相互作用機理及其構(gòu)效關(guān)系研究。申請者前期以Lyz為模型蛋白質(zhì)，研究了磁性納米載體與Lyz的相互作用，并對其吸附、解吸附過程中的構(gòu)象變化進行了深入探討，業(yè)已掌握了對蛋白質(zhì)在吸附過程中構(gòu)象變化的分析能力；此外，申請人及其課題組成員能夠靈活運用FTIR、TEM、TGA、Zeta電位粒徑分析儀等多種手段進行磁性納米載體的表征與分析，并且掌握了蛋白質(zhì)構(gòu)象測定

41、的CD、FS和FTIR譜圖的分析方法，能夠獨立進行圖譜解析及數(shù)據(jù)處理。 采用多光譜技術(shù)動態(tài)分析磁性納米載體對蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響，本課題擬通過TEM觀察載體在蛋白質(zhì)吸附前后的樣貌狀態(tài)，熒光光譜中最大吸收峰波長的位移，激光拉曼光譜圖中Lippert法定量分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)， FTIR中酰胺I鍵波段的紅外吸收的分峰擬合分析，以及對CD光譜中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的計算，定性定量分析磁性納米材料負載蛋白質(zhì)后其構(gòu)象的變化。相關(guān)的分析方法及數(shù)據(jù)處理手段國際上均有較為成熟的研究與報道。同時，學(xué)院中心實驗室及校分析測試中心已基本具備了所需的實驗設(shè)備及條件，能夠保證本課題研究任務(wù)的順利展開及完成。（3）較為深入的前期

42、研究基礎(chǔ) 本課題是對博士研究課題的延伸，在博士研究階段就磁性納米載體的制備及其在蛋白質(zhì)分離純化及酶固定化中的應(yīng)用進行了較為深入的研究，已發(fā)表SCI論文6篇，累積影響因子16（見申請人簡歷欄）。此外，就本課題的研究內(nèi)容也進行了部分前期預(yù)實驗探索，扎實的前期研究基礎(chǔ)，將會為本項目的順利完成提供保障。2.4、本項目的特色與創(chuàng)新之處。 (1) 特色以生物功能化磁性納米載體的可控化制備為研究基礎(chǔ)，基于分子水平研究磁性納米載體與蛋白質(zhì)的相互作用機理及其對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，豐富磁性納米載體在蛋白質(zhì)應(yīng)用領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論研究內(nèi)容，初步建立磁性納米材料在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用平臺，同時為高品質(zhì)磁性納米載體的設(shè)計開發(fā)及其在蛋白質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。 (2) 思路創(chuàng)新 具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖衍生物與具有獨特磁學(xué)性質(zhì)的Fe3O4納米粒子的結(jié)合既是對傳統(tǒng)生物多糖聚合物功能的拓展，