突變的冬蟲夏草菌絲體中多糖的提取純化及抗腫瘤活性研究

1、突變的冬蟲夏草菌絲體中多糖的提取，純化及抗腫瘤活性研究摘要 從突變的冬蟲夏草中可大量提取出一種水溶性多糖（命名為MCMP），通過(guò)熱水提取，利用sevage法、乙醇沉淀，陰離子交換和凝膠過(guò)濾層析CL-6B法脫除蛋白質(zhì)。該多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖組成，它們的摩爾比為59.36:1:8.31:39.50，其平均分子量為8100。在這項(xiàng)研究中，我們選擇喉癌Hep-G2細(xì)胞，Hela細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞來(lái)研究該多糖的抗腫瘤活性。MTT測(cè)定結(jié)果表明，經(jīng)48小時(shí)的培養(yǎng)后，該突變體菌株的多糖對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用。引言冬蟲夏草，最昂貴的中國(guó)傳統(tǒng)藥物之一，被認(rèn)為是中國(guó)罕見的蟲草。冬蟲夏草具有廣泛的藥理

2、活性，包括抗炎，鎮(zhèn)痛抗氧化，抗血栓生成，常用于補(bǔ)腎、緩解肺部炎癥，治療高血糖，高血脂，腎功能不全和肝臟疾病等?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，冬蟲夏草對(duì)人體的幾個(gè)系統(tǒng)有益，如循環(huán)系統(tǒng)、免疫、造血、心血管、呼吸和腺體系統(tǒng)。 然而，時(shí)下，冬蟲夏草的過(guò)度開發(fā)導(dǎo)致了野生冬蟲夏草的滅絕及土地的荒漠化。培育蟲草，而不是傳統(tǒng)的恢復(fù)冬蟲夏草是人們迫切需要的。在中國(guó)及東南亞，一般將培育子實(shí)體作為原料藥和保健食品進(jìn)行售賣。近年來(lái)，科學(xué)家們對(duì)它的生命周期進(jìn)行了廣泛研究，以期分離出發(fā)酵菌株。 從天然冬蟲夏草中已分離出幾株。木耳栽培技術(shù)已被用于培育冬蟲夏草，它們顯示出類似的藥理活性，冬蟲夏草可以生產(chǎn)多種生物活性成分如蟲草素，D-甘露

3、醇和某些多糖。多糖因其多種多樣的生物活性而備受關(guān)注，它被廣泛地應(yīng)用在化妝品，藥品，食品營(yíng)養(yǎng)等行業(yè)。 研究發(fā)現(xiàn)，某些多糖對(duì)包膜病毒有抵抗功效，包括HSV-1病毒，流感病毒和人巨噬細(xì)胞病毒，而且具有抗腫瘤活性。冬蟲夏草具有多種類型的多糖，已報(bào)道它們具有許多令人關(guān)注的生物活性，包括免疫刺激，抗腫瘤活性和自由基清除等。中國(guó)吉林大學(xué)普通生物學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，突變冬蟲夏草（H4019）高產(chǎn)多糖達(dá)0.780 g / L。因此，本研究的目的是對(duì)冬蟲夏草H4019的多糖進(jìn)行分離，純化，表征及抗腫瘤潛能的探究。2.材料和方法2.1 藥品a. 瓊脂糖凝膠CL-6B是從Pharmacia Biotech公司購(gòu)得。

4、b. DEAE-52纖維素陰離子交換柱是來(lái)自Amersham Biosciences公司。三氟乙酸（TFA）購(gòu)自Merck公司。c. 3 - （4,5 - 二甲基-2 - 基）-2,5 - 二苯基溴化（MTT），刀豆蛋白A（刀豆）和脂多糖（LPS）購(gòu)自Sigma化學(xué)公司。d. 作為介質(zhì)的RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO Invitrogen公司。RMPI-1640培養(yǎng)基，用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，配有HEPES緩沖液10mol/ml，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 g/ml，L-谷氨酰胺2mol/ml，2 - 巰基乙醇50mol/L,10的新生牛血清，pH=7.2。e. 所有其他試劑均為可

5、用的最高品質(zhì)。2.2 細(xì)菌培養(yǎng)將原始菌株（CGMCC5.699）在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）斜面上，26下培育7天，然后在液體培養(yǎng)基中激活4天誘導(dǎo)出高產(chǎn)突變冬蟲夏草（H4019）。種子菌液與浸沒(méi)液以4的比例接種到發(fā)酵液中，得到真菌菌絲。真菌菌絲體冷凍干燥并收集。用蒽酮-硫酸法以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)確定總碳水化合物含量。2.3 MCMP的提取從冬蟲夏草中獲得的真菌菌絲體，在沸水浴中加熱3.5小時(shí)，并用4層紗布過(guò)濾。將固體物質(zhì)在相同條件下萃取兩次。合并濾液并離心除去不溶于水的物質(zhì)。離心（8000r/min，10min）后，將上清液濃縮至1000mL，加入95（體積分?jǐn)?shù)）乙醇。乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為80。

6、懸浮液在3000r/min下離心10min后，收集沉淀物，并將其冷凍干燥，得到粗多糖級(jí)分。碳水化合物總含量測(cè)定。將多糖重新溶解在1000ml蒸餾水中，用Sevag法(試劑V正丁醇：V氯仿=1:4，250ml)處理，將其在5000 r/min下離心15 min以除去蛋白質(zhì)。The supernatant was dialyzed against deionized water over night before concentration in a vacuum evaporator at 55 °C. 將上清液透析去離子水中過(guò)夜，用真空蒸發(fā)器在55下進(jìn)行濃縮。將乙醇與樣品以4:1（體

7、積比）進(jìn)行沉淀，并除去沉淀和溶劑乙醇后，得到冬蟲夏草（MCMP）的菌絲體脫蛋白的多糖級(jí)分?？偺妓衔锏暮看_定了。2.4 MCMP的純化 將20mgMCMP溶解在1ml的蒸餾水中，用DEAE-52纖維素陰離子交換柱（2.6厘米×60公分）進(jìn)行離子交換。該柱先用去離子水，然后再用梯度溶液（0.1，0.2和0.3mol/L的NaCl）分別以0.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫。收集級(jí)分（5毫升，每份），根據(jù)蒽酮-硫酸法確定總碳水化合物含量。糖醛酸的含量用m-羥基法確定。得到的級(jí)分濃縮，用蒸餾水透析，然后冷凍干燥。凝膠滲透色譜系統(tǒng)瓊脂糖CL-6B用于進(jìn)一步純化。該柱用的去離子水以1ml/mi

8、n的流速進(jìn)行。將級(jí)分（10ml，每份）收集起來(lái)。2.5多糖分子的測(cè)定質(zhì)量和單糖組成MCMP的分子量（Mw）與單糖組成是用高性能液相色譜儀（HPLC，日本島津公司）進(jìn)行測(cè)定的，配有TSK-GEL G3000 PWXL柱（7.8毫米×300毫米）和一個(gè)RID-10A折光檢測(cè)評(píng)價(jià)儀。HPLC法： 將0.5的MCMP（20L）溶解在蒸餾水中，以0.7的Na2SO4為流動(dòng)相,以0.5ml/min的流速在40下進(jìn)行。用已知的相對(duì)分子質(zhì)量（T-700，T-580，T-500，T-110，T-80，T-40，T-11和T-9.3）的T系列葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。取2mg多糖樣品進(jìn)行水解，用含1 mo

9、l / L鹽酸的無(wú)水甲醇，在80下處理16小時(shí)，然后用2mol / L的三氟乙酸（TFA），在120下保持1小時(shí)。所得到的水解產(chǎn)物是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）的衍生物，用連接有Shimadzu HPLC系統(tǒng)（LC-10ADVP泵和SPD-10AVD UV-Vis檢測(cè)器）的Inertsil ODS-3色譜柱（4.6 mm×150毫米）進(jìn)行分析。 將PMP的衍生物（20L）注入HPLC系統(tǒng)，用82.0的PBS（0.1摩爾/升，pH值=7.0）和18.0的乙腈（體積比）以1.0ml/min的流速進(jìn)行洗脫，并通過(guò)UV監(jiān)測(cè)245nm下的光譜。2.6細(xì)胞系列喉癌Hep-G2細(xì)胞，

10、Hela細(xì)胞和系膜細(xì)胞從上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，中國(guó)科學(xué)研究院獲得。在RPMI-1640培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞，該培養(yǎng)基有10熱滅活的胎牛血清（FBS），青霉素（100 IU/ml）和鏈霉素（100mg / L），在37 °C、潮濕環(huán)境下培養(yǎng)，空氣中CO2 的含量為5%。2.7體外抗腫瘤試驗(yàn)MCMP對(duì)HepG-2細(xì)胞，Hela細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的抑制效應(yīng)，是通過(guò)3 -（4,5 - 二甲基-2 -吡啶）-2,5 - 二苯基溴化法（MTT）測(cè)定出來(lái)的。將密度為2×104個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞接種于96孔的培養(yǎng)板上。在37下培養(yǎng)24小時(shí)后，將實(shí)驗(yàn)樣品（濃度大約為8000

11、，4000，2000，1000，500，250，125和62.5g/ml）和控制介質(zhì)分別加入到各類細(xì)胞樣品中，每隔24小時(shí)加一次，培養(yǎng)72小時(shí)。加入20L（5g/ml）的MTT溶液到每個(gè)孔中，并將細(xì)胞在37下進(jìn)一步培養(yǎng)4小時(shí)。將析出的甲臜用150L二甲基亞砜溶解后，在570nm的波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。MCPC的抑制率（IR）是通過(guò)下面的公式計(jì)算：IR(%)=(1 ODexp/ODcon) × 100%其中OD exp和OD con是處理過(guò)的和未處理過(guò)的細(xì)胞的光密度。2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值。統(tǒng)計(jì)計(jì)算采用SPSS10.0版軟件（SPSS公司，芝加哥，美國(guó)）進(jìn)行。

12、應(yīng)用方差分析方法測(cè)定試樣結(jié)果之間的差異。利用鄧肯檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較。 P值 <0.05時(shí)，認(rèn)為具有顯著差異。3結(jié)果與討論3.1多糖的分離與純化通過(guò)乙醇沉淀，從100g真菌菌絲體中提取出2.312g粗多糖，其多糖含量用蒽酮 - 硫酸法測(cè)定為28.1。通過(guò)DEAE-52纖維素陰離子交換柱和瓊脂糖凝膠CL-6B柱提純，多糖含量達(dá)到99.8，凍干后質(zhì)量為320mg。MCMP的色譜結(jié)果見圖1。經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素陰離子交換柱分離后，從中獲得的MCMP I和MCMP II（1:10.6體積比）及其含水梯度溶液（去離子水和0.1，0.2和0.3mol/LNaCl）。MCMP I和MCM

13、P II分別是中性多糖和酸性多糖。MCMPII通過(guò)瓊脂糖凝膠 CL-6B柱進(jìn)一步純化（圖2）。MCMPII只顯示一個(gè)對(duì)稱峰。結(jié)果表明，樣品中沒(méi)有糖醛酸和其它多糖。利用DEAE-52纖維素陰離子交換柱粗多糖的溶出曲線總碳水化合物含量用蒽酮硫酸法測(cè)定用0.1mol/ L的去離子水以1 mL / min的流速洗脫，用瓊脂糖凝膠CL-6B柱測(cè)定MCMP的純度3.2多糖分子質(zhì)量和單糖組成樣品經(jīng)乙醇沉淀后，獲得多糖級(jí)分。多糖的分子量是8100。該多糖含有甘露糖，鼠李糖，半乳糖和葡萄糖，根據(jù)保留時(shí)間和HPLC（圖3）的峰面積得其摩爾比為59.36:1:8.31:39.50。 利用HPLC分析多糖組分3.3

14、MCMP的抗腫瘤活性研究體外測(cè)定突變體菌株（H4019）的多糖對(duì)HepG-2細(xì)胞，Hela細(xì)胞和系膜細(xì)胞的結(jié)果見圖4。 從結(jié)果中，我們可以看到，該突變體菌株經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)后對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有抑制作用。但經(jīng)過(guò)48小時(shí)培養(yǎng)，用不同濃度的多糖處理的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的受抑制作用，且抑制能力受劑量控制。其抗腫瘤活性與多糖濃度直接相關(guān)。經(jīng)過(guò)72小時(shí)培養(yǎng)，生長(zhǎng)抑制率較高。在8mg/ml的濃度，MCMP對(duì)HepG-2細(xì)胞、Hela細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞的抑制率分別為57.11，67.11和58.74（如圖4）。MCMP（高產(chǎn)突變冬蟲夏草菌絲體多糖）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與原始菌株的多糖比較，表現(xiàn)出對(duì)HepG-2細(xì)胞，Hela細(xì)胞和系膜細(xì)胞相對(duì)較高的抑制率。經(jīng)過(guò)72小時(shí)培養(yǎng)，MCMP對(duì)HepG-2細(xì)胞，Hela細(xì)胞和系膜細(xì)胞的IC50值分別為5.318，3.192和9.644mg/ml。在我們的研究中，突變冬蟲夏草產(chǎn)生了比原始菌株明顯更多的多糖。相較于原始菌株0.587g/ L，該突變體冬蟲夏草的多糖含量增加到0.780g/ L 。提取和純化工藝很容易操作并獲得了均勻純度高的多糖。產(chǎn)量高和純度高的多糖降低生產(chǎn)成本。我們研究了MCMP對(duì)HepG-2細(xì)胞