液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶和奶制品中三聚氰胺殘留

1、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶和奶制品中三聚氰胺殘留柳 菡1，孫寧寧1，楊雯筌1，劉 飛2，丁 濤1，徐錦忠11. 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心，南京，210001，2. 賽默飛世爾科技上海有限公司色譜質(zhì)譜部，上海，201206摘 要 研究報導了高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS/MS）測定奶和奶制品中三聚氰胺殘留的方法。三氯乙酸溶液沉淀樣品中的蛋白，同時提取目標分析物，強陽離子固相萃取柱進一步富集凈化后，利用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定。方法檢測低限為0.05 mg/kg， HPLC/MS/MS添加回收率72 87 之間（基質(zhì)匹配曲線校正），相對標準偏差（RSD）在4.2

2、 8.2。關(guān)鍵詞 三聚氰胺；奶和奶制品；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法Determination of melamine residues in milk and dairy products by liquid chromatography tandem mass spectrometryHan Liu1, Fei Liu2, Ningning Sun1, Wenquan Yang1, Tao Ding1, Jinzhong Xu1,1 Animal, Plant and Food Inspection Center (APFIC) of Jiangsu Entry-Exit Inspection a

3、nd Quarantine Bureau, Nanjing 2100012 ThermoFisherScientific, Shanghai，201206Abstracts: A method for analysis of melamine residues in milk and dairy products was developed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Trichloroacetic acid solutions were used to precipitate proteins a

4、nd dissociate the target analytes from sample matrix. After matrix purified by strong cation exchange solid phase extraction cartridge, analyses can be performed using HPLC/MS/MS in the selected reaction monitoring (SRM) mode. The limit of dection is 0.05 mg/kg when using HPLC/MS/MS method. The mean

5、 recovery was 72 108 (matrix match calibration curve)and the standard deviation was 4.2 12.5 % by HPLC/MS/MS method.KEYWORDS: melamine; milk and dairy products; HPLC-MS/MS 9月上旬，甘肅等地報告多例嬰幼兒泌尿系統(tǒng)結(jié)石病例，調(diào)查結(jié)果表明，導致多名兒童患泌尿系統(tǒng)結(jié)石病的主要原因是患兒服用的奶粉中含有三聚氰胺。三聚氰胺是一種非食品化工原料，按照國家規(guī)定，嚴禁用作食品添加物。部分嬰幼兒配方奶粉中含有三聚氰胺，是不法分子為增加原料奶或

6、奶粉的蛋白檢測量而人為加入的。 三聚氰胺(melamine)簡稱三胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料（結(jié)構(gòu)式見圖1），主要用于生產(chǎn)三聚氰胺-甲醛樹脂，廣泛用于木材加工、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)，目前是重要的尿素后加工產(chǎn)品。此外三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等。在部分亞洲國家，它也被用以制造化肥。同時三聚氰胺也是一種名為滅蠅胺的農(nóng)藥的代謝產(chǎn)物1。三聚氰胺屬非食品用化學物質(zhì)，食品中嚴禁添加，為提高奶和奶制品中蛋白質(zhì)含量而加入大量三聚氰胺后，食用可導致泌尿系統(tǒng)疾病1。圖1 三聚氰胺化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of melamine目前

7、測定三聚氰胺的檢測方法包括氣相色譜法2、氣質(zhì)聯(lián)用法3-4、高效液相色譜紫外或二極管陣列和串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法5-8。氣質(zhì)聯(lián)用方法需要衍生化，過程比較繁瑣。高效液相色譜配合紫外或二極管陣列由于其無需衍生化是目前最為常用的檢測方法，但是抗干擾能力差，定量限難以滿足要求。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法靈敏度高、抗干擾能力強，在三聚氰胺檢測中具有優(yōu)勢。本文介紹了利用高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS/MS）測定奶和奶制品中三聚氰胺殘留的方法。利用三氯乙酸溶液沉淀蛋白，陽離子交換固相萃取柱凈化，進行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。經(jīng)過大量樣品分析結(jié)果表明，該方法快速、簡單、抗干擾能力強，可以作為奶和奶制品中

8、三聚氰胺殘留的測定方法。1 實驗部分11 儀器、試劑與材料Thermo Fisher TSQ Quantum 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧電離源。甲醇(色譜純，德國Merck)，乙腈(色譜純，德國Merck)，三氯乙酸、氨水（28）、氫氧化鈉(分析純，南京化學試劑廠)、強陽離子交換柱（PCX，60mg 3mL 艾杰爾公司）；水為重蒸蒸餾水。三聚氰胺標準品購買自Sigma-Aldrich公司，純度98。液態(tài)奶、奶粉、奶油等來自送檢樣品。12 測定條件色譜條件：VARIAN C18色譜柱(150 mm2.1 mm i.d., 5 m)；流動相：10mmol/L醋酸銨水溶液甲醇（90：

9、10），等度洗脫；流速0.20 mL/min。柱溫：室溫。進樣體積：5L。分析時間：9 min。質(zhì)譜條件：電噴霧離子化，正離子方式檢測；毛細管溫度350；噴霧電壓4500 V；。三聚氰胺的質(zhì)譜條件見表1。表 1 三聚氰胺質(zhì)譜條件Table 1 ESI/MS/MS conditions of melamine 化合物母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能量/eV三聚氰胺127856821151.3 標準工作溶液的配制 將三聚氰胺標準用甲醇水（2:8）配制成1.0 g/L的單標儲備液，避光冷藏保存。按實際檢測需求，用陰性樣品提取后吹干，添加一定量的標準溶液和1%三氯乙酸溶液配制相應(yīng)濃度的標準工作溶

10、液。1.4 樣品前處理稱取(1.000.02)g樣品于50 mL具塞離心管中，加入1三氯乙酸溶液10 mL，于液體混勻器上快速混合30 s，超聲波儀超聲30min。離心5 min（8000 r/min），將上層清液過濾紙到干凈離心管中，待凈化。用3 mL甲醇、3 mL水分別活化強陽離子交換柱，將濾液上柱，3 mL水和3mL甲醇洗滌SPE小柱，3 mL氨水甲醇（5 V:V）洗脫后，40水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用1.0 mL 三氯乙酸溶液（1）定容后，過濾膜到進樣瓶中，供液質(zhì)聯(lián)用儀測定。2 結(jié)果與討論2.1 提取和凈化條件的選擇和優(yōu)化三聚氰胺極性較強，因此提取溶劑一般都使用極性較強的體系：緩沖水溶液、極

11、性較強的有機溶劑或有機溶劑和水的混合溶劑。實驗中比較了甲醇、甲醇水混合溶劑（1:1）、乙腈、乙腈水混合溶劑（1:1）、水、1三氯乙酸水溶液和5 三氯乙酸水溶液作為提取溶劑，在陰性液態(tài)奶、奶粉、奶油中添加0.5 mg/kg濃度的三聚氰胺標準，比較不同提取溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)純有機溶劑直接提取回收率低，其余溶劑提取效率接近。在大量實際樣品分析中發(fā)現(xiàn)，有一些奶粉樣品在使用水或有機和水混合溶劑提取后，十分粘稠，高速離心后亦無法過濾或過濾困難，且某些定容樣品溶液在放置2hr后出現(xiàn)沉淀，極容易導致色譜分析柱或分析預柱堵塞。1三氯乙酸溶液可以沉淀樣品中的蛋白，避免該類現(xiàn)象的出現(xiàn)。在實驗中，5和10的三氯

12、乙酸也曾經(jīng)作為提取溶劑來使用，增加三氯乙酸的含量沉淀蛋白的效果更加明顯，但是隨著提取溶劑中三氯乙酸的含量的增加，對色譜分析中色譜峰形產(chǎn)生較大影響或者有不出峰的現(xiàn)象。最終選擇1三氯乙酸溶液作為提取溶劑使用。由于出口奶和奶制品成份復雜，直接三氯乙酸提取后高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定時，容易出現(xiàn)離子源噴口污染比較嚴重導致靈敏度下降的現(xiàn)象，需要對樣品進行凈化。三聚氰胺結(jié)構(gòu)中含有三個伯胺基團，屬于堿性化合物，在酸性條件下形成正離子，可以采用強陽離子固相萃取柱對樣品進行凈化，通過水和甲醇的清洗可以除去樣品中水溶性的雜質(zhì)、無機鹽和非離子化的脂溶性雜質(zhì)9。實驗中發(fā)現(xiàn)利用強陽離子交換柱對樣品進行凈化后，可以較大限度

13、的去除雜質(zhì)，經(jīng)過大量樣品的分析，依然可以有效的防止樣品過臟導致噴口污染的情況發(fā)生。2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化三聚氰胺屬于強極性化合物，在C18色譜柱上幾乎無保留，導致三聚氰胺與干擾物質(zhì)無法分離，對檢測帶來干擾。為增加三聚氰胺在C18色譜柱上保留，HPLCDAD分析中一般都在流動相中加入離子對試劑，如庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉8 和十二烷基磺酸鈉等，與三聚氰胺形成中性離子對。在HPLC/MS/MS測定中，流動相中只能使用揮發(fā)性的離子對試劑，如七氟正丁酸6。但是七氟正丁酸的使用，盡管可以改善三聚氰胺在普通C18柱上的保留，但其會導致負離子無法正常測定，一般不建議使用，所以直接采用90:10的醋酸銨水

14、溶液甲醇作為流動相。在實驗中，發(fā)現(xiàn)使用1三氯乙酸溶液定容樣品和配制標準溶液，不僅可以使三聚氰胺在普通C18分析柱起到良好的保留作用，且靈敏度有一定的上升。可能由于三氯乙酸也具有一定的離子對試劑的功能，可以使三聚氰胺在普通C18分析柱產(chǎn)生保留，同時三氯乙酸的加入促使三聚氰胺在流動相中正離子化的預形成，導致靈敏度上升。實驗中發(fā)現(xiàn)使用HPLC/MS/MS測定時有基質(zhì)抑制效應(yīng)存在。用陰性液態(tài)奶、奶粉和奶油經(jīng)過提取、SPE凈化定容后的溶液配制的標準溶液和直接配制的同濃度標準溶液相比，信號下降3060左右，從而直接導致回收率偏低。為了補償由于基質(zhì)抑制效應(yīng)而導致測定數(shù)值偏差問題，采用基質(zhì)匹配曲線（Matri

15、x matched calibration curve）來校正最終結(jié)果。2.3 線性范圍和定量限陰性基質(zhì)提取吹干后，加入一定量標準溶液和1%三氯乙酸，配制相應(yīng)質(zhì)量濃度的系列標準溶液，以待測物的質(zhì)量濃度對峰面積做線性回歸。結(jié)果表明，在濃度為0.02 g/mL2 g/mL時相關(guān)系數(shù)(r )為0.9981，線性良好。該方法定量限為0.05mg/kg。2.4 回收率和精密度試驗在陰性液態(tài)奶、奶粉和奶油中添加三聚氰胺標準溶液，添加水平為0.05 mg/kg 、0.10mg/kg和0.20mg/kg，重復測定7次，計算其回收率和精密度，結(jié)果見表2。表2 回收率和精密度試驗結(jié)果（n7）Table 2 Res

16、ults of Recovery and precision test (n=7)添加量/(mg/kg)液態(tài)奶奶粉奶制品檢出量 (mg/kg)回收率 (%)RSD (%)檢出量(mg/kg)回收率(%)RSD (%)檢出量(mg/kg)回收率(%)RSD (%)0.050.037746.80.036728.20.039783834.50.077776.60.082874875.10.164825.10.158794.2圖2 奶粉中添加三聚氰胺（0.1 mg/kg）色譜圖和質(zhì)譜圖 Fig. 2 Chromatography and mass spectru

17、m of melamine spiked in milk powder (0.1 mg/kg) 3 結(jié)論 建立了HPLC/MS/MS方法測定奶和奶制品中三聚氰胺殘留。利用三氯乙酸溶液沉淀蛋白并提取三聚氰胺，陽離子交換柱凈化，簡單快速、抗干擾能力強。經(jīng)大量樣品實際檢測證明，該方法適合目前國內(nèi)外監(jiān)控和檢測的要求。參考文獻1/dms/melamra.html，May 25, 20072Bardalaye, P. C.; Wheeler, W. B.; Meister, C. W. J. Assoc.Off. Anal. Chem. 1987, 70 (3

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