Ⅰ型膠原蛋白基因在胃癌食管癌中的表達(dá)

1、型膠原蛋白基因在胃癌、食管癌中的表達(dá)【摘要】 目的 應(yīng)用熒光差異顯示技術(shù)篩選胃癌中特異表達(dá)的基因，并驗(yàn)證其在胃癌、食管癌中的表達(dá)，為進(jìn)一步了解胃癌、食管癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供幫助。方法 應(yīng)用熒光差異顯示技術(shù)（DD-PCR）分析胃癌及其相對(duì)應(yīng)的正常胃黏膜組織，獲得差異表達(dá)的基因片段，這些片段經(jīng)過(guò)二次PCR再擴(kuò)增后進(jìn)行克隆和測(cè)序，通過(guò)在GenBank中同源性檢索，查找與差異片段相對(duì)應(yīng)的同源基因。應(yīng)用半定量PCR,熒光定量PCR等方法進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在胃癌及食管癌中的表達(dá)差異。結(jié)果 通過(guò)DD-PCR得到的差異片段中的一個(gè)片段對(duì)應(yīng)于人型膠原蛋白基因。該基因的讀碼框長(zhǎng)4 395bp，編碼1 464個(gè)

2、氨基酸，編碼蛋白分子量約139.01kD。該基因在胃癌及食管癌組織中的表達(dá)量高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，并且在食管癌組織中的表達(dá)差異較胃癌中更明顯。結(jié)論 人型膠原蛋白基因在胃癌及食管癌中均呈高表達(dá)，推測(cè)其可能在胃癌及食管癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。 【關(guān)鍵詞】 基因 型膠原蛋白 胃腫瘤 食管腫瘤 熒光差異顯示 聚合酶鏈反應(yīng) 分子生物學(xué)研究表明癌基因、抑癌基因和細(xì)胞周期控制基因的異常表達(dá)參與了胃癌及其他惡性腫瘤的演進(jìn)1。目前許多胃癌特異表達(dá)基因已被鑒定及研究，如p53基因、谷胱甘肽S2轉(zhuǎn)移酶基因等，但胃癌發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制仍未闡明，因此尋找胃癌中新的特異表達(dá)的基因?qū)ξ赴┑幕A(chǔ)研究與臨床研究有重要意義。本試

3、驗(yàn)應(yīng)用熒光差異顯示方法（DD-PCR）篩選到胃癌中差異表達(dá)的型膠原蛋白基因，并利用mRNA定量分析方法檢測(cè)該基因在胃癌及食管癌組織中與其對(duì)應(yīng)癌旁組織之間表達(dá)的差異。 1 材料與方法 1.1 臨床材料 實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本來(lái)自2006年3月至2006年6月間于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的胃癌患者12例及食管癌患者14例。每例患者均取手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織（距離癌組織約23cm），并經(jīng)病理檢查證實(shí)。組織離體后立即在液氮中速凍，并置于-70冰箱中保存。 1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，熒光差異顯示試劑盒購(gòu)于Genhunter公司，SuperScript反轉(zhuǎn)錄試

4、劑盒購(gòu)于Gibco公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司。主要儀器有FMBIO?誖（HITACHI）熒光差異顯示系統(tǒng)，STRATAGENE MX3000P熒光定量PCR儀，Genspec（HITACHI）。 1.3 cDNA的制備 用Trizol提取的方法提取胃癌、食管癌組織及其癌旁組織的RNA，使用Gens-pec測(cè)定總RNA的濃度，經(jīng)DNase消化后，反轉(zhuǎn)錄得到胃癌、食管癌及其癌旁組織的cDNA。 1.4 DD-PCR 3種熒光引物(FHT12A，F(xiàn)HT12G，F(xiàn)HT12C)與21種試劑盒中的隨機(jī)引物做不同組合，進(jìn)行熒光差異顯示PCR(DD-PCR)，PCR產(chǎn)物8l上樣于6%的聚丙

5、烯酰胺凝膠，1 400V恒壓電泳5h左右。 1.5 差異片段的克隆 差異條帶經(jīng)切割和處理后作為模板，進(jìn)行二次PCR，將產(chǎn)物連接于T載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆經(jīng)酶切鑒定后測(cè)序(上海生工)。 1.6 熒光定量PCR分析 利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)用于定量PCR的膠原蛋白型基因引物，內(nèi)參選用人-actin，檢測(cè)膠原蛋白型基因在胃癌、食管癌組織及其癌旁組織中表達(dá)的差異。引物序列為：膠原蛋白型基因：5-GAGAGCATGACCGATGGAT，3-ATGTTTTGGTGGT- TCAGGAGG；內(nèi)參-actin：5-GAGACCTT CAACACCCCAGCC，3-

6、GGAGTACAGGTCTTTGCGGATG。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為280bp和512bp。反應(yīng)條件為94 30s，57 30s，72 35s。根據(jù)2-Ct公式計(jì)算基因相對(duì)拷貝數(shù)，利用SPSS13.0軟件對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 1.7 半定量PCR分析 為了對(duì)熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步檢驗(yàn)，用做定量PCR的兩對(duì)引物對(duì)不同模板cDNA分別作了半定量PCR，反應(yīng)條件為94 30s，57 30s，72 35s 25個(gè)循環(huán)。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)軟件對(duì)所得電泳條帶進(jìn)行亮度和面積的分析，得出數(shù)據(jù)，然后用SPSS13.0軟件處理，得到直觀的圖象。 2 結(jié) 果 2.1 陽(yáng)性差異片段的篩選 聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

7、胃癌組織和癌旁組織中基因的表達(dá)存在差異性。為進(jìn)一步了解這些差異片段的信息，將差異片段切出后，進(jìn)行二次擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增到的片段進(jìn)行克隆和序列分析。將測(cè)序獲得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，其中編號(hào)為G1的差異片段與GenBank中的人型膠原蛋白基因同源性達(dá)到100%(GenBank：BC036531)。 2.2 半定量PCR分析 本研究中取4例胃癌、3例食管癌標(biāo)本對(duì)人型膠原蛋白基因在癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)量進(jìn)行半定量分析。由圖1、圖2可看到人型膠原蛋白基因在胃癌及食管癌組織及其癌旁組織中均有表達(dá)，但在癌中的表達(dá)量高于旁組織，并且食管癌組織中的表達(dá)差異比胃癌中更明顯。通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)軟件對(duì)所

8、得電泳條帶進(jìn)行亮度和面積的分析，然后用SPSS13.0軟件處理，得到直觀的圖象，人型膠原蛋白基因在胃癌組織中的表達(dá)量高出癌旁組織約1.5倍（圖3），在食管癌組織中的表達(dá)量高出癌旁組織約2倍（圖4）。 2.3 熒光定量PCR分析 應(yīng)用12例胃癌、14例食管癌標(biāo)本對(duì)人型膠原蛋白基因在胃癌、食管癌及癌旁組織的表達(dá)量進(jìn)一步檢測(cè)。應(yīng)用SPSS13.0軟件作定量分析，結(jié)果表明，人型膠原蛋白基因在胃癌及食管癌組織中的表達(dá)量高于其相應(yīng)的癌旁組織，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且食管癌組織中的表達(dá)差異比胃癌中更明顯（圖5、圖6）。 3 討 論 mRNA差異顯示法于1992年由Liang等2首先

9、建立。經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，目前這一技術(shù)已比較成熟。它僅需少量的總RNA（0.020.2g），因此需要較少的組織標(biāo)本，并且具有靈敏度高、快速、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，該方法可以鑒別不同生理、病理狀態(tài)下基因的表達(dá)，已被證實(shí)能有效地篩選腫瘤惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程中差異表達(dá)的基因3。本研究應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)篩選到胃癌中高表達(dá)的型膠原蛋白基因，應(yīng)用mRNA定量PCR及半定量方法進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該基因在胃癌及食管癌組織中表達(dá)量高于其對(duì)應(yīng)的正常組織。 型膠原蛋白是哺乳動(dòng)物細(xì)胞最豐富的蛋白質(zhì),其編碼基因長(zhǎng)約40kb，包含了52個(gè)外顯子，編碼蛋白質(zhì)的單體肽鏈包含1 464個(gè)氨基酸殘基4。研究證實(shí)，型膠原蛋白基因在多種腫瘤（如胰腺

10、癌5、乳腺癌6、前列腺癌7等）中呈高表達(dá)，Demou等8學(xué)者發(fā)現(xiàn)型膠原纖維蛋白基因尾肽缺乏可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，Moro等9發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，型膠原蛋白基因可通過(guò)下調(diào)抑癌基因BRCA2表達(dá)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖，Lianq等10發(fā)現(xiàn)在腦腫瘤中，型膠原蛋白基因表達(dá)增高是構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的重要成分，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該基因在胃癌及食管癌中高表達(dá)，提示型膠原蛋白基因在惡性腫瘤中的高表達(dá)可能具有普遍性。另外，已有研究表明型膠原蛋白在鱗癌比在腺癌中表達(dá)更具有活性11，食管癌90以上組織學(xué)分型為鱗癌，而胃癌85以上均為腺癌12，這與我們?cè)谘芯窟^(guò)程中發(fā)現(xiàn)型膠原蛋白基因在食管癌中表達(dá)較在胃癌中表達(dá)更有差異性是一致的。對(duì)

11、型膠原蛋白基因的功能、型膠原蛋白基因在其他惡性腫瘤中是否也高表達(dá)以及在胃癌及食管癌中具體通過(guò)何種途徑發(fā)揮促癌作用等方面進(jìn)行深入研究，將有助于解析腫瘤形成、發(fā)展的機(jī)制?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, et al. Allele loss and promoter hypermeth-ylation of VHL, RAR-beta, RASSFIA and FHIT tumor suppressor gene on chromosome 3p in esophageal squamous cell carcinomaJ. Cancer Re

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