T細(xì)胞激活劑對(duì)Jurkat細(xì)胞重組激活基因表達(dá)的影響

1、T細(xì)胞激活劑對(duì)Jurkat 細(xì)胞重組激活基因表達(dá)的影響 作者：鄒紅云，馬驪，姚新生，溫茜，王小寧 【關(guān)鍵詞】 T細(xì)胞激活劑,；Jurkat細(xì)胞；重組激活基因；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of T cell activators on the mRNA expression of recombinationactivating genes (RAGs) in Jurkat cells. METHODS: After Jurkat cells were treated with PHA (20 mg/L), antiCD

2、3 mAb (1100), PMA(40 g/L)+A23187 (0.5 mol/L) for 6 and 12 h respectively, RAG1 and RAG2 mRNA were measured by RTPCR. Semiquantitative analysis was used to evaluate RAG1 and RAG2 mRNA levels in different groups. RESULTS: Compared with the control groups, the levels of RAG1 mRNA were significantly low

3、er in different treated groups (P<0.05), and RAG1 mRNA levels were associated with treatment time. RAG2 mRNA levels in PHA treated groups were significantly lower than those in the control groups (P<0.05). No RAG2 mRNA was detected in PMA+A23187 treated groups. However, RAG2 mRNA level was sig

4、nificantly higher in antiCD3 mAb (12 h) treated group than that in control groups(P<0.05). CONCLUSION： RAG1 and RAG2 mRNA were coexpressed in Jurkat cells and could be regulated by T cell activators. The results may give a clue that Jurkat cells maybe provide an ideal cell line model for studying

5、 the regulation of RAGs in peripheral T cells. 【Keywords】 T cell activators; Jurkat cells; recombinationactivating genes; reverse transcriptase polymerase chain reaction 【摘要】 目的： 研究T細(xì)胞激活劑PHA，抗CD3 mAb, PMA+A23187對(duì)人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat重組激活基因（RAGs ）mRNA表達(dá)水平的影響. 方法： 采用RTPCR法檢測(cè)不同T細(xì)胞激活劑作用不同時(shí)間后Jurkat 細(xì)胞中RAG1, R

6、AG2 mRNA，以肌動(dòng)蛋白（actin）的表達(dá)作為內(nèi)參照進(jìn)行灰度分析，比較不同組Jurkat細(xì)胞RAGs mRNA的表達(dá)水平 . 結(jié)果： 三種T細(xì)胞激活劑刺激誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞RAG1 mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05），且RAG1 mRNA表達(dá)量的下降與刺激誘導(dǎo)作用時(shí)間有關(guān)；PHA刺激誘導(dǎo)后RAG2表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；PMA+A23187刺激誘導(dǎo)6, 12 h均未檢測(cè)出RAG2 mRNA的表達(dá)； 而抗CD3 mAb作用12 h組RAG2 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）. 結(jié)論： Jurkat細(xì)胞同時(shí)表達(dá)RAG1, RAG2 m

7、RNA，并在一定誘導(dǎo)下RAGs表達(dá)量發(fā)生改變，因此有可能成為研究外周T細(xì)胞RAGs表達(dá)調(diào)節(jié)的一個(gè)潛在的細(xì)胞模型. 【關(guān)鍵詞】 T細(xì)胞激活劑 ；Jurkat細(xì)胞；重組激活基因；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 淋巴細(xì)胞特異性重組激活基因（recombination activating genes， RAG）1和RAG2是參與V(D)J重排和功能性抗原受體基因形成的一個(gè)首要條件1. 一般認(rèn)為，RAG1, RAG2基因僅特異性地同時(shí)表達(dá)于淋巴細(xì)胞發(fā)育的早期階段，而不表達(dá)于淋巴細(xì)胞分化發(fā)育的較成熟階段. 然而，近年的研究發(fā)現(xiàn)，外周成熟淋巴細(xì)胞中也有RAGs表達(dá)和V(D)J重排的發(fā)生2-3. 迄今，外周淋巴細(xì)胞RA

8、Gs mRNA 的表達(dá)和調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚. 本研究以代表T細(xì)胞發(fā)育成熟階段的人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)其RAG1和RAG2 mRNA的共表達(dá)情況，探討T細(xì)胞激活劑對(duì)Jurkat 細(xì)胞RAGs mRNA表達(dá)水平的影響，為研究外周T細(xì)胞的RAGs表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料Jurkat細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物研究所（clone E61, ATCC Number TIB152, TCR+CD3+CD4+CD8CD2+CD7+). 分泌抗CD3 mAb的雜交瘤細(xì)胞株12F6由南方醫(yī)科大學(xué)分子免疫學(xué)研究所凍存. RPIM 1640培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司）

9、；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA 廣東醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品）；佛波醇12豆蔻酰13乙酸酯（Phorbol 12Myristate 13Acetate，PMA），鈣離子載體A23187（美國(guó)Sigma 公司）；總RNA提取試劑盒（安徽優(yōu)晶生物工程有限公司）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TOYOBO公司）；Taq DNA聚合酶（立陶宛MBI Fermentas 公司）；pUCmT 載體（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；DL2000 DNA Marker（TaKaRa大連寶生物有限公司）. 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、處理及總RNA提

10、取Jurkat細(xì)胞用含有100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 , 50 mL/L CO2條件下培養(yǎng). 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Jurkat細(xì)胞，按1109/L的密度培養(yǎng)于12孔板中，分別加入PHA（20 mg/L）,抗CD3 mAb（1100）, PMA（40 g/L）+A23187（0.5 mol/L），同時(shí)設(shè)不加任何處理因素的對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)的第6, 12 h ，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌23次后采用試劑盒提取細(xì)胞總RNA，在核酸蛋白分析儀（BECKMAN DU530）上鑒定RNA純度和濃度，-70凍存?zhèn)溆? 1.2.2RNA逆轉(zhuǎn)錄取樣品總RNA約1 g，加到2

11、0 L反應(yīng)體系中按試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄. 1.2.3PCR擴(kuò)增RAG1, RAG2 mRNAPCR引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成. RAG1上下游引物序列分別為：5GAGCAAGGTACCTCAGCCAG3， 5GAGGCATCTGAGAATGCAG 3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為984 bp，PCR反應(yīng)條件為94 2 min；94 30 s, 58 45 s，72 1 min，30個(gè)循環(huán)；RAG2上下游引物序列分別為：5ATACCTGGTTTAGCGGCAAA3, 5CCAGCCTTTTTGTCCAAAGAA 3， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為192 bp，反應(yīng)條件為94 2 min；94 15 s，60 20

12、s，72 45 s，30個(gè)循環(huán)； actin 上下游引物序列分別為：5ACATTAAGGAGAAGCTGTGC3, 5CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT3， 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度375 bp. actin與RAG1或RAG2在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增. PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后采用凝膠成像系統(tǒng)（BIORAD Gel Dox XR system）照相. 1.2.4PCR產(chǎn)物的克隆和序列分析切膠回收并純化PCR目的產(chǎn)物條帶，將之與pUCmT載體連接后轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)菌，采用互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，DNA序列測(cè)定由大連寶生物工程有限公司完成. 1.2.5RTPCR

13、產(chǎn)物半定量分析將PCR產(chǎn)物電泳條帶用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)KONTRON IBAS 2.0）分析，測(cè)出每一條帶的面積（AREA）乘以平均光密度（mean optical density of the object, OPTDM），得出結(jié)合光密度（integrated optical density of the object, OPTDI)，根據(jù)RAG1和RAG2與actin OPTDI的比值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量來進(jìn)行半定量分析. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 所得數(shù)據(jù)用xs表示，應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（Oneway ANOVA）和LSDt檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1Jurkat細(xì)胞RAG1, RAG2 mRNA的表達(dá)在Jurkat細(xì)胞中同時(shí)檢測(cè)到RAG1 和RAG2 mRNA 表達(dá)（圖1）. 1: RAG1; 2: RAG2; M: 核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000. 圖1Jurkat細(xì)胞RAG1和RAG2 mRNA表達(dá) 2.2T細(xì)胞激活劑對(duì)Jurkat 細(xì)胞RAGs mRNA表達(dá)的影響對(duì)照6, 12 h 組細(xì)胞RAG1, RAG2 mRNA表達(dá)量無顯著性變化，而三種T細(xì)胞激活劑刺激誘導(dǎo)后RAG1 mRNA表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P<0.05），以PMA+A23187組降低最為明顯；同一處理因素作用12 h組的細(xì)胞RAG1 mRNA

15、表達(dá)量都低于作用6 h組（P<0.05）；PHA作用組RAG2表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），PMA+A23187處理組未檢測(cè)出RAG2 mRNA的表達(dá)；而抗CD3 mAb處理組中，作用12 h組RAG2 mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05，圖2）. 3討論 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，代表T細(xì)胞發(fā)育成熟階段的Jurkat細(xì)胞同時(shí)表達(dá)RAG1和RAG2 mRNA，RTPCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明與Gene Bank報(bào)道序列完全一致. Jurkat細(xì)胞經(jīng)T細(xì)胞激活劑誘導(dǎo)后RAGs表達(dá)水平發(fā)生變化. 結(jié)果提示Jurkat細(xì)胞有發(fā)生TCR重排的可能，且其RAGs的表達(dá)可能經(jīng)TCR信號(hào)傳導(dǎo)

16、通路調(diào)節(jié). 進(jìn)一步證實(shí)：已經(jīng)具有功能性抗原受體的淋巴細(xì)胞也可表達(dá)RAGs ，即在某些情形下TCR的存在并不足以中止RAGs的表達(dá). A: RAG1與actin; B: RAG2與actin. 1,3,5,7: 分別是PHA，抗CD3 mAb, PMA+A23187和對(duì)照 6 h組; 2,4,6,8: 分別是相應(yīng)各12 h組; M: 核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000. 圖2不同處理因素對(duì)RAG1, RAG2 mRNA 作用的RTPCR產(chǎn)物電泳圖 在體外用抗CD3抗體作用于小鼠胸腺皮質(zhì)雙陽性細(xì)胞引起TCRCD3復(fù)合體交聯(lián)，或用PMA和鈣離子載體處理小鼠胸腺皮質(zhì)細(xì)胞和未成熟preT細(xì)胞株CCRFCEM后導(dǎo)

17、致RAG1和RAG2表達(dá)下調(diào)，且PMA引起的RAGs表達(dá)下調(diào)作用更為迅速而顯著4-5. 我們以PHA, PMA+A23187作用于成熟T細(xì)胞株Jurkat后RAGs基因表達(dá)亦呈下調(diào)趨勢(shì)，尤以PMA+A23187作用最為明顯. 但抗CD3 mAb作用組Jurkat細(xì)胞RAG1表達(dá)下調(diào)，而RAG2表達(dá)增加，與中樞或未成熟前T細(xì)胞株誘導(dǎo)后的變化有所不同，可能反映了中樞T細(xì)胞和前T細(xì)胞與外周T細(xì)胞在RAGs表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制上的不同，有可能RAG2更多地參與了Jurkat細(xì)胞TCRCD3復(fù)合體的信號(hào)傳導(dǎo)過程. RAGs的表達(dá)和調(diào)節(jié)是一個(gè)高度復(fù)雜而有序的過程，RAG蛋白的正確時(shí)空特異性表達(dá)對(duì)獲得性免疫系統(tǒng)的正

18、常發(fā)育至關(guān)重要. 經(jīng)典的免疫學(xué)理論認(rèn)為，T細(xì)胞遷出胸腺后不再表達(dá)RAGs和發(fā)生重排. 但近年的研究表明，經(jīng)重排形成的TCR在特定條件下還可發(fā)生再次重排，使其原有的抗原特異性改變或發(fā)生親和力的變化，這種現(xiàn)象被稱為受體編輯/修正6-8. 外周T淋巴細(xì)胞RAGs的表達(dá)調(diào)節(jié)和V(D)J重排機(jī)制與自身免疫病、腫瘤和免疫缺陷等疾病關(guān)系的研究已成為熱點(diǎn)，國(guó)外一些實(shí)驗(yàn)室主要利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型技術(shù)進(jìn)行研究. 基于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及Jurkat細(xì)胞是代表T細(xì)胞發(fā)育成熟階段的單克隆細(xì)胞株的特點(diǎn)，我們考慮可利用Jurkat細(xì)胞株建立一個(gè)研究外周成熟T淋巴細(xì)胞RAGs的表達(dá)調(diào)節(jié)和V(D)J重排的細(xì)胞模型，可彌補(bǔ)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模

19、型研究成本和技術(shù)要求高等不足之處，便于我們?cè)诂F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件下開展此方面的研究. 【參考文獻(xiàn)】 1 Raul M, Frederick WA. Receptor revision in T cell: an open questionJ? TRENDS Immunol, 2004,25:276-279. 2 Lantelme E, Mantovani S, Palermo B, et al. Increased frequency of RAGexpression, CD4+CD3low peripheral T lymphocytes in patients with defective responses to DNA damageJ. Eur J Immunol, 2000,30:1520-1525. 3 Lantelme E, Palermo B, Granziero L, et al. RAG gene expression and V(D)J recombination in CD4+CD3low mature T lymphocytesJ. J Immunol, 2000,164:3455-3459. 4 Laurence A, Turka, Schatz DG, et al. T