Twist蛋白EcadherinVEGF在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)

1、Twist蛋白、E-cadherin、VEGF在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá) 作者：趙杰,楊春雨，王麗華，孟海，李春宏，高志安【摘要】 目的 研究轉(zhuǎn)錄因子Twist蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）中的表達(dá)及其通過對(duì)上皮型鈣黏附蛋白（E-cadherin）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的作用在判斷腫瘤的生物學(xué)行為方面的意義。方法 采用SP免疫組化方法檢測(cè)了54 例ESCC組織（20 例癌旁組織作為對(duì)照）中Twist的表達(dá)。結(jié)果 Twist蛋白陽性表達(dá)率（70.1%）明顯高于癌旁組織（15%），（P = 0.000）；Twist在有外膜浸潤(rùn)的病例中陽性表達(dá)率明顯高于無外膜浸潤(rùn)的病例；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的

2、陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；在TNM分期期中的陽性表達(dá)率明顯高于在期中的陽性表達(dá)率(P0.05）；Twist蛋白表達(dá)與ECadherin存在明顯負(fù)相關(guān)（r=0.401, P =0.003）；與VEGF存在明顯正相關(guān)關(guān)系（r=0.526, P = 0.000）。結(jié)論 Twist蛋白在ESCC中過度表達(dá)，可能通過分別上調(diào)和下調(diào)VEGF、E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而在ESCC的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。 【關(guān)鍵詞】 食管鱗狀細(xì)胞癌; Twist；E-cadherin；VEGF；免疫組織化學(xué)Abstract：Objective To investigate the expression

3、of Twist protein in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) and the significance in determining the biological behaviors of the tumor by its function on E-cadherin (E-cad) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Methods Twist，E-cad and VEGF proteins expression were detected by SP immunohist

4、ochemistry method in 54 cases of ESCC（controlled with 20 cases of paraneoplastic tissue specimens）.Results The positive rate of Twist protein was higher in ESCC (70.1) than that in paraneoplastic tissues (15%,P=0.000）.The expression of Twist protein in the groups of adventitia invasion，lymph node me

5、tastasis and stage were significantly higher than that in the groups of non-adventitia invasion, non-lymph node metastasis and stagerespectively (P0.05). Negative correlation was obtained between the expression of Twist and E-cad proteins (r=0.401, P=0.003), while positive correlation was gained bet

6、ween the expression of Twist and VEGF proteins (r=0.526, P=0.000）. Conclusions The over-expression of Twist protein in ESCC might play an important role in the invasiveness and metastasis of the tumor by down-regulating the expression of E-cadherin and up-regulating the expression of VEGF. Key words

7、:esophageal squamous cell carcinoma; Twist; E-cadherin; VEGF; immunohistochemistry Twist基因是存在于果蠅、鼠、人等生物體內(nèi)的一種堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子。人Twist基因位于7p21.2,含有2個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，編碼由202個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，屬于堿性螺旋環(huán)狀結(jié)構(gòu)家族中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子之一；近期研究發(fā)現(xiàn)，Twist在抑制腫瘤凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移進(jìn)程中起重要作用1。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)Twist蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）組織中的表達(dá)，并探討Twist與上皮型鈣粘蛋白（Ecadher

8、in）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在ESCC侵襲、轉(zhuǎn)移等方面的作用。 1 材料與方法 1.1 標(biāo)本來源 54例食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和20 例癌旁組織取自2004年1月至2007年1月遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科存檔蠟塊。其中男性49 例，女性5 例，年齡3977 歲；高-中分化39 例，低分化15 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18 例；臨床病理分期采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟2002年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，期38 例，期16 例。標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4微米厚連續(xù)切片。所有患者術(shù)前均未接受放、化療及生物治療。 1.2 試劑與方法 1.2.1 主要試劑 兔抗人Twist多克隆抗體為美國(guó)San

9、ta Crus公司產(chǎn)品, 鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人Ecadherin單克隆抗體及免疫組化試劑盒均購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。 1.2.2 方法 采用免疫組化SP法，按照SP免疫組化試劑盒說明書所示步驟進(jìn)行，切片經(jīng)枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）高壓熱修復(fù)預(yù)處理。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽性組織切片作為陽性對(duì)照。 1.2.3 免疫組化結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) Twist、VEGF、Ecadherin蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。免疫組織化學(xué)結(jié)果采用半定量記分法判定,按陽性著色程度評(píng)分:0分為無著色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。再按陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分:0分為陰性；1分為&l

10、t;10%；2分為11%50%；3分為51%75%；4分為>75%，以兩者乘積判定結(jié)果: 412分定為陽性,4分以下定為陰性。 1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行采用2檢驗(yàn)，Spearman相關(guān)分析。 2 結(jié) 果 2.1 Twist蛋白在ESCC中的表達(dá) Twist蛋白表達(dá)呈棕褐色，定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核，以細(xì)胞質(zhì)為主（見圖1）。54 例癌組織中，陽性38 例，陽性率為70.1%；癌旁組織中Twist陽性3 例，陽性率為15% ，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=18.11， P=0.000)；在有外膜浸潤(rùn)的病例中陽性表達(dá)率明顯高于無外膜浸潤(rùn)的病例（2=5.131,

11、P =0.024）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（2=17.763, P =0.000）；在TNM分期期中的陽性表達(dá)率明顯高于在-期中的陽性表達(dá)率，（2=4.474, P =0.034）；而與患者性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤分化等因素均未顯示相關(guān)性(見表1)。 表1 Twist與ESCC臨床病理特征的關(guān)系臨床 2.2 Ecadherin 、VEGF 在 ESCC中的表達(dá)（見圖2、3）。 Ecadherin陽性表達(dá)以胞膜著色為主, VEGF陽性表達(dá)以胞質(zhì)著色為主,均呈現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒。54例ESCC中, ECadherin的陽性例數(shù)為18 例 ，陽性表達(dá)率為33.33 %

12、，Twist與ECadherin陽性共表達(dá)例數(shù)為8 例, 陰性共表達(dá)例數(shù)為6 例, 兩者之間存在明顯負(fù)相關(guān)（r=0.401，P =0.003）；VEGF的陽性例數(shù)為44 例，表達(dá)率為81.48 % ，Twist與VEGF陽性共表達(dá)例數(shù)為36 例, 陰性共表達(dá)例數(shù)為8 例, 兩者之間存在明顯正相關(guān)（r=0.526, P = 0.000）。 3 討 論 Twist作為果蠅、鼠、人等生物體內(nèi)的一種堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于胎盤、胚胎中胚層有成人的某些中胚層來源的未分化組織1，在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育階段誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用,出生后降至極低水平；近期研究發(fā)現(xiàn)，Twist在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡

13、，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲等方面起重要作用。Raman等2證實(shí)Twist能夠與p53啟動(dòng)子上的一重要反式激活子HOXA5相互作用,并調(diào)節(jié)其活性。Twist通過減少p53的上游調(diào)控子ARF的表達(dá)而影響p53的穩(wěn)定,并且能夠阻止p53翻譯后修飾,如絲氨酸的磷酸化,而這種修飾作用對(duì)p53的激活是不可缺少的。另外,Twist還能夠通過抑制P300介導(dǎo)的乙酰化作用而抑制p53介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄3。Twist在實(shí)體癌包括乳腺癌、甲狀腺乳頭狀癌4、前列腺癌、黑色素瘤等中都過表達(dá)。 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions, EMT)是胚胎發(fā)育階段一種重要的形態(tài)學(xué)特征,也是慢性炎

14、癥和纖維化及腫瘤進(jìn)展中的一個(gè)重要過程。EMT是一個(gè)失去上皮細(xì)胞極性、細(xì)胞與細(xì)胞接觸能力及重塑細(xì)胞骨架, 同時(shí)獲得轉(zhuǎn)移能力的過程。Twist與其他一些基因如snail、slug等能夠誘導(dǎo)EMT，它們的共同特征是含有能識(shí)別靶基因啟動(dòng)子的E-box基序的DNA結(jié)合序列.造成E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，而后者是單次跨膜糖蛋白，能在細(xì)胞與細(xì)胞黏附中以同種分子間“拉鏈?zhǔn)健苯Y(jié)合的形式介導(dǎo)細(xì)胞黏附。E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致其介導(dǎo)的細(xì)胞細(xì)胞黏附功能的削弱或喪失，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶上脫落,侵入周圍組織Rosivatz等5的研究證實(shí),Twist表達(dá)顯著上調(diào)見于浸潤(rùn)性小葉癌、彌散性胃癌等惡性程度高、侵襲

15、性強(qiáng)的腫瘤中,在正常組織和惡性程度低的癌細(xì)胞中呈低水平表達(dá)。 近年來對(duì)腫瘤血管生成的研究表明，血管生成在實(shí)體腫瘤的惡變、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等方面是至關(guān)重要。VEGF被認(rèn)為是最重要的血管生成因子之一，它能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)血管通透性，還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)，介導(dǎo)其遷移和浸潤(rùn)等。最近Yang等6 用鼠的乳腺癌模型顯示, Twist對(duì)癌細(xì)胞的血管內(nèi)滲和肺轉(zhuǎn)移起重要作用,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Twist的表達(dá)后明顯降低肺轉(zhuǎn)移效率和腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)的數(shù)目。在乳腺癌細(xì)胞系中Twist過表達(dá)能誘導(dǎo)血管生成，但機(jī)制尚不清楚。 本研究結(jié)果表明，Twist在ESCC中陽性表達(dá)率為70.1%，在癌旁

16、組織中陽性率為15.0，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=18.11，P =0.000）；Twist在有外膜浸潤(rùn)和無外膜浸潤(rùn)的病例中陽性表達(dá)率分別分89.5%、60%，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=5.131, P =0.024）；Twist在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為88.9%，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為33.3%，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=17.763, P =0.000）；Twist蛋白在TNM分期期、-期中的表達(dá)率分別為93.8%、60.5%，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=4.474, P =0.034），與song7等在鼻咽癌及Lee等在肝癌中關(guān)于Twist基因表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究結(jié)果基本一致8

17、。本研究同時(shí)顯示，Twist蛋白與E-Cadherin存在負(fù)相關(guān)（r=0.401 , P =0.003），而與VEGF存在正相關(guān)（r=0.526, P = 0.000），這一結(jié)果提示Twist蛋白可能通過上游調(diào)控造成E-Cadherin表達(dá)降低或缺失是發(fā)生EMT的關(guān)鍵機(jī)制，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的浸襲力和轉(zhuǎn)移力；同時(shí)Twist蛋白通過VEGF介導(dǎo)的腫瘤血管生成，在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。上述結(jié)果證實(shí)，Twist作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與E-Cadherin、VEGF的聯(lián)合檢測(cè)可較好反應(yīng)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，為指導(dǎo)臨床治療和腫瘤基因治療提供重要的臨床參考價(jià)值。（此文圖1-3見附頁2）【參

18、考文獻(xiàn)】 1 Kang Y, Massague J. Epithelial mesenchymal transitions: twist in development and metastasisJ. Cell,2004,118(3)277-279.2 Stasiopoulos IA, MironchikY, RamanA, et al. HOXA5-twist in-teraction alters p53 homeostasis in breast cancer cellsJ. J BiolChem, 2005, 280(3): 2294-2299. 3 HamamoriY,SartorelliV,OgryskoV,et a1.Regulation of histone acetyltransferases p300 and PCAF by the bHLH protein twist andadenoviral oncoprotein E1A J. Cell，1999, 96(3): 405-413.4 何春年.Twist基因蛋白表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌診斷與鑒別診斷中的意義J.中華病理學(xué)雜志，2008,37（1）：3539.5 Rosiva