cmyccfos在良性膽道狹窄瘢痕組織中的表達(dá)及意義

1、c-myc、c-fos在良性膽道狹窄瘢痕組織中的表達(dá)及意義【摘要】 目的 探討原癌基因c-myc、c-fos與良性膽道狹窄形成的相關(guān)性。進(jìn)一步闡明良性膽道狹窄中膽管瘢痕的發(fā)生機(jī)制。方法 應(yīng)用免疫組化SP法，檢測(cè)c-myc、c-fos蛋白在肝內(nèi)、外膽管瘢痕組織中的表達(dá)和分布。對(duì)其陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果 肝內(nèi)、外膽管瘢痕組織的成纖維細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中c-myc、c-fos呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而正常膽管組織中缺乏表達(dá)。結(jié)論 肝內(nèi)、外膽管瘢痕組織中c-myc和c-fos癌基因受激活，可能參與了成纖維細(xì)胞的分化增殖、膠原合成與降解以及對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)控，并導(dǎo)致瘢痕增生。原癌基因c-myc

2、、c-fos與良性膽道狹窄瘢痕形成密切相關(guān)。c-myc與c-fos蛋白兩者的表達(dá)成正相關(guān)，兩者具有協(xié)同性。 【關(guān)鍵詞】 原癌基因c-myc 原癌基因c-fos 良性膽管狹窄 膽管瘢痕 Expression of c-myc、c-fos in scartissue of benign biliary stricture and correlation investigation LU Hui，ZHANG Xiao-wen,LIU Wen-yong.Department of Surgery,Fengcheng Hospital,Shanghai 201411,China 【Abstract】 O

3、bjective To observe the expression and distribution of c-myc and c-fos in biliary scar tissue, to investigate the correlation between expression of key pro-oncogenes and benign biliary stricture. Methods Immunohistochemical technique was used to detect the expression and distribution of c-myc、c-fos

4、proteins on extrahepatic bile duct scar tissue、intrahepatic bile duct scar tissue and normal bile duct tissue. Results c-myc and c-fos expression on the nucleus of fibroblast、epithelial cell and endothelial cell of biliary scar tissues were significantly higher than normal biliary tissue. And there

5、was obviously difference between scar tissue and normal tissue.Conclusion c-myc and c-fos oncogenes are activated on biliary scar tissues,which may contribute to proliferation and differentiation of fibroblasts、synthesis and degradation of collagen and regulation of cytokines and induce abnormal sca

6、rring.There was close corralation between c-myc、c-fos proto-oncogenes and benign biliary stricture scar tissue.there were positive correlations and co-operativity between c-myc and c-fos expression. 【Key words】 proto-oncogenes c-myc；proto-oncogenes c-fos；benign biliary stricture；bile duct scar 膽道狹窄一

7、直是膽道外科領(lǐng)域中病變復(fù)雜處理困難的課題。 近來一些研究表明， 部分原癌基因在組織再生等過程中常被激活， 可能通過調(diào)控某些細(xì)胞因子來控制病理性瘢痕增生。 但對(duì)于在膽道瘢痕的形成過程中,原癌基因是否參與調(diào)控及表達(dá)尚不清楚。 本研究探討了肝內(nèi)、 外膽管瘢痕組織中c-myc和c-fos蛋白的表達(dá)及c-myc、 c-fos的表達(dá)與膽管瘢痕形成的相關(guān)性。 試從分子水平來了解良性膽道狹窄形成機(jī)制， 為臨床防治膽管瘢痕提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 標(biāo)本來源 收集昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2000年1月2005年6月，手術(shù)治療經(jīng)病理科證實(shí)的肝外狹窄膽管瘢痕標(biāo)本20例，其中男12例，女8例。肝內(nèi)狹窄膽管瘢

8、痕標(biāo)本12例。正常膽管組織取自肝移植供體的肝外膽管6例，意外死亡的健康成人肝外膽管4例,共10例。 1.2 c-myc和c-fos蛋白表達(dá)的檢測(cè) 免疫組化采用SP法。標(biāo)本全部用10%甲醛溶液固定,石蠟包埋后連續(xù)切片，片厚5。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、H2O2室溫滅活內(nèi)源性酶、修復(fù)抗原、正常血清封閉、滴加一抗、4過夜、DAB顯色、蘇木素襯染、脫水、透明、封片等處理。工作濃度：c-myc1：50、c-fos1：50。鼠抗人c-myc單克隆抗體、鼠抗人c-fos單克隆抗體及免疫組化法染色試劑購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司產(chǎn)品。以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液（pH 7.4）代替一抗作為每一次染色的陰性對(duì)照。

9、 1.3 結(jié)果判斷 參照1996年全國(guó)免疫組織化學(xué)技術(shù)與診斷標(biāo)準(zhǔn)化專題研討會(huì)意見：細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)見淡黃色顆粒明顯高于背景色為陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):c-myc、c-fos 主要以細(xì)胞核染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞的著色強(qiáng)度可分為以下級(jí)數(shù):“-”為陰性細(xì)胞;“+”為細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)染成淡棕黃色;“+” 為深棕黃色;“+”則介于兩者之間。每例標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)高倍（100倍）視野觀察和計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞,計(jì)算出平均值。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中Kruskal-Wallis Test和Man-Whitney Test 進(jìn)行多組間的比較。=

10、0.05,P<0.05表示兩組差異有顯著性。采用Spearman相關(guān)分析進(jìn)行c-myc和c-fos表達(dá)關(guān)系的分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 10.0軟件系統(tǒng),計(jì)算機(jī)處理。 2 結(jié)果 2.1 形態(tài)學(xué)觀察 正常膽管組織c-myc蛋白無表達(dá)或極少量表達(dá),淡染。在肝內(nèi)、外膽管瘢痕組織中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中少量弱陽(yáng)性表達(dá)，在膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、增生的成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中均有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(見圖1、2)，兩者的分布較一致，陰性對(duì)照片不著色。c-fos蛋白陽(yáng)性分布與c-myc蛋白較一致 (見圖3、4)。 2.2 組織切片c-myc

11、、c-fos蛋白定量分析 每張組織切片在高倍鏡下（×100）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)c-myc、c-fos蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出平均值。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩指標(biāo)中，肝內(nèi)、外膽管瘢痕組織表達(dá)均較高，正常膽管組織表達(dá)最弱。經(jīng)兩兩比較，肝內(nèi)、外膽管瘢痕組間差異無顯著性(P>0.05)，而兩組與正常膽管對(duì)照組比較差異均有非常顯著性(P<0.01）,見表1。 表1 各組中c-myc、c-fos蛋白定量分析結(jié)果 注：與正常膽管對(duì)照組比較，*P<0.01 2.3 c-myc與c-fos蛋白表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析表明：在肝外膽管瘢痕組中c

12、-myc與c-fos蛋白兩者的表達(dá)成正相關(guān)(r=0.75,P<0.05)。在肝內(nèi)膽管瘢痕組中c-myc與c-fos蛋白兩者的表達(dá)亦成正相關(guān)(r = 0.68,P<0.05)。即在c-myc蛋白高表達(dá)的同一病變組織中，c-fos蛋白亦為高表達(dá)；c-myc蛋白低表達(dá)的同一病變組織中，c-fos蛋白亦為低表達(dá)。見圖5、6。圖5 肝外膽管瘢痕組中c-myc與c-fos3 討論 良性膽道狹窄指因各種非腫瘤性病變致膽管纖維性狹窄（膽總管直徑小于0.5cm，左右肝管直徑小于0.3cm），引起黃疸、膽絞痛或膽管炎。本試驗(yàn)中所采用的病變組標(biāo)本主要來源于兩種情況：（1）炎癥性膽管狹窄；

13、（2）損傷性膽管狹窄。并按部位分成肝外膽管瘢痕及肝內(nèi)膽管瘢痕。 目前在燒傷、整形中對(duì)病理性瘢痕的研究成果表明原癌基因的表達(dá)可能通過調(diào)控某些細(xì)胞因子來控制病理性瘢痕增生。膽管瘢痕狹窄是由于病理性瘢痕增生引起，對(duì)良性膽道狹窄的相關(guān)基因的研究，國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。 筆者的研究結(jié)果表明：c-myc、c-fos蛋白在肝內(nèi)外膽管瘢痕組織的膽管上皮細(xì)胞、增生的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及一些炎癥細(xì)胞中均有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中少量弱陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組表達(dá)較弱，甚至無表達(dá)。說明原癌基因c-myc、c-fos與膽管瘢痕形成有密切的關(guān)系。膽管瘢痕組織中有慢性炎癥的持續(xù)存在、局部組織血供不良及膠原纖維過度

14、沉積，改建較差等。膽汁中的膽鹽、卵磷脂，膽腸吻合后的腸液反流會(huì)引起CD68(巨噬細(xì)胞)的高表達(dá)，巨噬細(xì)胞釋放促纖維生長(zhǎng)因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1、血小板衍化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等和酶類包括膠原酶、彈性蛋白酶、纖溶酶原激活物等參與對(duì)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的調(diào)節(jié)。以上各種刺激引起c-myc原癌基因表達(dá)后，可以促進(jìn)細(xì)胞由靜止期（G0期）而進(jìn)入分裂期（S期）促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖。c-myc原癌基因表達(dá)的蛋白定位于核內(nèi)，與某些癌基因協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，最終使細(xì)胞進(jìn)入S期。c-myc基因參與了此過程并起重要作用。尤其是細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期的過程。c-myc原癌基因表達(dá)與多種生長(zhǎng)因子在調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)方面有相互影響的

15、作用，它們相互協(xié)調(diào)控制，共同作用影響組織的修復(fù)增生14。在正常的膽管組織中，c-fos基因僅呈極低水平表達(dá)。但在異常的情況下，如膽管組織的炎癥、局部缺氧及膽汁中的膽鹽等因素的刺激，c-fos能迅速表達(dá)，其編碼的細(xì)胞核磷酸蛋白具有結(jié)合活性,被看作是細(xì)胞核內(nèi)的“第三信使”。c-fos能使細(xì)胞由G0期啟動(dòng)而進(jìn)入細(xì)胞周期。在細(xì)胞周期中,細(xì)胞周期蛋白與相應(yīng)的細(xì)胞周期依賴蛋白激酶結(jié)合,經(jīng)磷酸化/脫磷酸化修飾后具有活性,促使與周期有關(guān)的蛋白基因如fos等IEGs表達(dá),控制細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而促進(jìn)膽管組織中成纖維細(xì)胞等的增殖與合成。 在組織修復(fù)過程中，c-myc、c-fos和某些相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)存在相互的網(wǎng)

16、絡(luò)調(diào)控作用，并由此影響修復(fù)細(xì)胞的增殖與分化。以往的研究表明巨噬細(xì)胞、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1高表達(dá)是造成膽道愈合過程成纖維細(xì)胞增殖旺盛、細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積、瘢痕增生的重要因素。本文的試驗(yàn)也表明，c-myc和c-fos蛋白表達(dá)的細(xì)胞定位、陽(yáng)性信號(hào)形態(tài)及強(qiáng)度較多相似。通過Spearman相關(guān)分析表明兩者成正相關(guān)關(guān)系，說明兩者在促進(jìn)瘢痕形成的過程中是相互協(xié)同作用的。c-myc和c-fos的激活和協(xié)同作用可能參與了成纖維細(xì)胞的增殖甚至表型的轉(zhuǎn)化，或膠原合成與降解及細(xì)胞因子的調(diào)控過程5。并導(dǎo)致異常的瘢痕增生。c-myc和c-fos蛋白的高表達(dá)與良性膽管狹窄的瘢痕組織纖維化的發(fā)生有著密切的關(guān)系。而c-myc和c-

17、fos原癌基因受激活，可能參與了對(duì)細(xì)胞因子活動(dòng)的調(diào)控，原癌基因與細(xì)胞因子之間的確切關(guān)系,有待于我們進(jìn)一步的探索和研究。【參考文獻(xiàn)】 1 Ghosh M, Liu G, Randall G. Transcription factor binding and induced transcription alter chromosomal c-myc replicator activity. Mol Cell Biol. 2004,24(23):10193-10207.2 Lepique AP, Moraes MS, Rocha KM. C-myc protein is stabilized by fibroblast growth factor 2 and destabilized by ACTH to control cell cycle in mouse Y1 adrenocortical cells. J Mol Endocrinol, 2004, 33(3):623-638.3 Jang MH, Jung SB, Lee MH,et al. Influence of maternal alcohol administration on c-fos expression in the hippocampus of infant rats. Neuros