動物細胞凍存、解凍方法與細胞計數

1、細胞凍存、解凍方法與細胞計數 一、細胞冷凍保存1、材料:生長良好之培養(yǎng)細胞、新鮮培養(yǎng)基、二甲基亞砜 (DMSO(Sigma D-2650 、 無 菌 塑 料 冷 凍 保 存 管 (Nalgene 5000-0020 、 0.4%(w/v trypan blue (GibcoBRL15250-061 、 血球計數盤與蓋玻片、 等速降溫機 (KRYO10SeriesII 。 2、冷凍保存方法:(1傳統(tǒng)方法:冷存管置于 4 10分鐘 -20 30分鐘 -80 1618小時 (或隔夜液氮槽 vaporphase 長期儲存。 -20不可超過 1小時,以防止冰晶 過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接

2、放入 -80冰箱中,惟存活率稍 微降低一些。(2程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以 -1-3 /分鐘之速度由室溫 降至(-80以下 -120,再放在液氮槽 vaporphase 長期儲存。適用于懸浮型 細胞與 hybridoma 之保存。3、步驟:(1冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細胞生長情形。(2配制冷凍保存溶液(使用前配制 :將 DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中,最后 濃度為 510%,混合均勻,置于室溫下待用。(3 依細胞繼代培養(yǎng)之操作, 收集培養(yǎng)之細胞, 取少量細胞懸浮液 (約 0.1ml 計數細胞濃度及凍前存活率。(4離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細胞濃度為 15&

3、#215;106cells/ml,混合均勻,分裝于已標示完全之冷凍保存管中, 1ml/vial,并取少量 細胞懸浮液作污染檢測。4、注意事項:(1欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase 且存活率高之狀態(tài),約為 80 90%致密度。(2冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質,例如 hybridoma 應在冷凍保存 前一至二日測試是否有抗體之產生。(3注意冷凍保護劑之品質。 DMSO 應為試劑級等級,無菌且無色(以 0.22micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產品,如 Sigma D-2650 ,以 510ml 小體積分裝, 4避光保存, 勿作多次解凍。 Glycero

4、l 亦應為試劑級等級, 以高壓蒸汽滅菌后避光保存。 在開啟后一年內使用, 因長期儲存后對細胞會有毒 性。(4冷凍保存之細胞濃度: normal human fibroblast(正常人類成纖維細胞 :13×106cells/ml hybridoma(雜交瘤細胞 :13×106cells/ml,細胞濃度不要太高,某些 hybridoma 會因冷凍濃度太高而在解凍 24小時后死去。 adherent tumor lines(腫 瘤 系 細 胞 :57×106, 依 細 胞 種 類 而 異 。 Adenocarcinoma(腺癌 解凍后須較高之濃度,而 HeLa 只需

5、13×106cells/ml other suspensions(懸浮 :510×106cells/ml, human lymphocyte(人類淋巴 細胞 須至少 5×106cells/ml。(5冷凍保護劑濃度為 5%或 10%DMSO ,若是不確定細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個 backup culture(備用培養(yǎng) ,以防止冷凍失敗。 注 :二甲基亞砜是一種重要的滲透型細胞保護劑。在深低溫(零下 200度保存細胞時凍存過程中,為防止細胞內液冰晶形成、滲透壓改變、細胞 結構紊亂等導致的損傷,有必要使用含有 DMSO 冷凍保護劑。 DMSO 能夠

6、快 速穿透細胞膜進入細胞中,降低冰點、延緩凍存過程,同時提高細胞內離子 濃度,減少細胞內冰晶的形成,從而減少細胞損傷。深低溫時二甲基亞砜的 細胞毒性受到抑制。復蘇時動作要快,盡快洗掉二甲基亞砜,否則會造成對 細胞嚴重的毒性。二甲基亞砜(DMSO 是目前最好的細胞凍存保護劑,但 也是一種以細胞毒性很大的化學試驗劑。研究結果表明,培養(yǎng)液中 DMSO 濃 度為 10%時, 細胞生長抑制率近 100%; 1 濃度時抑制率為 35%, 即使是 0.04 的濃度, DMSO 對細胞的生長也有不利的影響。二、冷凍細胞活化1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害, 導致細胞之死亡。

7、2、細胞活化后,約需數日,或繼代一至二代,其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復 正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質 。3、材料 :37恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管 /離心管 /培養(yǎng)瓶、液氮或干冰 容器 。4、步驟:(1操作人員應戴防護面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。(2自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過 程,此時蓋子易松掉。(3將新鮮培養(yǎng)基置于 37水槽中回溫,回溫后噴以 70%酒精并擦拭之,移 入無菌操作臺內。(4取出冷凍管,立即放入 37水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1分鐘 內全部融化,以 70%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內。(5取出解凍之細胞懸浮

8、液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(稀釋比例為 1:101:15 ,混合均勻,放入 CO 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取 0.1ml 解凍細胞懸浮液作 存活測試。(6解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如 DMSO 或 glycerol ,依細胞種類 而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除,則將解凍 之細胞懸浮液加入含有 5-10ml 培養(yǎng)基之離心管內, 離心 1000rpm , 5分鐘, 移去 上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入 CO 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(7若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。三、細胞計數與存活測試1、原理:(1計算細胞數目可用血球計數盤或是 Coult

9、ercounter 粒子計數器自動計數。(2血球計數盤一般有二個 chambers ,每個 chamber 中細刻 9個 1mm 2大正 方形,其中 4個角落之正方形再細刻 16個小格,深度均為 0.1mm 。當 chamber 上方蓋上蓋玻片后, 每個大正方形之體積為 1mm 2×0.1mm=1.0x10-4ml 。 使用時,計數每個大正方形內之細胞數目,乘以稀釋倍數,再乘以 104,即為每 ml 中之 細胞數目。(3 存活測試之步驟為 dyeexclusion , 利用染料會滲入死細胞中而呈色, 而活 細胞因細胞膜完整, 染料無法滲入而不會呈色。 一般使用藍色之 trypan b

10、lue染料, 如果細胞不易吸收 trypan blue,則用紅色之 Erythrosin bluish。2、材料:0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061 ; Erythosin bluish stain; 取 0.1gram Erythrosin bluish (SigmaE-9259 及 0.05gram preservative methyl paraben (SigmaH-3647 溶 于 100mlCa+/Mg+freesaline; 血 球 計 數 盤 及 蓋 玻 片 (Hemocytometerandcoverslip ;計數器(counter

11、;低倍倒立顯微鏡;粒子計數 器(Coultercounter,CoulterElectronics 。3、步驟:(1取 50l 細胞懸浮液與 50l trypan blue(臺盼藍 (orErythrosinbluish 等 體積混合均勻于 1.5ml 小離心管中。(2取少許混合液 (約 15l 自血球計數盤 chamber 上方凹槽加入,蓋上蓋玻 片,于 100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色(或紅色 -Erythrosin bluish 。(3計數四個大方格之細胞總數,再除 4,乘以稀釋倍數(至少乘以 2,因與 trypanblue 等體積混合 ,最后乘以 104,即為每 ml 中細胞懸浮液之細胞數。若 細胞位于線上,只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞 。注:4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數 /ml;每一大格的體積 =0.1cm×0.1cm ×0.01cm=10-4ml4、范例:T75 monolayer culture 制成 10ml 細胞懸浮液,取 0.1ml 溶液與 0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中, 取少許混合液加入血球計數盤, 計數四大方格內之細胞 數目?；罴毎麛?/方格:55