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文檔簡介

1、雙縮脲法測定血清總蛋白的方法學(xué)評價摘要:目的 評價雙縮脲法測定血清總蛋白的方法性能。方法 配制雙縮脲試劑,并用所配雙縮脲試劑和標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗、回收試驗、線性范圍測定。結(jié)果 雙縮脲法測定血清總蛋白的批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)CV%為6.42,回收試驗平均回收率為109.3%,線性范圍測定的R²為0.9877。結(jié)論 雙縮脲法測定血清總蛋白的性能不高,本人測得的批內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)CV%偏大,回收率偏高,線性范圍一般,或許這是個人操作因數(shù),因為還有其他同學(xué)的結(jié)果比較好的。關(guān)鍵詞:雙縮脲法;血清總蛋白;方法學(xué)評價雙縮脲法測定血清總蛋白至今已經(jīng)有近100年的歷史,其間該方法也

2、得到不斷改進(jìn),是目前測定血清總蛋白的常用方法之一。全國臨床檢驗操作規(guī)程推薦Doumas雙縮脲配方作為血清總蛋白測定的常規(guī)方法1。方法學(xué)評價對于醫(yī)學(xué)檢驗專業(yè)學(xué)生日后在工作中評價檢驗方法非常重要,對培養(yǎng)學(xué)生邏輯思維和實驗室質(zhì)量控制具有重要作用。本文介紹雙縮脲法測定血清總蛋白的方法學(xué)評價,對學(xué)生練習(xí)和掌握方法學(xué)評價有重要意義。雙縮脲試劑鑒定蛋白質(zhì)的原理:雙縮脲(NH2CONHCONH2)是兩個分子脲經(jīng)180左右加熱,放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與二價銅離子形成紫色絡(luò)合物,稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵,或能過一個中間碳原子相連的肽鍵,這類化合物都有雙縮脲反

3、應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵,因此,也能在堿性環(huán)境中與二價銅離子結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)不需要加熱,被用來定性鑒定蛋白質(zhì)。但請注意:凡含有2個以上肽鍵的物質(zhì)或含有1個肽鍵和1個一CSNH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì),以及乙二酰乙二胺都有此顏色反應(yīng)。因此,一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽均有雙縮脲反應(yīng),但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽2。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān),故可用來測定蛋白質(zhì)含量。干擾這一測定的物質(zhì)主要有:硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速 ,不同的蛋白

4、質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近,以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差,不適合微量蛋白的測定。1. 儀器與試劑1.1 儀器721型分光光度計;水浴箱。1.2 試劑 牛血清白蛋白;硫酸銅結(jié)晶(CuSO45H2O);酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O64H2O);氫氧化鈉(NaOH);碘化鉀(KI);蒸餾水。2. 雙縮脲的配制2.1 稱取6g NaOH溶于新鮮制備的25 ml蒸餾水中,配成6mol/L氫氧化鈉溶液。稱取0.75 g硫酸銅,2.25 g酒石酸鉀鈉,1.25 g碘化鉀依次溶解于125 ml蒸餾水中在攪拌下加人6mol/L氫氧化鈉溶液25 ml,用蒸餾水定容至250 ml。配好的雙縮脲試劑應(yīng)貯存于塑料瓶中

5、(或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存,若瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)則衙重配。2.2 通常加入碘化鉀可以防止銅離子自動還原形成一價氧化銅沉淀。在配制雙縮脲試劑過程中,進(jìn)行兩種不同加試劑順序,如下順序1:硫酸銅酒石酸鉀鈉碘化鉀氫氧化鈉順序2:硫酸銅碘化鉀酒石酸鉀鈉氫氧化鈉這兩種順序的區(qū)別是加酒石酸鉀鈉和加碘化鉀的順序不同,“順序1”在加完酒石酸鉀鈉后溶液是青藍(lán)色的(如圖1左),“順序2”在加完碘化鉀后溶液顏色是褐色的(如圖1右),但兩種順序在加完所有試劑后,顏色都是相同的,都為深藍(lán)色,如圖2。這兩種不同加試劑順序的配制方法,雖然過程不同,過程中顏色變化也不同,但最后的結(jié)果是相同的。 圖1 (左為先加

6、酒石酸鉀鈉) 圖2 (左為先加酒石酸鉀鈉)3. 批內(nèi)重復(fù)性試驗3.1 材料 待測樣品、雙縮脲試劑、蒸餾水、721型分光光度計、水浴箱3.2 方法3.2.1 取21支試管放試管架,分別標(biāo)記空白管1支,重復(fù)測定管20支,按表1添加試劑。表1 試劑添加加人物(ml)試劑空白管測定管×20蒸餾水0.06待測樣品0.06雙縮脲試劑333.2.2 渦旋混勻后,37水浴10分鐘,在波長540nm條件下比色,空白管調(diào)零,用分光光度計測定各管吸光度。3.2.3 計算待測樣品的標(biāo)準(zhǔn)差S和變異系數(shù)CV%值。3.3 結(jié)果 結(jié)果記錄表2 20個測定管的吸光度值試管號吸光度試管號吸光度試管號吸光度試管號吸光度1

7、0.12160.12110.14160.1420.13170.123120.14170.14430.1480.128130.139180.13940.12990.12140.146190.14250.139100.125150.139200.139 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果處理計算公式標(biāo)準(zhǔn)差,變異系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差s=0.0086,變異系數(shù)CV%=6.423.4 討論評價 3.4.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗測得數(shù)據(jù)的CV%=6.42,CV%值比較大,超過4.0,說明測定的精密度比較低。原因可能有以下幾點:實驗中使用的分光光度計比較老舊,一直性能不穩(wěn)定,多位同學(xué)使用后都表示結(jié)果不太好。使用的加樣槍很多都老化了,不好用

8、,導(dǎo)致封密性不強(qiáng),實驗誤差大。個人加樣誤差,在一些關(guān)鍵試劑上加樣可能有誤差。所使用的比色杯經(jīng)過多次使用,比色杯壁里遺留一些有色物質(zhì),影響了測量結(jié)果。3.4.2 通過10位同學(xué)結(jié)果的比較,如表3,有五位同學(xué)的結(jié)果小于4,另五個同學(xué)的結(jié)果大于4,最大的CV值是本人測得,說明本人的結(jié)果比較差,雙縮脲法測定血清總蛋白的精密度不算太好。表3 10位同學(xué)結(jié)果的比較均值標(biāo)準(zhǔn)差s變異系數(shù)CV%本人0.13420.00866.42同學(xué)10.13530.00533.94同學(xué)20.12070.00393.24同學(xué)30.14030.00483.45同學(xué)40.14140.00412.89同學(xué)50.14990.00553

9、.66同學(xué)60.15420.00855.35同學(xué)70.11090.00534.81同學(xué)80.14610.00785.33同學(xué)90.13080.00665.054. 回收試驗4.1 回收試驗原理回收試驗是反映分析方法準(zhǔn)確測定加入樣品中已知濃度或量的純分析物能力的試驗,是評價方法準(zhǔn)確度的有效方法?;厥赵囼灴捎行Х从撤椒ǖ谋壤到y(tǒng)誤差,也可反映方法的競爭性干擾。本實驗通過雙縮脲法測定蒸餾水中加入的蛋白質(zhì)的回收率,判斷雙縮脲法比例系統(tǒng)誤差的大小,從而評價方法的準(zhǔn)確性。4.2 回收樣品制備表4基礎(chǔ)樣品回收樣品1回收樣品2回收樣品3待測樣品0.15mL0.15mL0.15mL0.15mL150g/l蛋白0

10、.05mL0.1mL0.15mL蒸餾水0.15mL0.1mL0.05mL4.3 蛋白質(zhì)濃度測定 蛋白質(zhì)濃度測定的加樣,如表5表5 試劑(mL)空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管蒸餾水0.06150g/l蛋白溶液0.06樣品0.06雙縮脲試劑333注:空白管和樣品管各做一管,樣品管每個樣品做2管取平均值,共計1+1+2+2+2+2=10管。4.3.2 渦旋混勻后,37水浴10分鐘,在波長540nm條件下比色,空白管調(diào)零,用分光光度計測定各管吸光度。4.4 結(jié)果 結(jié)果記錄表6 蛋白質(zhì)濃度測定的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)管基礎(chǔ)管樣品管1樣品管2樣品管3吸光度0.3100.0490.0500.1000.1090.1530.1690

11、.2330.229平均值0.3100.0500.1050.1610.231 結(jié)果計算加入濃度(g/L)=150×(回收樣品中加入的150g/L蛋白溶液體積/0.3)回收濃度=回收樣品測得能濃度基礎(chǔ)樣品測得濃度回收率=(回收濃度/加入濃度)×100%表7 樣品回收回收樣品1回收樣品2回收樣品3加入濃度(g/L)255075回收濃度(g/L)25.953.787.6回收率1.0361.0741.168平均回收率1.093標(biāo)準(zhǔn)偏差0.068CV%6.219 回收試驗評價一般要求回收率在95%105%,最為理想的回收率為100%,本實驗測得的平均回收率為109.3%>105%

12、,根據(jù)10名同學(xué)平均回收率的比較(如表8,圖3是10名同學(xué)平均回收率的散點圖),有5名同學(xué)的平均回收率在95%105%之間,另五名同學(xué)的平均回收率不在95%105%之間,說明本人的所測得的結(jié)果準(zhǔn)確度不高;雙縮脲法測定血清總蛋白的準(zhǔn)確度也不太高。距離理想的準(zhǔn)確度有點距離。表8 10名同學(xué)樣品回收結(jié)果比較平均回收率1.0930.9640.9250.9931.0661.0901.0271.0590.9971.050標(biāo)準(zhǔn)偏差0.0680.0550.0220.0160.0380.0630.0230.0520.0350.030CV%6.2195.6532.3391.5623.5735.7682.2714.

13、8823.5002.882 圖3 10名同學(xué)平均回收率的散點圖5. 線性范圍評價試驗5.1 線性范圍原理使用不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定各自的吸光度,以蛋白濃度為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo)作圖,繪制劑量反應(yīng)曲線,計算雙縮脲法的線性關(guān)系方程及相關(guān)系數(shù)。5.2 試劑和儀器 150 g/L 蛋白溶液;雙縮脲試劑;蒸餾水;分光光度計;水浴箱5.3 實驗操作5.3.1 樣品制備(樣品2-8用樣品1加相應(yīng)體積蒸餾水配制)檢測樣品1: 150 g/L 蛋白溶液0.2mL 檢測樣品2 :125 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測樣品3 :100 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測樣品4 : 75 g/L 蛋白溶液0.2

14、mL檢測樣品5 : 50 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測樣品6 : 25 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測樣品7 : 5 g/L 蛋白溶液0.2mL檢測樣品8 : 1 g/L 蛋白溶液0.2mL5.3.2 加樣和測定表9 加樣試劑(mL)空白管樣品管蒸餾水0.06樣品0.06雙縮脲試劑33注:空白管做一管,8個樣品每個做1管,共計1+8=9管。混勻后37水浴10分鐘或室溫放置30分鐘,540nm波長比色,空白管調(diào)零。5.4 結(jié)果 結(jié)果記錄表10 蛋白樣品吸光度測定結(jié)果蛋白濃度吸光度蛋白濃度吸光度1g/l-0.00475g/l0.1725g/l0.009100g/l0.20625g/l0.0571

15、25g/l0.27250g/l0.121150g/l0.331 繪制劑量反應(yīng)曲線以蛋白濃度為橫坐標(biāo),以各樣品吸光度為縱坐標(biāo)作圖,EXCEL繪制吸光度-蛋白濃度曲線,同時計算線性關(guān)系方程及相關(guān)系數(shù)。 圖4 劑量反應(yīng)曲線 線性評價從劑量反應(yīng)曲線結(jié)果來看,R2=0.9877,R2偏小,這組數(shù)據(jù)的線性范圍偏差一些,但10名同學(xué)測得劑量反應(yīng)曲線的R2值比較,有7名同學(xué)測得的數(shù)據(jù)R2大于0.995,所以雙縮脲法測定血清總蛋白的線性關(guān)系還是比較好的。表11 10名同學(xué)測得劑量反應(yīng)曲線的R2值0.98770.99380.99580.9970.99850.99270.99570.9960.9980.99976. 總結(jié)討論本文介紹雙縮脲法測定血清總蛋白的方法學(xué)評價,經(jīng)過配制雙縮脲試劑,并用所配雙縮脲試劑和標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗、回收試驗、線性范圍測定。在批內(nèi)重復(fù)性試驗,變異系數(shù)CV%為6.42,比較大,10位同學(xué)結(jié)果中,有五位同學(xué)的結(jié)果小于4,另五個同學(xué)的結(jié)果大于4,雙縮脲法測定血清總蛋白的精密度不算太好。在回收試驗中,一般要求回收率在95%105%,本實驗測得的平均回收率為109.3%>105%,10名同學(xué)平均回收率中有5名同學(xué)的平均回收率在95%105%之間,另五名同學(xué)的平均回收率在95%105%之外,說明本人的所測得的結(jié)果準(zhǔn)確度不高;雙縮脲法測定血清總蛋白的準(zhǔn)

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