在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用

1、高分辨率熔解曲線（HRM）在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用Xxx上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院摘要 飽和熒光染料、未標(biāo)記探針與實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)合產(chǎn)生的高分辨率熔解曲線(HRM)是一種新的實(shí)時(shí)定量技術(shù),在檢測速度、靈敏度和準(zhǔn)確性上具有突出的優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)領(lǐng)域中，國際上已有人將其應(yīng)用于基因突變掃描、基因分型和品種鑒定。關(guān)鍵詞 高分辨率熔解曲線，水產(chǎn)，基因突變掃描，基因分型，品種鑒定1.引言高分辨率熔解曲線分析技術(shù)（High Resolution Melting，HRM），是由美國猶他大學(xué)保健科學(xué)中心病理學(xué)部Carl Wittwer實(shí)驗(yàn)室與美國Idaho公司于2003年共同合作開發(fā)出來的最初應(yīng)用于SNP(single

2、nucleotide polymorphism, 單核苷酸多態(tài)性)檢測分析的一項(xiàng)新技術(shù)，并于2006成功生產(chǎn)出世界上第一臺(tái)商品化的HRM儀器HR-11,2。HRM 技術(shù)因其速度快，操作簡便，高通量，靈敏性、特異性高，對(duì)樣品無污染等優(yōu)點(diǎn)而被迅速的應(yīng)用在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域的研究工作中。2.HRM的原理及操作流程2.1HRM的原理HRM技術(shù)主要是根據(jù)核酸分子熔解溫度和熔解形狀的不同來區(qū)分樣品。在PCR反應(yīng)時(shí)引入飽和的熒光染料LCGreenplus，熒光染料在PCR擴(kuò)增的過程中被嵌入到DNA雙鏈中。當(dāng)嵌有染料的DNA分子解鏈的時(shí)候，儀器對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行采集，繪制出DNA分子的熔解曲線。D

3、NA分子的熔解曲線與DNA分子的GC含量，GC分布，片段長度等理化性質(zhì)有關(guān)，不同的樣品由于堿基作用力的不同呈現(xiàn)出不同的熔解曲線形狀及熔解溫度(Tm值)3。以二倍體細(xì)胞為例，當(dāng)純合子樣品通過PCR擴(kuò)增，經(jīng)過變性復(fù)性后，仍然是純合子，如圖1（Tube1和Tube2）。而雜合子PCR擴(kuò)增完，經(jīng)過變性復(fù)性后，樣品中會(huì)形成部分的含有非沃森-克里克配對(duì)的雙鏈分子存在，如圖1（Tube3）。Tube 1Tube 2Tube 3Wild typeHomozygoteHeterozygote圖1 LightScanner突變檢測原理雜合子樣品相對(duì)純合子樣品來說，雙鏈不夠穩(wěn)定，表現(xiàn)在解鏈溫度上就會(huì)有微小的差別。如

4、果采用高分辨率的儀器進(jìn)行檢測，并用專門的軟件進(jìn)行分析，微小的差別就會(huì)被檢測出來，從而成功的篩選出純合子與雜合子，如圖2。圖2 雜合子樣品的熔解曲線為四種不同雙鏈的熔解曲線的疊加的結(jié)果在雙鏈體的溶解曲線檢測時(shí)需要添加合適的染料，常規(guī)Real-timePCR利用SYBRGreen染料標(biāo)記DNA雙鏈,但是SYBRGreen是一種大分子即不飽和染料,在DNA雙鏈解鏈的過程中，SYBRGreen分子會(huì)發(fā)生重排，從已解鏈DNA片段上脫離下來的染料分子又與尚未解鏈的雙鏈DNA結(jié)合，造成結(jié)果失真，并且嵌合到產(chǎn)物中的染料如果在擴(kuò)增過程中不能及時(shí)脫落，還會(huì)抑制PCR反應(yīng)4。HRM采用新型的飽和染料如LCGreen

5、,不僅沒有飽和染料的缺點(diǎn),而且更易于檢測單堿基突變、小片段插入或缺失5,6,如圖3。圖3非飽和染料SybrGreen在DNA雙鏈熔解時(shí)會(huì)發(fā)生位置的遷移，飽和染料LCGreen在DNA雙鏈熔解時(shí)則直接從雙鏈上脫落下來2.2HRM的操作流程HRM的操作流程如下：（1）添加熒光染料進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域；（2）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行熱變性，采集數(shù)據(jù)；（3）通過專業(yè)數(shù)據(jù)分析軟件分析，獲取樣品的SNP信息7。目前，研究突變以及SNP的研究方法主要有DHPLC、SSCP、DGCE、MS、測序等，所有這些方法都需要樣品通過凝膠或者其他基質(zhì)來分離，其中一些方法還需要額外的酶處理或者化學(xué)處理，在這些步驟中PCR

6、產(chǎn)物直接暴露在環(huán)境當(dāng)中，都會(huì)增加在后續(xù)處理中受污染的風(fēng)險(xiǎn)。在用HRM方法進(jìn)行分析時(shí),樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后直接進(jìn)行HRM,PCR產(chǎn)物無需再轉(zhuǎn)入其他分析裝置,而直接在同一個(gè)PCR管內(nèi)進(jìn)行分析,實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作，如圖4。圖4進(jìn)行突變掃描的幾種常用方法的流程圖比較3.HRM在水產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用3.1基因突變掃描與基因分型高分辨率熔解曲線分析在封閉的體系中進(jìn)行,不僅降低了污染風(fēng)險(xiǎn)、節(jié)省了時(shí)間,而且PCR后不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理與分離，可以不受堿基突變位點(diǎn)和種類的局限，既可以對(duì)已知突變進(jìn)行分析，又可以對(duì)未知突變進(jìn)行篩查、掃描。另外，HRM分析是目前僅次于SNP芯片的中高通量SNP分型技術(shù)8。YuHai

7、yang等9首先用測序法研究東方牡蠣絲氨酸蛋白酶抑制基因的多態(tài)性及其抗病性關(guān)聯(lián)，在cvSl-1基因的273aabp編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了12個(gè)SNPs，同時(shí)用高分辨率熔解曲線分析了東方牡蠣一個(gè)家系的cvSl-1基因的SNP198，表現(xiàn)為明顯分離的三種基因型，發(fā)現(xiàn)抗病系的C等位基因的頻率明顯比敏感系的高。SmithBL.等10用小片段+內(nèi)標(biāo)探針和未標(biāo)記探針，對(duì)箭魚（Xiphiasgladius）種群的乳酸脫氫酶（ldh-A），肌球蛋白輕鏈-2（mlc-2），酸性核糖體磷蛋白P0（ARP）和鈣調(diào)蛋白（CaM）中的核基因進(jìn)行基因分型。結(jié)果表明，HRM是一個(gè)研究野生種群基因分型的強(qiáng)大工具。3.2品種鑒定HRM可

8、以應(yīng)用于微生物品種、物種快速鑒定以及動(dòng)植物品種鑒定。McGlauflinMT.等11利用高分辨率熔解曲線（HRM）發(fā)現(xiàn)了11個(gè)新的鑒別虹鱒和切喉鱒的SNPs。發(fā)現(xiàn)HRM能準(zhǔn)確地識(shí)別DNA序列的核苷酸變化。4.HRM的缺陷A. 對(duì)PCR反應(yīng)、熔解儀器、熒光染料要求較高由于雙鏈DNA的熔解動(dòng)力學(xué)受到很多因素的影響,比如DNA模板質(zhì)量、鎂離子含量、緩沖液組成等,所以HRM要求DNA樣品由同一種方法提取,經(jīng)純化使DNA樣品濃度一致。對(duì)引物及擴(kuò)增片段要求高,常需反復(fù)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證是否適用于HRM。熔解儀器要求非常高的溫度精密度和溫度均一性。熒光染料不影響PCR反應(yīng)且能飽和結(jié)合雙鏈DNA。B. 突變掃描不能精

9、確區(qū)分?jǐn)U增片段中的不同雜合突變有時(shí)不同的雜合突變導(dǎo)致相似的熔解曲線,需進(jìn)一步經(jīng)混樣法區(qū)分,或小片段法、非標(biāo)記探針法、Snapback探針法進(jìn)行基因分型提高分辨率。C. HRM對(duì)于大片斷插入或缺失不敏感此時(shí)需采用定量PCR先評(píng)估基因含量。D. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度受到限制隨著擴(kuò)增片段的增加,其敏感性及特異性降低。5.展望高分辨率熔解曲線在基因分型、突變掃描與序列匹配研究中非常簡便,近幾年來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展迅速。飽和熒光染料的普及、未標(biāo)記探針與實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)合,使得該技術(shù)無論在速度、靈敏度、準(zhǔn)確性,還是在經(jīng)濟(jì)上都很符合檢測要求。高分辨率熔解曲線技術(shù)不僅將在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,還會(huì)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物

10、基因檢測、植物病理、微生物分型和食品安全檢測等方面。相信將來也會(huì)廣泛地應(yīng)用到水產(chǎn)領(lǐng)域中。參考文獻(xiàn)1 Gundry C N, Vandersteen J G, Reed G H, et al. Amplicon meltinganalysis with labeled primers: a closedtube method fordifferentiating homozygotes and heterozygotesJ.Clin Chem,2003,49(3):396-406.2 Wittwer C T, Reed G H, Gundry C N, et al. High resolutio

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