正向間接血凝試驗(yàn)

1、正向間接血凝試驗(yàn)正向間接血凝試驗(yàn)省疫控中心周迎春主要內(nèi)容主要內(nèi)容l背景背景l(fā)原理原理l實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化l試劑的優(yōu)化試劑的優(yōu)化l樣品的優(yōu)化樣品的優(yōu)化l實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化l判定標(biāo)準(zhǔn)判定標(biāo)準(zhǔn)l注意問題注意問題一、背景一、背景l(fā)正向間接血凝試驗(yàn)正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)是上世紀(jì)是上世紀(jì) 60 年代在我年代在我國發(fā)展起來的血清學(xué)診斷技術(shù)，是一種用已知國發(fā)展起來的血清學(xué)診斷技術(shù)，是一種用已知抗原檢測未知抗體的試驗(yàn)方法，它的操作方法抗原檢測未知抗體的試驗(yàn)方法，它的操作方法相對簡單，實(shí)驗(yàn)原理也易于理解，在基層實(shí)驗(yàn)相對簡單，實(shí)驗(yàn)原理也易于理解，在基層實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)相對落后的情況下經(jīng)常被應(yīng)用到，

2、條件和技術(shù)相對落后的情況下經(jīng)常被應(yīng)用到，在一些動物疫病的免疫抗體檢測、疫病診斷上在一些動物疫病的免疫抗體檢測、疫病診斷上具有現(xiàn)實(shí)意義。具有現(xiàn)實(shí)意義。l林琳等研究表明應(yīng)用豬瘟正向間接血凝法林琳等研究表明應(yīng)用豬瘟正向間接血凝法(IHA)與斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（與斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（dot- ELISA）以及）以及豬瘟抗體免凝金標(biāo)試紙條比較，對規(guī)模化養(yǎng)豬豬瘟抗體免凝金標(biāo)試紙條比較，對規(guī)?；B(yǎng)豬場場 138份不同階段豬血清進(jìn)行檢測，三種方法份不同階段豬血清進(jìn)行檢測，三種方法檢測抗體的陽性率結(jié)果接近。檢測抗體的陽性率結(jié)果接近。一、背景一、背景l(fā)數(shù)十年來正向間接血凝試驗(yàn)技術(shù)不斷完善，它數(shù)十年來正向間接血

3、凝試驗(yàn)技術(shù)不斷完善，它具有簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、實(shí)用的特點(diǎn)，在我國具有簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、實(shí)用的特點(diǎn)，在我國有很大的用戶群，近年來，蘭州獸醫(yī)研究所生有很大的用戶群，近年來，蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的液體豬瘟和口蹄疫正向間接血凝試驗(yàn)的試產(chǎn)的液體豬瘟和口蹄疫正向間接血凝試驗(yàn)的試劑用量在逐年加大。然而，正向間接血凝作為劑用量在逐年加大。然而，正向間接血凝作為一種微量的定量反應(yīng)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受操作技一種微量的定量反應(yīng)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果受操作技術(shù)影響較大，任何操作環(huán)節(jié)的紕漏都會使最后術(shù)影響較大，任何操作環(huán)節(jié)的紕漏都會使最后判定的結(jié)果與正確結(jié)論大相徑庭。判定的結(jié)果與正確結(jié)論大相徑庭。l為規(guī)范操作，本次培訓(xùn)就實(shí)驗(yàn)中器材、試

4、劑、為規(guī)范操作，本次培訓(xùn)就實(shí)驗(yàn)中器材、試劑、樣品、過程和判定標(biāo)準(zhǔn)等方面的優(yōu)化做一綜述，樣品、過程和判定標(biāo)準(zhǔn)等方面的優(yōu)化做一綜述，以期作為此實(shí)驗(yàn)的借鑒。以期作為此實(shí)驗(yàn)的借鑒。 二、原理二、原理l正向間接血凝試驗(yàn)的原理是將可溶性抗原正向間接血凝試驗(yàn)的原理是將可溶性抗原吸附于與免疫無關(guān)的載體（紅細(xì)胞）表面，吸附于與免疫無關(guān)的載體（紅細(xì)胞）表面，此吸附抗原的紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體結(jié)合，此吸附抗原的紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在有電解質(zhì)存在的適宜條件下發(fā)生的肉眼在有電解質(zhì)存在的適宜條件下發(fā)生的肉眼可見的凝集性反應(yīng)?？梢姷哪苑磻?yīng)。二、原理二、原理l充分理解正向間接血凝試驗(yàn)的原理，對整充分理解正向間接血凝試驗(yàn)的

5、原理，對整個試驗(yàn)的操作和結(jié)果判定都具有很大的指個試驗(yàn)的操作和結(jié)果判定都具有很大的指導(dǎo)意義。導(dǎo)意義。 http:/ http:/ 或者一次性或者一次性的的110底角的底角的 96 孔孔 V 型微量血凝板。有機(jī)玻型微量血凝板。有機(jī)玻璃板板可以疊放，不占實(shí)驗(yàn)室臺面，處理樣品璃板板可以疊放，不占實(shí)驗(yàn)室臺面，處理樣品量較大時(shí)合適，但每次用完需要清洗。清洗方量較大時(shí)合適，但每次用完需要清洗。清洗方法：一般先用清水浸泡，然后馬上用高壓清水法：一般先用清水浸泡，然后馬上用高壓清水沖洗，洗凈后用手甩干板子倒置于沖洗，洗凈后用手甩干板子倒置于37溫箱中溫箱中烘干。用前要先檢查血凝板孔底是否干凈，如烘干。用前要先檢

6、查血凝板孔底是否干凈，如發(fā)現(xiàn)有透光性差一點(diǎn)的孔，可用酒精棉簽擦凈。發(fā)現(xiàn)有透光性差一點(diǎn)的孔，可用酒精棉簽擦凈。除了有機(jī)玻璃板以外，還有一次性血凝板，不除了有機(jī)玻璃板以外，還有一次性血凝板，不需清洗，也不用擔(dān)心板子不干凈影響結(jié)果，但需清洗，也不用擔(dān)心板子不干凈影響結(jié)果，但不能疊放，測定少量樣品適合。不能疊放，測定少量樣品適合。三、實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化三、實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化l2、 微量振蕩器微量振蕩器l使用振蕩器振蕩時(shí)間不宜超過使用振蕩器振蕩時(shí)間不宜超過 10 秒鐘，秒鐘，振蕩強(qiáng)度不能太大，先從小到大，中等強(qiáng)振蕩強(qiáng)度不能太大，先從小到大，中等強(qiáng)度即可。多塊板疊加后振蕩時(shí)要用手壓住度即可。多塊板疊加后振蕩時(shí)要用

7、手壓住最上一板，以防上下的振動造成孔中液體最上一板，以防上下的振動造成孔中液體濺出而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果實(shí)驗(yàn)濺出而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果實(shí)驗(yàn)室沒有它，也可用手輕拍血凝板的邊緣即室沒有它，也可用手輕拍血凝板的邊緣即可。可。三、實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化三、實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化l3 、單、多道微量移液器、單、多道微量移液器l建議使用高質(zhì)量的移液器，用定量移液器需要建議使用高質(zhì)量的移液器，用定量移液器需要準(zhǔn)備準(zhǔn)備 50 微升和微升和 25 微升兩種。微升兩種。50 微升的用來微升的用來加稀釋液和稀釋血清，加稀釋液和稀釋血清，25 微升的用來加血凝抗微升的用來加血凝抗原。可調(diào)的移液器要選擇與檢測過程中加樣量原

8、。可調(diào)的移液器要選擇與檢測過程中加樣量相近量程的移液器，吸取液體時(shí)動作要輕緩，相近量程的移液器，吸取液體時(shí)動作要輕緩，防止溶液吸入過快，沖入移液器污染柱塞或造防止溶液吸入過快，沖入移液器污染柱塞或造成堵塞漏氣。一定要養(yǎng)成移液器用完后放在移成堵塞漏氣。一定要養(yǎng)成移液器用完后放在移液器架上的習(xí)慣，移液器如果掉到地下很容易液器架上的習(xí)慣，移液器如果掉到地下很容易損壞。用完后移液器用損壞。用完后移液器用 75%的酒精棉擦拭，并的酒精棉擦拭，并把刻度調(diào)到最大值。把刻度調(diào)到最大值。三、實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化三、實(shí)驗(yàn)器材的優(yōu)化l4、 吸嘴吸嘴l高質(zhì)量的吸嘴經(jīng)過處理后可以重復(fù)使用。處理高質(zhì)量的吸嘴經(jīng)過處理后可以重復(fù)使

9、用。處理方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂方法：吸嘴用完后浸泡在清水里，先用清水漂洗，用超聲波清洗器處理洗，用超聲波清洗器處理10分鐘，換水后用二分鐘，換水后用二層紗布包好，用洗衣機(jī)甩干，再用超聲波清洗層紗布包好，用洗衣機(jī)甩干，再用超聲波清洗器處理器處理 10 分鐘，再用洗衣機(jī)甩干，高壓消毒滅分鐘，再用洗衣機(jī)甩干，高壓消毒滅菌器中菌器中 121，20分鐘即可，去蓋放分鐘即可，去蓋放 37溫箱溫箱中烘干。吸嘴用完后沒有用清水浸泡的很難洗中烘干。吸嘴用完后沒有用清水浸泡的很難洗干凈，不必重復(fù)使用。接觸過高感染性材料的干凈，不必重復(fù)使用。接觸過高感染性材料的吸嘴要高溫消毒后廢棄。經(jīng)過處理后的吸

10、嘴如吸嘴要高溫消毒后廢棄。經(jīng)過處理后的吸嘴如果尖頭變彎，則質(zhì)量不好，不要重復(fù)使用。果尖頭變彎，則質(zhì)量不好，不要重復(fù)使用。四、試劑的優(yōu)化四、試劑的優(yōu)化l1、 抗原抗原l液體正向血凝抗原搖勻后呈咖啡色，無塊狀物液體正向血凝抗原搖勻后呈咖啡色，無塊狀物沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很沉淀，靜置后血球逐漸沉入瓶底。搖勻后能很快形成均勻混懸液的是好抗原，搖勻后仍有小快形成均勻混懸液的是好抗原，搖勻后仍有小塊黑色沉淀物（血球團(tuán)）的抗原建議不要使用。塊黑色沉淀物（血球團(tuán)）的抗原建議不要使用。如果只做篩檢看是否達(dá)到合格線，一瓶抗原可如果只做篩檢看是否達(dá)到合格線，一瓶抗原可以檢測以檢測 30 到到 50

11、 份血清。值得一提的是液體正份血清。值得一提的是液體正向血凝抗原向血凝抗原 48保存，保存期保存，保存期3個月，不能冷個月，不能冷凍保存。凍保存。四、試劑的優(yōu)化四、試劑的優(yōu)化l2、對照血清、對照血清l陰性對照血清呈淡黃色清亮液體，陽性對照血陰性對照血清呈淡黃色清亮液體，陽性對照血清微紅或淡黃色略微混濁的液體。陰陽性對照清微紅或淡黃色略微混濁的液體。陰陽性對照血清可在血清可在- 15到到 - 20保存，有效期保存，有效期 1 年。年。l3 、稀釋液、稀釋液l稀釋液無色透明，一般情況稀釋液無色透明，一般情況 48保存。用前保存。用前建議將稀釋液放建議將稀釋液放 室溫或室溫或37溫箱中半小時(shí)后搖溫箱

12、中半小時(shí)后搖勻再用較好。試劑不能放置太久，最好新進(jìn)現(xiàn)勻再用較好。試劑不能放置太久，最好新進(jìn)現(xiàn)用。用。五、樣品血清的優(yōu)化五、樣品血清的優(yōu)化l新分離血清盡快檢測完，未檢血清新分離血清盡快檢測完，未檢血清 - 20保存。冷凍血清待檢時(shí)需融化，同時(shí)避免保存。冷凍血清待檢時(shí)需融化，同時(shí)避免血清反復(fù)凍融影響檢測結(jié)果。嚴(yán)重溶血、血清反復(fù)凍融影響檢測結(jié)果。嚴(yán)重溶血、嚴(yán)重污染、腐敗或有懸浮雜質(zhì)的血清樣品嚴(yán)重污染、腐敗或有懸浮雜質(zhì)的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)。不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)。六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化l正向血凝實(shí)驗(yàn)過程包括：加稀釋液，稀釋正向血凝實(shí)驗(yàn)過程包括：加稀釋液，稀釋待檢血

13、清，稀釋陰性、陽性血清，加血凝待檢血清，稀釋陰性、陽性血清，加血凝抗原，震蕩靜置，結(jié)果判定。在試驗(yàn)中要抗原，震蕩靜置，結(jié)果判定。在試驗(yàn)中要注意以下的問題：注意以下的問題：l1、加稀釋液、加稀釋液l在血凝板上在血凝板上16 排的排的 19 孔；第孔；第 7 排的排的 14孔，第孔，第6-7孔；第孔；第 8 排的排的 112 孔各加孔各加稀釋液稀釋液 50 微升。微升。六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化l2、稀釋待檢血清、稀釋待檢血清l取取1號待檢血清號待檢血清 50 微升加入第微升加入第 1 排第排第 1 孔，并孔，并將槍頭插入孔底，混勻后，從該孔吸取將槍頭插入孔底，混勻后，從該孔吸取 50 微升

14、微升移入第移入第 2 孔，混勻后從該孔吸取孔，混勻后從該孔吸取 50 微升移入微升移入第第 3 孔直至第孔直至第 9 孔。此時(shí)第孔。此時(shí)第 1 排排 19 孔待檢血孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)）清的稀釋度（稀釋倍數(shù)） 依次為依次為 1 2、1 4、1 81 256、1 512。每個待檢血清樣品。每個待檢血清樣品均按上述方法稀釋，每稀釋一份血清要換吸嘴。均按上述方法稀釋，每稀釋一份血清要換吸嘴。每次滴加樣本后應(yīng)吸取稀釋液并沖洗幾次，最每次滴加樣本后應(yīng)吸取稀釋液并沖洗幾次，最后將滴頭內(nèi)的殘液完全排盡，以盡可能的保證后將滴頭內(nèi)的殘液完全排盡，以盡可能的保證樣品被全部加入反應(yīng)孔。作倍比稀釋前，應(yīng)且樣品

15、被全部加入反應(yīng)孔。作倍比稀釋前，應(yīng)且記將滴頭內(nèi)的空氣排盡，避免稀釋時(shí)孔內(nèi)產(chǎn)生記將滴頭內(nèi)的空氣排盡，避免稀釋時(shí)孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡，直接影響結(jié)果判定。氣泡，直接影響結(jié)果判定。六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化l3、稀釋陰性對照血清、稀釋陰性對照血清l在血凝板上的第在血凝板上的第 7 排第排第 1 孔加陰性血清孔加陰性血清 50 微升，對倍稀釋至第微升，對倍稀釋至第4 孔。此時(shí)陰性孔。此時(shí)陰性血清的稀釋倍數(shù)依次為血清的稀釋倍數(shù)依次為 1 2、1 4、1 8、1 16。第。第 6-7孔為稀釋液對照孔。孔為稀釋液對照孔。六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化l4、稀釋陽性對照血清、稀釋陽性對照血清l在血凝板上的第在血

16、凝板上的第 8 排第排第 1 孔加陽性血清孔加陽性血清 50 微升，對倍稀釋至第微升，對倍稀釋至第 12 孔。此時(shí)陽性孔。此時(shí)陽性血清的稀釋倍數(shù)依次為血清的稀釋倍數(shù)依次為 1 2、1 4、1 81 2048、1 4096。l每次試驗(yàn)要做陰陽性對照，最好也做二孔每次試驗(yàn)要做陰陽性對照，最好也做二孔空白對照，即孔中加空白對照，即孔中加 50 微升稀釋液后加微升稀釋液后加25 微升抗原。每次檢測時(shí)陰性、陽性和微升抗原。每次檢測時(shí)陰性、陽性和稀釋液對照只需各做一份。稀釋液對照只需各做一份。六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化l5、加血凝抗原、加血凝抗原l被檢血清各孔、陰性對照各孔、陽性對照被檢血清各孔、陰

17、性對照各孔、陽性對照各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原各孔、稀釋液對照孔均各加血凝抗原 25 微升。血凝抗原用前要充分搖勻，瓶底應(yīng)微升。血凝抗原用前要充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉淀。一次實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)選擇同一批無血球沉淀。一次實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)選擇同一批號的抗原，并先從稀釋度高的孔加起，避號的抗原，并先從稀釋度高的孔加起，避免滴頭和孔內(nèi)的液體直接接觸。免滴頭和孔內(nèi)的液體直接接觸。 六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化六、實(shí)驗(yàn)過程優(yōu)化l6、振蕩混勻、振蕩混勻l將血凝板置于微量振蕩器上振蕩將血凝板置于微量振蕩器上振蕩 10 秒鐘，秒鐘，如無振蕩器，用手輕輕搖勻即可。然后將如無振蕩器，用手輕輕搖勻即可。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血

18、球是否混血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，以沒有血球沉淀為合格。蓋上玻板，勻，以沒有血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下或室溫下或 37下靜置下靜置 2 小時(shí)，判定結(jié)果，小時(shí)，判定結(jié)果，也可將板置冰箱中冷藏延至次日判定。也可將板置冰箱中冷藏延至次日判定。七、判定標(biāo)準(zhǔn)七、判定標(biāo)準(zhǔn)l將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清將血凝板放在白紙上，先觀察陰性對照血清1 16孔孔和稀釋液對照孔，均應(yīng)無凝集（血球全部沉于孔底和稀釋液對照孔，均應(yīng)無凝集（血球全部沉于孔底形成邊緣整齊的小圓點(diǎn)），或僅出現(xiàn)形成邊緣整齊的小圓點(diǎn)），或僅出現(xiàn)“+”凝集（血凝集（血球大部分沉于孔底，邊緣稍有少量血球凝集）。陽球大部分沉于

19、孔底，邊緣稍有少量血球凝集）。陽性對照血清性對照血清 1 2 到到 1 256 各孔（各孔（18 孔）應(yīng)出現(xiàn)孔）應(yīng)出現(xiàn)“+”到到“+”凝集為合格（少量血球沉于孔底，凝集為合格（少量血球沉于孔底，大部分血球凝集）。如圖大部分血球凝集）。如圖 1 所示，該陽性血清滴度所示，該陽性血清滴度為為1 512 倍或記為倍或記為 9log2。七、判定標(biāo)準(zhǔn)七、判定標(biāo)準(zhǔn)l在對照孔合格的前提下，觀察待檢血清各在對照孔合格的前提下，觀察待檢血清各孔，以呈現(xiàn)孔，以呈現(xiàn)“+” 凝集的最大稀釋倍數(shù)為凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。因此正確識別該份血清的抗體效價(jià)。因此正確識別“+”的凝集現(xiàn)象是最后結(jié)果判定的先決的凝

20、集現(xiàn)象是最后結(jié)果判定的先決條件。一般的判定方法是將血凝板放在白條件。一般的判定方法是將血凝板放在白紙上，在各對照孔符合要求的前提下，從紙上，在各對照孔符合要求的前提下，從開始出現(xiàn)沉淀的孔觀察起，至血球全部沉開始出現(xiàn)沉淀的孔觀察起，至血球全部沉淀孔，綜觀這幾孔，前后對比血球凝集和淀孔，綜觀這幾孔，前后對比血球凝集和沉淀的發(fā)展情況，以沉淀的發(fā)展情況，以1/2血球沉淀孔的血血球沉淀孔的血清稀釋倍數(shù)為該份血清的效價(jià)。清稀釋倍數(shù)為該份血清的效價(jià)。 七、判定標(biāo)準(zhǔn)七、判定標(biāo)準(zhǔn)附：血凝試驗(yàn)強(qiáng)度附：血凝試驗(yàn)強(qiáng)度七、判定標(biāo)準(zhǔn)七、判定標(biāo)準(zhǔn)l例如例如 1 號待檢血清號待檢血清15孔呈現(xiàn)孔呈現(xiàn)“+”到到“+”凝集，凝集，67 孔呈現(xiàn)孔呈現(xiàn)“+”凝集，凝集，第第8孔呈現(xiàn)孔呈現(xiàn)“+”凝集，第凝集，第 9 孔不凝集，那孔不凝集，那么就可判定該份血清的抗體效價(jià)為么就可判定該