抗菌肽cecropin-Xm在大腸埃希菌中的串聯(lián)表達(dá)與抑瘤作用

1、抗菌肽cecropin-Xm在大腸埃希菌中的串聯(lián)表達(dá)與抑瘤作用                     作者：沈益 勞學(xué)剛 耿偉 張洪祖 徐賢秀【摘要】   在TNF基因3端連接抗菌肽cecropin-Xm基因多拷貝串聯(lián)體，與溫度誘導(dǎo)的表達(dá)載體pRCs組成表達(dá)載體pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)，并在大腸埃希菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白TNF-(

2、cecropin-Xm)n(n=1，2，3)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在同樣表達(dá)條件下 應(yīng)用 BL21(DE3)/pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2表達(dá)系統(tǒng)可獲得比BL21(DE3)/pRCs-TNF-cecropin-Xm系統(tǒng)多出一倍的目的物cecropin-Xm。融合蛋白經(jīng)CNBr切割后用CM52纖維素柱分離純化得到純度大于95%的具有抑菌活性的抗菌肽cecropin-Xm，體外MTT抑瘤實(shí)驗(yàn)表明cecropin-Xm具有廣譜殺滅腫瘤細(xì)胞的作用并且對正常細(xì)胞影響極小。 【關(guān)鍵詞】   抗菌肽； Cecropin-Xm； 基因串聯(lián)； 抑瘤作用  &

3、#160;  抗菌肽cecropins是瑞典 科學(xué) 家Boman于1980年首先從惜古比天蠶中發(fā)現(xiàn)的1，后來在其它蠶類、昆蟲和哺乳動物2，3中發(fā)現(xiàn)了各種類型的抗菌肽，其中包括多種cecropin類的抗菌肽。抗菌肽cecropins一般由3339個氨基酸組成，具有高度的同源性，對革蘭陽性菌和陰性菌都有殺傷力，對正常真核細(xì)胞沒有影響4。有實(shí)驗(yàn)表明，抗菌肽的作用對象和作用機(jī)制各異，其中某些抗菌肽可以通過引起腫瘤細(xì)胞凋亡5和激活經(jīng)典的補(bǔ)體途徑等來殺傷腫瘤細(xì)胞6。    為了更好的研究cecropin類的抗菌肽，本實(shí)驗(yàn)室參照抗菌肽CMIV7的氨基酸序列，用化學(xué)方法

4、合成了編碼抗菌肽CMIV突變體cecropin-X的cDNA8，并在大腸埃希菌中進(jìn)行表達(dá)研究9。為了獲得易于后期純化且穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，在pRC系統(tǒng)10中完成了抗菌肽cecropin-X基因與TNF(天然型腫瘤壞死因子)的融合表達(dá)11。為了從源頭上提高抗菌肽的產(chǎn)量，首先利用PCR方法在cecropin-X基因末端加入了甲硫氨酸的密碼子， 得到了cecropin-Xm基因； 再將cecropin-Xm基因串聯(lián)在TNF基因的3-端。在此基礎(chǔ)上，完成了TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的串聯(lián)表達(dá)，純化得到了與cecropin-X具有同樣抑菌活力的高純度的cecropin-Xm。在體

5、外實(shí)驗(yàn)中，cecropin-Xm對多種人源腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用。    1  材料和方法    1.1  材料    1.2  方法    (1)取質(zhì)粒pRC用EcoRI和PstI酶切后回收；(2)合成互補(bǔ)的寡核苷酸鏈  5-AATTCGTCGACGGATCCCTGCA-3和5-GGGATCCGTCGACG-3，加入T4 DNA連接緩沖液，85加熱5min后 自然 冷卻至室溫；(3)將(1)和(2)的產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化入E.coli

6、 TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB(含氨芐西林100g/ml，如無特殊說明以下同)平板，30培養(yǎng)過夜；(4)對隨機(jī)挑選的5個克隆進(jìn)行測序鑒定。    (1)取本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的質(zhì)粒pRC-TNF-(cecropin-X)11，用EcoRI、SalI酶切并回收TNF片段；(2)質(zhì)粒pRC-TNF-(cecropin-X)為模板，寡核苷酸鏈，5-CGGTCGACATGAGATGGAAAATC-3為5端引物，分別以寡核苷酸鏈，5-CCGGATCCACTACATGTTGATGGTAGCAGC-3和，5-CGGTCGACCATGTTGATGGTAGCAGC-3為3端引物，利用P

7、CR擴(kuò)增11獲得末端加入甲硫氨酸密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)的cecropin-Xm基因片段Xm-a，以及末端僅含甲硫氨酸密碼子(ATG)的cecropin-Xm基因片段Xm-b，回收相應(yīng)片段；(3)分別用EcoRI和BamHI酶切質(zhì)粒pRCs；SalI和BamHI酶切Xm-a；SalI酶切Xm-b，回收pRCs、Xm-a和Xm-b；(4)將上述(1)和(3)產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB平板，30培養(yǎng)過夜；(5)挑選單克隆后提取質(zhì)粒，用EcoRI和PstI酶切后行1%瓊脂糖電泳檢查。將有特異性片段的克隆進(jìn)行測序鑒定。  &

8、#160; 細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A均數(shù)   對照組A均數(shù))×100%    2  結(jié)果    2.1  抗菌肽cecropin-Xm基因與表達(dá)載體pRCs的獲得及重組質(zhì)粒pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的構(gòu)建    (1)將質(zhì)粒pRC-TNF-(cecropin-X)11用EcoRI、SalI完全酶切，回收TNF片段(490bp)，即得到含起始密碼子但不含終止密碼子的兩端分別帶EcoRI、SalI酶切位點(diǎn)的TN

9、F片段。將此片段與上述得到的載體pRCs(經(jīng)EcoRI、SalI酶切后回收)連接即得到質(zhì)粒pRCs-TNF(3945bp)。    2.2  重組蛋白的表達(dá)    含不同cecropin-X基因數(shù)的重組質(zhì)粒pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的大腸埃希菌經(jīng)溫度誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測結(jié)果(Fig.3)表明，當(dāng)n    pRC-T-X: pRC-TNF-cecropin-X;  pRCs-T: pRCs-TNF;    pR

10、Cs-T-Xm2: pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2    Fig.1    Construction of pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2    M: SE Perfect 100bp DNA ladder;  0: pRCs;    13: pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)    Fig.2    Electrophoresis of pRC

11、s and pRCs-TNF-    (cecropin Xm)n (n=1,2,3) cleaved with    restriction enzymes EcoRI 和PstI    值為1，2，3時，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白的分子量相應(yīng)為21000、26000和31000ku左右(Fig.3中分別用黑色箭頭表示)，F(xiàn)ig.3結(jié)果顯示含有2個cecropin-Xm基因的重組質(zhì)粒融合蛋白表達(dá)量比只有單個基因的略高，但含有3個cecropin-Xm基因的重組質(zhì)粒融合蛋白表達(dá)量則明顯減少。  

12、;  2.3  Cecropin-Xm的純度鑒定和抑菌活性比較    46: BL21(DE3)/pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)    Fig.3    Expression of TNF-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)    in E.coli BL21(DE3)    3800ku，用RP-HPLC檢測純度可達(dá)95%以上。    2.4&#

13、160; Cecropin-Xm的抑瘤活性    Cecropin-Xm純化樣品檢測了對腫瘤細(xì)胞HepG2、QGY-7703、Hela、BGC-823、LOVO、U937、HL60和正常肝細(xì)胞HL-7702的IC50分別為100、6.30、10、160、15、10和>400gmol/L，結(jié)果表明cecropin-Xm對我們目前所研究的腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出不同程度的殺傷力，尤其對QGY-7703、BGC-823、U937和HL60細(xì)胞的活性作用更明顯，而對正常肝細(xì)胞HL-7702不敏感。這就為將cecropin-Xm開發(fā)成為一種安全有效的抗腫瘤藥物提供了初步的實(shí)驗(yàn)

14、。    3  討論    因?yàn)榭咕牟粌H殺菌還有抗病毒和抗腫瘤細(xì)胞而不破壞人體正常細(xì)胞等作用，因此正在 農(nóng)業(yè) 、畜牧業(yè)、醫(yī)藥及食品 工業(yè) 中顯示出越來越廣闊的 應(yīng)用 前景。通常研制和應(yīng)用的抗菌肽均是從昆蟲體液等天然物質(zhì)中提取，來源途徑廣泛，但含量極低，提取步驟繁雜，很難獲得大量高純度的抗菌肽。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們開始采用酵母體系及昆蟲或昆蟲細(xì)胞體系進(jìn)行基因表達(dá)。從工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，在基因工程表達(dá)體系中，具有成本低、周期短、表達(dá)水平高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)的大腸埃希菌最理想。因此，相關(guān)研究單位對在大腸埃希菌中表達(dá)

15、抗菌肽進(jìn)行了各種嘗試。本小組在完成了cecropin-X基因的克隆表達(dá)后，為了減少融合表達(dá)引起的目的蛋白的低含量，從源頭上提高目的蛋白的收率，采用了構(gòu)建多拷貝串聯(lián)體的方法，以期獲得更高表達(dá)量的目的蛋白。結(jié)果顯示只有2個cecropin-Xm基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒融合蛋白表達(dá)含量比只有單個cecropin-Xm基因的略高，含有3個cecropin-Xm基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒融合蛋白含量則明顯減少。我們還嘗試了4個cecropin-Xm基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒，但在SDS-PAGE檢測時基本無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)?？咕谋旧硭呢S富的正電荷可能是TNF-多個(cecropin-Xm)基因串聯(lián)(當(dāng)n3時)融合蛋

16、白低水平表達(dá)的主要原因13。Cecropin-Xm是帶高度正電荷的肽，在宿主中表達(dá)時，n值越大它和核酸的結(jié)合機(jī)會越大，抑制了轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終導(dǎo)致低水平表達(dá)。因此，進(jìn)一步的 工作 是尋找一種合適的方法消除這些正電荷的影響，如融合一段酸性肽使之以中性前體形式表達(dá)等。    為了保證純化過程中串聯(lián)體分離效率，我們?nèi)圆捎肅NBr切割，在串聯(lián)體間引入甲硫氨酸密碼子(ATG)。有 文獻(xiàn) 報道14，抗菌肽末端的甲硫氨酸經(jīng)CNBr作用后轉(zhuǎn)變成高絲氨酸(homoserine)，但不影響抗菌肽的生物活性。本實(shí)驗(yàn)證明cecropin-Xm與cecropin-X的抗大腸埃希菌E.coli

17、 K12D31活性基本相同。本研究結(jié)果還表明cecropin-Xm對多種人源腫瘤細(xì)胞有較明顯的不同程度的殺傷作用，但對正常人胚肝細(xì)胞影響極小，進(jìn)一步提示抗菌肽cecropin-Xm可能作為一種廣譜的低毒副作用的抗腫瘤藥物應(yīng)用于 臨床 ?！?參考 文獻(xiàn)】   1 St EI ner H, Hultmark D, Engstrom A, et al. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity J. Nature,1981,292:246.2 Boman H G. H

18、ultmark D Cell-free immunity in insects J. Annu Rev Microbiol,1987,41:103.3 Lee J Y, Boman I A, Sun C, et al. Antibacterial peptides from pig intestine: Isolation of a mammalian cecropin J. Proc Natl Acad Sci,1989,86:9159.4 Boman H G, Wade D, Boman I A, et al. Antibacterial and antimalarial properti

19、es of peptides that are cecropin-melittin hybrids J. FEBS Lett,1989,259:103.5 Gamen S, Hanson D A, Kaspar A, et al. Granulysin-induced apoptosis I. Involvement of at least two distinct pathways J. J Immunol,1998,161:1758.6 Chen J G, Xu X M, Underhill C B, et al. Tachyplesin activates the classic complement pathway to kill tumor cells J. Can Res,2005,65(11):4614.7 屈賢銘，吳克佐，邱雪貞，等. 經(jīng)聚肌胞苷酸誘導(dǎo)家蠶蛹血淋巴中六種抗菌肽的分離與鑒定J. 生物化學(xué)與生物物 理學(xué) 報，1986，18(3)：284.8 謝維，邱奇峰，陳江寧，等. 中國 家蠶抗菌肽CMIV基因的化學(xué)合成與克隆J. 南京大學(xué)學(xué)報( 自然 科學(xué) 版)，1996，32(3)：474.9 謝維，竇非，吳海宏，等. 抗菌肽CMIV突變體基因在E.coli中融合表達(dá)的研究J. 中國科學(xué)C輯，1997，27(3)：278.10 陳建軍，孫苗，陳常慶，等.