細(xì)菌形態(tài)檢查

1、實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌形態(tài)檢查【目的】掌握示教顯微鏡下所看到的細(xì)菌形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)。掌握細(xì)菌涂片制作，革蘭染色操作。掌握油鏡的使用和保護(hù)方法，以便嫻熟應(yīng)用油鏡觀察細(xì)菌形態(tài)或結(jié)構(gòu)。一、顯微鏡油鏡的使用和保護(hù)法(一)顯微鏡油鏡的識別(1)油鏡頭上都有標(biāo)記：標(biāo)有100×或90×；(2)有白、黑或紅色圓圈；(3)有“油”或HI、oil字。油鏡頭比其它接物鏡長，孔徑最小。(二)顯微鏡油鏡的使用使用顯微鏡油鏡時(shí)，勿使鏡臺傾斜，以免鏡油流出。在玻片標(biāo)本上加香柏油(鏡油)一滴，置載物臺上，使有標(biāo)本處對準(zhǔn)聚光器中央(如肉眼看不清標(biāo)本所在位置，應(yīng)先用低倍鏡觀察)，用移動器或用固定夾固定。眼睛從物鏡側(cè)面注視

2、，右手轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使載物臺上升，油鏡頭慢慢浸入油中，并幾乎與玻片接觸，但切勿壓及玻片，以防損壞油鏡頭。將聚光器升高，光圈開大，然后眼觀鏡筒內(nèi)，兩手轉(zhuǎn)動反光鏡采光，使視野內(nèi)光線明亮。若光源為燈光或陰天采自然光時(shí)，則使用凹面鏡。眼觀鏡筒內(nèi)，右手持粗調(diào)節(jié)器，緩慢下降載物臺，當(dāng)看到模糊物象時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)整看清物象。操作時(shí)嚴(yán)防油鏡頭與玻片相撞。(三)油鏡的保護(hù)顯微鏡是貴重精密儀器，使用時(shí)要精心保護(hù)，不得隨意拆散和碰撞。取送顯微鏡時(shí)，右手持鏡臂，左手托鏡座，平端于胸前，然后輕放于桌面上或柜箱內(nèi)。 油鏡用畢，載物臺下降，取出標(biāo)本片，用擦鏡紙將油鏡上的油擦凈，(用擦鏡紙蘸二甲苯擦試，再用擦鏡紙擦去二甲苯

3、)擦鏡時(shí)應(yīng)順其直徑方向擦，不要轉(zhuǎn)圈擦。不用時(shí)，將鏡頭轉(zhuǎn)離聚光器，油鏡頭朝前呈“八”字形，降下聚光器，對號放入鏡箱。標(biāo)本片按規(guī)定擦去鏡油，放入標(biāo)本盒，如該標(biāo)本片不再使用，則投入消毒缸內(nèi)。防止與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醚、氯仿、酒精等化學(xué)藥品接觸。(四)油鏡加油的原理由于細(xì)菌個(gè)體小，必須使用90×或100×的物鏡，以保證足夠的放大倍數(shù)，同時(shí)為保證足夠的亮度，必須滴加香柏油(因香柏油與玻璃的折光率相近似)，由聚光器出來的光線通過玻璃和鏡油，不發(fā)生折射，直接進(jìn)入鏡筒，光路見下圖所示。 油鏡加油的原理二、細(xì)菌不染色標(biāo)本檢查法【材料】變形桿菌、葡萄球菌(812h)肉湯培養(yǎng)物。凹玻片、載玻片、蓋玻

4、片、凡士林、接種環(huán)、酒精燈?！痉椒ā繅旱畏?取一張潔凈載玻片，用接種環(huán)取葡萄球菌和變形桿菌幼齡菌液各23環(huán)，分別置于玻片二端，加蓋玻片，先用低倍鏡對光，再用高倍鏡觀察細(xì)菌動力形態(tài)。由于不是染色標(biāo)本，光線宜暗，即降低聚光器，縮小光圈。懸滴法在凹玻片的凹窩周圍涂少許凡士林，用接種環(huán)取變形桿菌和葡萄球菌菌液，分別置于一蓋玻片中央，將凹窩對準(zhǔn)蓋玻片反扣在蓋玻片上，將二者壓緊后迅速反轉(zhuǎn)，使菌液懸于蓋玻片。靜置片刻后，先用低倍鏡，再換高倍鏡觀察。觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，適當(dāng)降低聚光器，縮小光圈，以利觀察。懸滴標(biāo)本的制作暗視野法取下顯微鏡上原有的明視野聚光器，換裝暗視野聚光器；取23環(huán)菌液置于載玻片上，加蓋玻片

5、(同壓滴法)；在暗視野聚光器上加鏡油；置標(biāo)本片于載物臺上，上升聚光器，使其上面的鏡油與載玻片接觸；轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線集中于聚光器上；用低倍鏡觀察，當(dāng)視野中有一圓形光環(huán)出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)動聚光器上的調(diào)節(jié)螺旋，將光環(huán)移至視野中央；換高倍鏡觀察，用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)清晰；若用油鏡觀察，則在蓋玻片上加鏡油?！窘Y(jié)果】 有鞭毛細(xì)菌運(yùn)動的特點(diǎn)是：有明顯的定向運(yùn)動，從一處泳至另一處（變形桿菌）。無鞭毛細(xì)菌運(yùn)動的特點(diǎn)是：呈原位的顫動，為環(huán)境中液體分子沖擊造成（葡萄球菌）。三、細(xì)菌的基本形態(tài)觀察（繪圖）注意細(xì)菌的大小(放大 倍)、形狀、排列、染色性。葡萄球菌 鏈球菌腦膜炎奈瑟菌大腸埃希菌 白喉棒狀桿菌炭疽芽胞梭菌霍亂弧菌幽門螺

6、桿菌四、細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)觀察（繪圖） 莢膜 芽胞 鞭毛 肺炎鏈球菌 破傷風(fēng)芽胞梭菌 傷寒沙門菌 （注意莢膜和菌體） （注意芽胞的形狀和位置） （注意鞭毛的位置、數(shù)量）五、細(xì)菌涂片的制作【目的】 細(xì)菌材料須涂布固定于玻片上，經(jīng)染色后才能觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)及染色反應(yīng)?！驹怼?細(xì)菌的化學(xué)成分以膠體原漿蛋白為主，涂布在玻片上經(jīng)火焰溫?zé)岷罂晒潭ㄓ诓Ｆ俳?jīng)染色沖洗即可被染上顏色，且不易被水沖洗掉?！静牧稀?葡萄球菌、大腸埃希菌培養(yǎng)物、玻片、生理鹽水、接種環(huán)、酒精燈、火柴、消毒缸。 【方法】 (1)涂片：于潔凈載玻片兩端各加一接種環(huán)生 葡萄球菌 大腸埃希菌 理鹽水； 以無菌操作法，分別將二種細(xì)菌涂布于鹽水中

7、。(如取肉湯培養(yǎng)物涂片，則載玻片上不必加生理鹽水)。干燥：讓所涂標(biāo)本自然干燥或于火焰高處烘干，但切 細(xì)菌涂片制作勿將涂膜烤焦。固定：將標(biāo)本通過火焰三次(涂有標(biāo)本的一面朝上)?！咀⒁馐马?xiàng)】玻片要潔凈無油，否則菌液不易涂開。不宜選用厚玻片，以免觀察時(shí)視野難以調(diào)清。 取菌量宜少，涂片要勻而薄。水洗時(shí)要以細(xì)流水徐緩沖洗，避免直接沖洗涂菌處，切勿將未經(jīng)火焰固定的標(biāo)本立即染色水洗。六、革蘭染色【材料】葡萄球菌、大腸埃希菌培養(yǎng)物。革蘭染色液：結(jié)晶紫、盧戈碘液、95乙醇、稀釋復(fù)紅。接種環(huán)、酒精燈、載玻片、強(qiáng)光燈、顯微鏡、香柏油(鏡油)及拭鏡紙等?！痉椒ā繉⒓?xì)菌標(biāo)本固定后，先用結(jié)晶紫（或龍膽紫）初染，再加碘液媒液，此時(shí)各種細(xì)菌均被染成深紫色。然后用95乙醇脫色，其中有的細(xì)菌脫去紫色，有的仍然保持紫色。最后用沙黃（或復(fù)紅）液復(fù)染。通過革蘭染色將細(xì)菌分成兩大類：不被乙醇脫色仍保留紫色者為革蘭陽性菌（G）；被乙醇脫色后再被復(fù)染成紅色者為革蘭陰性菌（G）。（1min） （1min） (約30秒) （30秒）結(jié)晶紫染液 水洗 盧戈碘液 水洗 95%乙醇 水洗 稀釋復(fù)紅 水洗 細(xì)菌涂片干燥 + 結(jié)晶柴 【注意事項(xiàng)】要掌握好染色時(shí)間，尤其是酒精脫色時(shí)間，不宜過長或過短，不可使染液干涸。選用適齡培養(yǎng)物，以1824小時(shí)為宜，否則影響染色效果。細(xì)菌染色標(biāo)本觀察后應(yīng)放入指